大腸桿菌基因組DNA的提取及熒光定量PCR試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、大腸桿菌基因組DNA的提取一、傳統(tǒng)法提取大腸桿菌基因組DNA。1、實(shí)驗(yàn)原理提取DNA的一般過(guò)程是將分散好的組織細(xì)胞在含十二烷基硫酸鈉（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。SDS的作用機(jī)理是由于其能結(jié)合蛋白，中和蛋白的電性，使蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵受到破壞，失去二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而變形失活，蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為光譜蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在的情況下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可通過(guò)失活蛋白破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白和DNA分離；而蛋白酶K可將蛋白

2、質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來(lái)。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，最后用無(wú)水乙醇沉淀DNA。為獲得高純度DNA，操作過(guò)程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定的程度（0.3 mol/L NaCl）時(shí)，從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB-核酸的復(fù)合物與蛋白，多糖物質(zhì)分開(kāi)。最后通過(guò)乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。2、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器1）實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌2）實(shí)驗(yàn)試劑：LB液體培養(yǎng)基，TE溶液，10%SDS，蛋

3、白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/異戊醇，異丙醇，70%乙醇3）實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫?fù)u床、低溫離心機(jī)、微量移液器、水浴鍋3、溶液配制1）LB液體培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)用膠化蛋白胨10 g/L，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5 g/L，NaCl 10g/L，去離子水。 (攪拌溶解后，用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.0.用去離子水定容100ml，用20/50ml搖瓶分裝5瓶，包扎好，在121，1.034×105 pa高壓下蒸汽滅菌20min.)2）TE緩沖液：1M Tris 溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加熱溶解）1M tris-HCl

4、 pH8.0 溶液（取 1M Tris 溶液160ml用分析純鹽酸調(diào)至Ph=8.0（需濃鹽酸約8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高壓滅菌備用） TE緩沖液（10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0，1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH =8.0 1ml向燒杯中加入約400mldd H2O均勻混合;將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌，室溫保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml無(wú)菌雙蒸水，-20備用）4）CTAB/NaCl溶液：（5% w/v，5gCTAB溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需

5、加熱到65使之溶解，然后室溫保存） 4、實(shí)驗(yàn)方法步驟1、將大腸桿菌接種到滅菌好的LB培養(yǎng)基中，一級(jí)培養(yǎng)過(guò)夜，以10%的接種量進(jìn)行二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（4-6h）。2、取菌液1.5ml置于離心管中，以5000rpm冷凍離心1min，棄上清液3、加190 ul TE懸浮沉淀，并加10 ul 10%SDS,搖勻直至溶液變粘稠4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混勻，37保溫1小時(shí)。5、加30ul 5 mol/L NaCl,混勻。6、加30ul CTAB/NaCl溶液，混勻，65保溫20min7、加入300ul酚/氯仿/異戊醇抽提（25：24:1），5000rmp離心10min8、取上清液，加

6、入300ul氯仿/異戊醇（24:1）抽提，5000rmp離心10min9、取上清液，加入300ul的異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜止10min，沉淀DNA，5000rmp離心10min10、加500ul 70%乙醇洗沉淀，5000rmp離心10min11、棄上清液，待酒精揮發(fā)盡后加30ulTE溶解12、溶解于20ul TE中，-20保存。二、試劑盒法提取大腸桿菌基因組DNA。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：1、TGuide細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302-02 50次 420元2、TaKaRa細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒TaKaRa  DV810A 50 650元3、Biomiga 細(xì)

7、菌基因組DNA提取試劑盒GD2411-01 Bacterial gDNA kit 50次 423元GD2411-02 Bacterial gDNA kit 250次 1798元4、Biospin 細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒BSC12S1 50次 400元 BSC12M1 100次 750元5、OMEGA細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒D3350-00 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 5 210元D3350-01 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 50 980 元D3350-02 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 200 3

8、350元熒光定量PCR試驗(yàn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）定量實(shí)驗(yàn)是一種實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)，用于在聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 的每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)期間測(cè)定靶核苷酸序列 （靶）數(shù)量。其中靶可以是 DNA、 cDNA 或 RNA?！緦?shí)驗(yàn)原理】在實(shí)時(shí)定量實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)是在 PCR 產(chǎn)物的擴(kuò)增達(dá)到固定熒光水平時(shí)的循環(huán)期間時(shí)間點(diǎn)來(lái)描述的，而不是在固定循環(huán)次數(shù)后累積的 PCR 產(chǎn)物最終數(shù)量來(lái)描述。擴(kuò)增曲線以圖形形式顯示在執(zhí)行的循環(huán)次數(shù)中檢測(cè)到的熒光。 在 PCR 的最初幾次循環(huán)中，熒光信號(hào)沒(méi)有明顯變化。該預(yù)定義的 PCR 循環(huán)范圍稱為基線。首先，軟件通過(guò)計(jì)算歸一化報(bào)告熒光信號(hào)強(qiáng)度 （與基線循環(huán)相對(duì)應(yīng)的 Rn 值）的數(shù)學(xué)趨勢(shì)，生成一個(gè)基線簡(jiǎn)化擴(kuò)

9、增曲線。然后，算法將搜索擴(kuò)增曲線上基線校準(zhǔn)后歸一化報(bào)告熒光信號(hào)強(qiáng)度 （ delta Rn Rn 值）與閾值交叉的點(diǎn)。 Rn 值與閾值交叉的分?jǐn)?shù)循環(huán)定義為 CT。一、試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用StepOne軟件中的Design Wizard（設(shè)計(jì)導(dǎo)向）創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)1、定義實(shí)驗(yàn)屬性在 Experiment Properties （實(shí)驗(yàn)屬性）屏幕上，輸入實(shí)驗(yàn)的標(biāo)識(shí)信息，然后選擇要設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)類型。1）Experiment Name （實(shí)驗(yàn)名稱）。2）Barcode （條碼），然后輸入您的 PCR 反應(yīng)板上的條碼。（可不填）3）User Name （用戶名）。4）Comments （注釋）。（可不填）5）選擇 Quan

10、titation （定量）實(shí)驗(yàn)類型6）Next> （下一步）2、定義方法和材料在 Methods & Materials （方法和材料）屏幕上，選擇用于實(shí)驗(yàn)的定量方法、試劑、升降溫速度和 PCR 模板。1）將 Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線）選為定量方法。將 Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線）選為定量方法。 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)確定樣本中靶序列的絕對(duì)量。 從已知量的稀釋序列中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于歸檔結(jié)果。 當(dāng)設(shè)置反應(yīng)板時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方法需要靶、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。用于標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)的 PCR 反應(yīng)包括以下組分： 樣本 其中靶數(shù)量未知的樣本。 標(biāo)準(zhǔn)品 數(shù)量已知的樣本。 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列

11、 一組用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 （例如，1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32） 。 重復(fù)數(shù) 含有相同組分和量的相同反應(yīng)數(shù)。 陰性對(duì)照 含有水或緩沖液的樣本，不含模板；也稱為 “無(wú)模板對(duì)照(NTC)”。陰性對(duì)照應(yīng)不會(huì)擴(kuò)增。2）為試劑選擇 TaqMan® Reagents （ TaqMan 試劑）（包括兩個(gè)引物一個(gè)探針） 。如果使用 TaqMan 試劑以檢測(cè)擴(kuò)增并定量樣本中靶的數(shù)量，則選擇TaqMan® Reagents （ TaqMan 試劑） 。 TaqMan 試劑包括兩個(gè)引物和一個(gè)TaqMan® 探針。 引物設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶。 TaqMan 探針

12、設(shè)計(jì)用于雜交靶，并在擴(kuò)增靶時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。切記！ Applied Biosystems 不建議將 TAMRATM 染料隨 StepOneTM 系統(tǒng)用作熒光報(bào)告基團(tuán)或淬火基團(tuán)。如果使用 SYBR Green 試劑以檢測(cè)擴(kuò)增并定量樣本中靶的數(shù)量，則選擇 SYBR® Green Reagents （ SYBR Green 試劑）。 SYBR Green 試劑包括兩個(gè)引物和 SYBR Green 染料。 引物設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶。 SYBR Green 染料可在結(jié)合到雙鏈 DNA 時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。 SYBR Green 染料通常是添加到反應(yīng)的SYBR Green 母液的一部分。 如果使用 SYBR

13、 Green 染料：選擇 Include Melt Curve （包括解鏈曲線）以執(zhí)行擴(kuò)增靶的解鏈曲線分析。將 Standard （標(biāo)準(zhǔn)）選為升降溫速度。 Applied Biosystems 不提供 SYBRGreen 試劑的 Fast 母液。3）為升降溫速度選擇 Standard (2 hours to complete a run) （標(biāo)準(zhǔn) （約兩小時(shí)完成運(yùn)行） 。 如果為 PCR 反應(yīng)使用 Fast 試劑，則選擇 Fast (40 Minutes toComplete a Run) （快速 （約 40 分鐘完成運(yùn)行） ）。 如果為 PCR 反應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)試劑 （包括 SYBR Green

14、 試劑和 TaqMan 試劑） ，則選擇 Standard (2 Hours to Complete a Run) （標(biāo)準(zhǔn) （約 2 小時(shí)完成運(yùn)行） 。4）為模板類型選擇 gDNA (genomic DNA) （ gDNA （基因組 DNA） ） 。5）Next> （下一步） 。3、設(shè)置靶在 Targets （靶）屏幕上，輸入您想在 PCR 反應(yīng)板中定量的靶數(shù)量，然后為每個(gè)靶設(shè)置檢測(cè)。1）單擊 How many targets do you want to quantify in the reaction plate? （您想在反應(yīng)板中定量多少靶？）字段，然后輸入 1（根據(jù)需要填）。注意

15、： 靶檢測(cè)表中的行數(shù)將以您輸入的數(shù)字更新。2）選擇 Set Up Standards （設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品）復(fù)選框，以為靶檢測(cè)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品。建議反應(yīng)板中的每個(gè)靶檢測(cè)設(shè)置一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意： Set Up Standards （設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品）復(fù)選框默認(rèn)情況下已選取。3）設(shè)置靶 1 檢測(cè)：a. 單擊 Enter Target Name （輸入靶名稱）單元格，然后輸入 RNase P（示例）。b. 從 Reporter （報(bào)告基團(tuán)）下拉菜單中，選擇 FAM （默認(rèn)） 。 如果要將 FAMTM 染料加在您用于檢測(cè)靶的 TaqMan 探針的 5 端，則選擇FAM。 如果要將 JOETM 染料加在您用于檢測(cè)靶的 Ta

16、qMan 探針的 5 端，則選擇JOE。 如果要將 VIC® 染料加在您用于檢測(cè)靶的 TaqMan 探針的 5 端，則選擇VIC。 如果您正使用 SYBR® Green 染料以檢測(cè)雙鏈 DNA，則選擇 SYBR。c. 從 Quencher （淬火基團(tuán)）下拉菜單中，選擇 NFQ-MGB （默認(rèn)） 。 如果要將非熒光淬火基團(tuán)小溝結(jié)合物加在您正用于檢測(cè)靶的 TaqMan 探針的 3 端，則選擇 NFQ-MGB。 如果您正使用 SYBR Green 染料，則選擇 None （無(wú)） 。4）Next> （下一步） 。4、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品在 Standards （標(biāo)準(zhǔn)品）屏幕上，為所有標(biāo)

17、準(zhǔn)曲線輸入反應(yīng)板中的點(diǎn)數(shù)和重復(fù)數(shù)。對(duì)于每條標(biāo)準(zhǔn)曲線，輸入起始量并選擇序列倍數(shù)。1）單擊 How many points do you need for each standard curve? （每條標(biāo)準(zhǔn)曲線您需要多少個(gè)點(diǎn)？）字段，然后輸入 5。建議每條標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)至少有五個(gè)稀釋點(diǎn)。2）單擊 How many replicates do you need for each point? （每個(gè)點(diǎn)您需要多少次重復(fù)反應(yīng)？）字段，然后輸入 3。建議每個(gè)點(diǎn)三次重復(fù)反應(yīng)。3）為 RNase P （示例）檢測(cè)定義標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量范圍：a. 單擊 Enter Starting Quantity （輸入起始量）字段，

18、然后輸入 10000。由于標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量的范圍會(huì)影響擴(kuò)增效率計(jì)算，因此應(yīng)仔細(xì)為您的檢測(cè)考慮標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量的適當(dāng)范圍： 為了更準(zhǔn)確地測(cè)量擴(kuò)增效率，請(qǐng)使用大范圍的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，擴(kuò)大到 5 個(gè)至6 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)之間。 如果您為標(biāo)準(zhǔn)品指定大范圍的數(shù)量，您需使用 PCR 產(chǎn)物或高度濃縮的模板，如 cDNA 克隆。 如果您的 cDNA 模板數(shù)量有限且/或靶是低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)錄物，或已知在給定范圍之內(nèi)，則可能需要小范圍的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量。b. 從 Select Serial Factor （選擇序列倍數(shù)）下列菜單中，選擇 1:2。序列倍數(shù)用于計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線所有點(diǎn)中的數(shù)量。 如果您的起始數(shù)量是最高數(shù)量，則選擇如 1:2、 1:3 之類的

19、稀釋倍數(shù)。 如果您的起始數(shù)量是最低數(shù)量，則選擇如 2X、 3X 之類的濃縮倍數(shù)。4）查看 Standard Curve Preview （標(biāo)準(zhǔn)品曲線預(yù)覽）窗格。 標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)包含如下點(diǎn)：10000、 5000、 2500、 1250 和 625。5）Next> （下一步） 。5、設(shè)置樣本在 Samples （樣本）屏幕上，輸入反應(yīng)板中要包括的樣本、重復(fù)數(shù)和陰性對(duì)照數(shù)，然后選擇樣本/靶反應(yīng)以進(jìn)行設(shè)置。1）單擊 How many samples do you want to test in the reaction plate? （您想在反應(yīng)板中檢測(cè)多少樣本？）字段，然后輸入 2。（根據(jù)需要填

20、）2）單擊 How many replicates do you need? （您需要多少次重復(fù)反應(yīng)？）字段，然后輸入 3。建議對(duì)每個(gè)樣本反應(yīng)重復(fù)三次反應(yīng)。3）單擊 How many negative controls do you need for each target assay? （每個(gè)靶檢測(cè)您需要多少陰性對(duì)照？） ，然后輸入 3。建議對(duì)每個(gè)靶檢測(cè)進(jìn)行三次陰性對(duì)照反應(yīng)。4）4. 設(shè)置樣本 1：a. 單擊 Enter Sample Name （輸入樣本名）字段，然后輸入 pop1 （用于重復(fù)組 1） 。b. 保留 Color （顏色）字段中的默認(rèn)設(shè)置。5）設(shè)置樣本 2：a. 單擊 Ent

21、er Sample Name （輸入樣本名）字段，然后輸入 pop2 （用于重復(fù)組 2） 。b. 保留 Color （顏色）字段中的默認(rèn)設(shè)置。6）選擇 All Sample/Target Reactions （所有樣本/靶反應(yīng)）以檢測(cè)所有樣本中的所有靶。 選擇 All Sample/Target Reactions （所有樣本/靶反應(yīng)）以檢測(cè)所有樣本中的所有靶。 選擇 Specify Sample/Target Reactions （指定樣本/靶反應(yīng)）以指定每個(gè)樣本中要檢測(cè)的靶。7）在 Well Count （反應(yīng)孔數(shù)）窗格中，確認(rèn)存在： 6 個(gè)未知反應(yīng)孔U 15 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔S 3 個(gè)陰性

22、對(duì)照反應(yīng)孔N 24 個(gè)空反應(yīng)孔8）在 View Plate Layout （查看檢測(cè)板布局）選項(xiàng)卡上：a. 從 Arrange Plate by （反應(yīng)板布局方式）下拉菜單中，選擇 Rows （按行）（默認(rèn)） 。b. 從 Place Negative Controls （放置陰性對(duì)照）下拉菜單中，選擇 Upper Left（左上角） （默認(rèn)） 。9）Next> （下一步） 。6、設(shè)置運(yùn)行方式在 Run Method （運(yùn)行方法）屏幕上，查看默認(rèn)運(yùn)行方法的反應(yīng)體積和溫度變化過(guò)程設(shè)置。 若需要，您可調(diào)整默認(rèn)運(yùn)行方法或用 Run Method （運(yùn)行方法）庫(kù)中的某種方法進(jìn)行替換。1）單擊選擇

23、Graphical View （圖形視圖）選項(xiàng)卡 （默認(rèn)）或 Tabular View （表格視圖）選項(xiàng)卡。2）單擊 Reaction Volume Per Well （每個(gè)反應(yīng)孔的反應(yīng)體積）字段，然后輸入 25 µL。為 “反應(yīng)體積/反應(yīng)孔”輸入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系統(tǒng)支持 10 至30 µL 之間的反應(yīng)體積。3）確保溫度變化過(guò)程設(shè)置顯示保持和循環(huán)階段。 確保溫度變化過(guò)程設(shè)置適合試劑。 如果正執(zhí)行一步法 RT-PCR 擴(kuò)增，則包括一個(gè)反轉(zhuǎn)錄步驟。如果實(shí)驗(yàn)需要一個(gè)不同的溫度變化過(guò)程設(shè)置，調(diào)整溫度變化過(guò)程設(shè)置或用Run Method （運(yùn)行方法）庫(kù)中

24、的某個(gè)溫度變化過(guò)程設(shè)置進(jìn)行替換。 Run Method（運(yùn)行方法）庫(kù)包括在 StepOne 軟件中。4）Next> （下一步） 。7、查看反應(yīng)設(shè)置在 Reaction Setup （反應(yīng)設(shè)置）屏幕上，選擇檢測(cè)類型 （如果使用 TaqMan 試劑），然后查看為準(zhǔn)備 PCR 反應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)稀釋序列和樣本稀釋而計(jì)算的劑量。 若需要，您可調(diào)整反應(yīng)體積、額外反應(yīng)體積、組分濃度、標(biāo)準(zhǔn)品濃度和/或稀釋后樣本濃度。切記！ 對(duì)反應(yīng)板中的每個(gè)靶檢測(cè)執(zhí)行這些步驟。完成 Reaction Mix Calculations （反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）選項(xiàng)卡1）選擇 Reaction Mix Calculations （反應(yīng)預(yù)

25、混液計(jì)算）選項(xiàng)卡 （默認(rèn)）。 2）從 Select Target （選擇靶）窗格中，選擇 RNase P。3）從 Assay Type （檢測(cè)類型）下拉菜單中，選擇 Inventoried/Made to Order（庫(kù)存/定制） 。如果正使用 TaqMan 試劑，選擇所使用的檢測(cè)類型： 如果正使用 Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays （庫(kù)存/定制）或 Applied Biosystems Custom TaqMan® Gene Expression Assays，則選擇 Inventoried/Made to

26、 Order （庫(kù)存/定制）。 如果正使用 Primer Express® 軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)，則選擇 Custom（定制）。4）確認(rèn) Reaction Volume Per Well （每個(gè)反應(yīng)孔的反應(yīng)體積）字段中顯示 25 µL。為 “反應(yīng)體積/反應(yīng)孔”輸入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系統(tǒng)支持 10 至30 µL 之間的反應(yīng)體積。5）確認(rèn) Excess Reaction Volume （額外反應(yīng)體積）字段中顯示 10%。包括額外反應(yīng)體積以彌補(bǔ)移液過(guò)程中的損失。建議至少準(zhǔn)備 10% 的額外反應(yīng)體積。6）在 Reactions for RNase P

27、（ RNase P 反應(yīng)）窗格中：a. 確認(rèn) Master Mix Concentration （母液濃度）字段中顯示 2.0X。b. 確認(rèn) Assay Mix Concentration （檢測(cè)預(yù)混液濃度）字段中顯示 20.0X。c. 查看 PCR 反應(yīng)的組分和計(jì)算的劑量。7）在 Standard Dilution Series for RNase P （ RNase P 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列）窗格中：a. 單擊 Standard Concentration in Stock （儲(chǔ)液中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度）字段，然后輸入 20000。b. 單擊 units （單位）字段，然后輸入 copies per

28、µL。c. 查看為準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列計(jì)算的劑量。完成 Sample Dilution Calculations （樣本稀釋計(jì)算）選項(xiàng)卡1）選擇 Sample Dilution Calculations （樣本稀釋計(jì)算）選項(xiàng)卡。2）單擊 Diluted Sample Concentration (10X for Reaction Mix) （稀釋后樣本濃度）（對(duì)于反應(yīng)預(yù)混液為 10X） ，然后輸入 6.6。3）從單位下拉菜單中，選擇 ng/µL （默認(rèn)） 。4）查看為樣本稀釋計(jì)算的劑量。8、實(shí)驗(yàn)材料訂購(gòu)在 Materials List （材料列表）屏幕上，查看建議用于準(zhǔn)備 P

29、CR 反應(yīng)板的材料列表?；蛘撸蓮?Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 產(chǎn)品倉(cāng)庫(kù)）訂購(gòu)所建議的材料。 創(chuàng)建購(gòu)物籃，向購(gòu)物列表中添加項(xiàng)目，然后登錄以提交您的訂單。 您必須具有不受限制的網(wǎng)絡(luò)連接才能訪問(wèn) Applied Biosystems Store （ AppliedBiosystems 產(chǎn)品倉(cāng)庫(kù)） 。1）在 Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 產(chǎn)品倉(cāng)庫(kù)）網(wǎng)站上查找靶檢測(cè)套件：a. 確保您的計(jì)算機(jī)已連接到因特網(wǎng)。b. 單擊 Enter Gene Name（輸入基因名）字段，輸入 R

30、Nase P，然后單擊 FindAssay （查找檢測(cè)套件） 。c. 在 Find Assay Results （發(fā)現(xiàn)檢測(cè)套件結(jié)果）對(duì)話框中，選擇您的檢測(cè)套件。d. 單擊 Apply Assay Selection （應(yīng)用檢測(cè)套件選擇） 。2）完成 Experiment Materials List （實(shí)驗(yàn)材料列表）窗格：a. 從 Display （顯示）下拉菜單中，選擇 All Items （所有項(xiàng)） （默認(rèn)） ，然后查看建議的材料。 若需要，使用右側(cè)的滾動(dòng)條查看所有項(xiàng)。3）用于進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)的Inventoried/Made to Order 檢測(cè)設(shè)計(jì)用于配合以下 TaqMan®

31、母液使用：TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2), No AmpErase® UNG，250 次反應(yīng)，編號(hào)4352042TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix， 200 次反應(yīng)，編號(hào)4304437TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix， 2000 次反應(yīng)，編號(hào)432670810 包裝 TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix，編號(hào)4305719TaqMan® 2 Universal PCR Master

32、Mix, No AmpErase® UNG，200 次反應(yīng)，編號(hào)4324018TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG，2000 次反應(yīng)，編號(hào)432661410 包裝 TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix， No AmpErase®UNG，編號(hào)43240204）靶DNA 或 cDNA有幾種 TaqMan 和 SYBR Green 試劑可用于定量實(shí)驗(yàn)。a.TaqMan® 試劑 TaqMan® Fast Universal PCR M

33、aster Mix (2), NoAmpErase® UNG， 250 次反應(yīng)4352042TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix， 200 次反應(yīng)，編號(hào)4304437TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix， 2000 次反應(yīng)，編號(hào)432670810 包裝 TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix ，編號(hào)4305719TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, No，AmpErase® UNG， 200 次反應(yīng)，編號(hào)43

34、24018TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, NoAmpErase® UNG， 2000 次反應(yīng)，編號(hào)432661410 包裝 TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix，No AmpErase® UNG，編號(hào)4324020TaqMan® PCR Core Reagents Kit， 200 次反應(yīng)，編號(hào)N808-0228b.SYBR® Green 試劑Power SYBR® Green PCR Master Mix (1 mL)，40 次反應(yīng)，編號(hào)4368577

35、Power SYBR® Green PCR Master Mix (5-mL)，200 次反應(yīng)，編號(hào)4367659Power SYBR® Green PCR Master Mix(10 × 5-mL)， 2000 次反應(yīng)，編號(hào)4368708Power SYBR® Green PCR Master Mix (50 mL)，2000 次反應(yīng)，編號(hào)4367660SYBR® Green PCR Master Mix (1-mL)， 40 次反應(yīng)，編號(hào)4344463SYBR® Green PCR Master Mix (5-mL)， 200 次

36、反應(yīng)，編號(hào)4309155SYBR® Green PCR Master Mix (50-mL)， 2000 次反應(yīng)，編號(hào)4334973SYBR® Green PCR Core Reagents， 200 次反應(yīng)，編號(hào)43048869、完成設(shè)計(jì)向?qū)?要完成 Design Wizard （設(shè)計(jì)向?qū)В┕ぷ髁鞒蹋榭捶磻?yīng)板布局，然后選擇一個(gè)退出選項(xiàng)。1）在 Review Plate for Experiment （查看實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)板）窗口中，查看反應(yīng)板布局。2）單擊 Save Experiment （保存實(shí)驗(yàn)） 。3）在 Save Experiment （保存實(shí)驗(yàn)）對(duì)話框中，單擊 Sa

37、ve （保存）以接受默認(rèn)文件名和位置。 示例實(shí)驗(yàn)被保存并關(guān)閉，并且您返回到 Home （主頁(yè)）屏幕。二、準(zhǔn)備反應(yīng)工作如何為標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 PCR 反應(yīng)。1、準(zhǔn)備樣本稀釋在將樣本添加到最終反應(yīng)預(yù)混液之前，執(zhí)行樣本稀釋。采用 StepOneTM 軟件計(jì)算的劑量稀釋樣本。（樣本稀釋計(jì)算）根據(jù)儲(chǔ)液中的樣品濃度？ng/µL，Stepone軟件計(jì)算出稀釋劑量。因?yàn)樵?StepOne 軟件中，樣本量?jī)H限于反應(yīng)總量的 10%，因此需要進(jìn)行樣本稀釋。 反應(yīng)總量為每次反應(yīng) 25 µL，因此樣本量為每次反應(yīng) 2.5 µL。根據(jù) “樣本稀釋計(jì)算”表稀釋樣本。1）所需材料 用于稀釋樣本的

38、稀釋液（TE緩沖液或水）、樣本儲(chǔ)液 微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)2）為每份擬稀釋樣本標(biāo)記一個(gè)單獨(dú)的微量離心管：Population 1、 Population 2等3）將所需劑量的稀釋液添加到每個(gè)空反應(yīng)管內(nèi)。（14.2µL）4）將所需劑量的樣本儲(chǔ)液添加到每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)。（1µL）5）振蕩每份稀釋的樣本 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。6）將稀釋后樣本置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。2、準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列 采用 StepOne 軟件計(jì)算的劑量準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列。（反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）根據(jù)儲(chǔ)液中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度？copies/µL，Stepone軟件計(jì)算

39、出劑量。1）所需材料用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液（TE緩沖液或水）、標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液 微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)2）為每份標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記一個(gè)單獨(dú)的微量離心管：Std. 1、Std. 2、Std.3、Std. 4、Std. 5。3）將所需劑量的稀釋液添加到每個(gè)空反應(yīng)管內(nèi)：Std. 1（14.5µL）、Std. 2（9.1µL）、Std.3（9.1µL）、Std. 4（9.1µL）、Std. 5（9.1µL）。4）在Std. 1 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 1：a. 振蕩儲(chǔ)液 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。b. 使用新的移液槍槍頭，將 3.

40、6 µL 儲(chǔ)液添加到Std. 1 反應(yīng)管中。c. 振蕩 Std. 1 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。5） 在Std. 2 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 2：a. 使用新的移液槍槍頭，將 9.1 µL 稀釋液 1 添加到Std. 2 反應(yīng)管中。b. 振蕩 Std. 2 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。6）在Std. 3 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 3：a. 使用新的移液槍槍頭，將 9.1 µL 稀釋液 2 添加到Std. 3 反應(yīng)管中。b. 振蕩 Std. 3 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。7）在Std. 4 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 4：a.

41、 使用新的移液槍槍頭，將 9.1 µL 稀釋液 3 添加到Std. 4 反應(yīng)管中。b. 振蕩 Std. 4 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。8）在Std. 5 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 5：a. 使用新的移液槍槍頭，將 9.1 µL 稀釋液 4 添加到Std. 5 反應(yīng)管中。b. 振蕩 Std. 5 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。9）將標(biāo)準(zhǔn)品置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。3、準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液使用 StepOne 軟件計(jì)算的組分和劑量準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液。（反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）若實(shí)驗(yàn)包括一個(gè)以上的靶檢測(cè)，則為每個(gè)靶檢測(cè)單獨(dú)準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液1）所需材料各反應(yīng)預(yù)混液組分微

42、量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機(jī)2）為反應(yīng)預(yù)混液標(biāo)記一個(gè)適當(dāng)大小的反應(yīng)管： Reaction Mix。3）將所需劑量的每種組分添加到反應(yīng)管中：母液（2.0X）12.5µL、檢測(cè)母液（20.0X）1.3µL、水8.8µL，總劑量22.6µL，加上10%的超額量2.26µL，共計(jì)24.86µL，24次反應(yīng)所需劑量為596.6µL注意：將檢測(cè)母液置于冰柜中避光儲(chǔ)存，直到準(zhǔn)備使用。 過(guò)多暴露在光線下會(huì)影響熒光探針。計(jì)算中包括額外劑量，以便為試劑轉(zhuǎn)移期間發(fā)生的損失提供多余劑量。建議至少準(zhǔn)備 10% 的超額量。4）用移液槍輕輕吸入并

43、排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上反應(yīng)管蓋。5）短暫地離心反應(yīng)管以除去氣泡。6）將反應(yīng)預(yù)混液置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。注意：使用之前，請(qǐng)執(zhí)行以下操作： 搖晃瓶子，徹底混合母液。 振蕩反應(yīng)管以重新懸浮檢測(cè)母液，然后短暫地離心反應(yīng)管。 將任何冷凍樣本置于冰上將其解凍。 解凍時(shí)，進(jìn)行振蕩以重新懸浮樣本，然后短暫地離心反應(yīng)管。4、準(zhǔn)備反應(yīng)板為每個(gè)重復(fù)組準(zhǔn)備反應(yīng)物，然后將它們轉(zhuǎn)移到反應(yīng)板。 采用 StepOne 軟件中顯示的反應(yīng)板布局。 1）所需材料反應(yīng)預(yù)混液Reaction Mix、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、水MicroAmpTM Fast Optical 48-Well Reaction Plate Micro

44、AmpTM Optical 48-Well Adhesive Film微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機(jī)2）準(zhǔn)備靶陰性對(duì)照反應(yīng)預(yù)混液：a. 向一個(gè)適當(dāng)大小的反應(yīng)管中，加入下面所列劑量的反應(yīng)預(yù)混液和水。反應(yīng)管反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量（µL）水量（µL）1Reaction mix74.68.3b. 用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上反應(yīng)管蓋。c. 短暫地離心反應(yīng)管以除去氣泡。d. 向反應(yīng)板的相應(yīng)反應(yīng)孔中分別加入 25 µL 的陰性對(duì)照反應(yīng)預(yù)混液。3）對(duì)于每個(gè)重復(fù)組，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液：a. 向適當(dāng)大小的反應(yīng)管中，加入下面所列劑量的反應(yīng)預(yù)混液和標(biāo)準(zhǔn)

45、品。反應(yīng)管標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量(µL)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品劑量(µL)1Std 1Reaction mix74.6Std 18.32Std 2Reaction mix74.6Std 28.33Std 3Reaction mix74.6Std 38.34Std 4Reaction mix74.6Std 48.35Std 5Reaction mix74.6Std 58.3b. 用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上各反應(yīng)管蓋。c. 短暫地離心各反應(yīng)管以除去氣泡。d. 向反應(yīng)板的相應(yīng)反應(yīng)孔中加入 25 µL 的標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液。4）對(duì)于每個(gè)重復(fù)組

46、，準(zhǔn)備未知樣本的反應(yīng)預(yù)混液：a. 向適當(dāng)大小的反應(yīng)管中，加入下面所列劑量的反應(yīng)預(yù)混液和樣本。反應(yīng)管未知樣本反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量(µL)樣本樣本劑量(µL)1pop1Reaction mix74.6pop18.32Pop2Reaction mix74.6Pop28.3b. 用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上各反應(yīng)管蓋。c. 短暫地離心各反應(yīng)管以除去氣泡。d. 向反應(yīng)板的相應(yīng)反應(yīng)孔中加入 25 µL 的未知 （樣本）反應(yīng)預(yù)混液。5） 用孔板高透光度蓋膜密封反應(yīng)板。6） 短暫地離心反應(yīng)板以除去氣泡。7） 在您準(zhǔn)備好運(yùn)行實(shí)驗(yàn)之前，將反應(yīng)板置于

47、陰暗處的冰上。注意：當(dāng)您準(zhǔn)備自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)時(shí)： 確保您使用適當(dāng)?shù)暮牟摹?確保 PCR 反應(yīng)的安排與 StepOne 軟件中顯示的反應(yīng)板布局一致。 您可以： 接受軟件自動(dòng)生成的反應(yīng)板布局?；?使用 Advanced Setup （高級(jí)設(shè)置）工作流程更改軟件中的反應(yīng)板布局。三、運(yùn)行試驗(yàn)1、準(zhǔn)備運(yùn)行 打開(kāi)實(shí)驗(yàn)并將密封的 MicroAmpTM Fast Optical 48-Well Reaction Plate 裝載到StepOneTM 擴(kuò)增儀以準(zhǔn)備運(yùn)行。 1） 打開(kāi)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)a.打開(kāi)StepOneb.從Home屏幕上，單擊Openc.在Open對(duì)話框中，導(dǎo)航到experiments文件夾（默認(rèn)

48、）d.找到創(chuàng)建的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，打開(kāi)。2）裝載反應(yīng)板（帶無(wú)粉手套）a.打開(kāi)擴(kuò)增儀抽屜b.將反應(yīng)載體放置在樣本加熱塊中。反應(yīng)板的方向取決于您所用耗材的類型： 若使用一個(gè)反應(yīng)板，讓 A1 反應(yīng)孔位于樣本加熱塊的左后角。 若使用反應(yīng)管條帶，則將條帶置于樣本加熱塊中。c. 小心地關(guān)閉擴(kuò)增儀抽屜。2、啟動(dòng)運(yùn)行若計(jì)算機(jī)已通過(guò) StepOne 系統(tǒng)線纜直接連接到 StepOne 擴(kuò)增儀，則執(zhí)行下列步驟。（并置啟動(dòng)）1）在 StepOne 軟件中，單擊 Temperature Plot （溫度曲線） 。2）單擊 START RUN （啟動(dòng)運(yùn)行） 。3、監(jiān)視運(yùn)行 1）并置監(jiān)視運(yùn)行期間，定期查看 StepOne 軟件提

49、供的所有三條曲線是否存在潛在問(wèn)題。a.停止運(yùn)行在 StepOne 軟件中，單擊 STOP RUN （停止運(yùn)行）。對(duì)話框中包括： Stop Immediately （立即停止）以立即停止運(yùn)行。 Stop after Current Cycle/Hold （當(dāng)前循環(huán) / 保持階段后停止）以在當(dāng)前循環(huán)或保持階段之后停止運(yùn)行。 Cancel （取消）以繼續(xù)運(yùn)行。b. 實(shí)時(shí)查看擴(kuò)增數(shù)據(jù)Amplification Plot （擴(kuò)增曲線）屏幕允許在 StepOne 擴(kuò)增儀運(yùn)行期間采集熒光數(shù)據(jù)時(shí)查看樣本擴(kuò)增。 若設(shè)置了某種方法以采集實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)， Amplification Plot（擴(kuò)增曲線）屏幕上會(huì)顯示在 V

50、iew Plate Layout （查看反應(yīng)板布局）選項(xiàng)卡中所選反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)。 擴(kuò)增曲線將對(duì)照歸一化染料熒光 (Rn) 循環(huán)數(shù)。Amplification Plot （擴(kuò)增曲線）屏幕對(duì)識(shí)別和檢查異常擴(kuò)增十分有用。 異常擴(kuò)增可能包括以下情況： 陰性對(duì)照反應(yīng)孔中熒光增強(qiáng)。 預(yù)期循環(huán)中不存在可檢測(cè)熒光 （在相同情況下使用相同試劑從先前類似的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行確定） 。c. 實(shí)時(shí)查看運(yùn)行的溫度數(shù)據(jù)。運(yùn)行期間， Temperature Plot （溫度曲線）屏幕上實(shí)時(shí)顯示樣本加熱塊、受熱護(hù)蓋門和樣本 （已計(jì)算）的溫度。Temperature Plot （溫度曲線）屏幕對(duì)識(shí)別硬件故障十分有用。 當(dāng)監(jiān)視 Temper

51、aturePlot （溫度曲線）屏幕時(shí)，觀察 Sample （樣本） 、 Heated Cover （受熱護(hù)蓋門）和 Sample Block （樣本加熱塊）曲線是否出現(xiàn)異常情況。 通常， Sample （樣本）和 Block （樣本加熱塊）曲線應(yīng)大約相互對(duì)應(yīng)。 兩條曲線存在顯著偏差可能表示存在問(wèn)題。 Heated Cover （受熱護(hù)蓋門）曲線應(yīng)保持方法中指定的常溫。 偏離一致溫度可能表示存在問(wèn)題。d. 在 Run Method （運(yùn)行方法）屏幕上查看運(yùn)行進(jìn)度開(kāi)始運(yùn)行之后， StepOne 系統(tǒng)會(huì)在 Run Method （運(yùn)行方法）屏幕上顯示運(yùn)行進(jìn)度。例如對(duì)于方法的溫度變化過(guò)程報(bào)告運(yùn)行進(jìn)度

52、。更改運(yùn)行方法 （添加循環(huán)、保持或解鏈曲線） 在導(dǎo)航窗格中，單擊 Run Method （運(yùn)行方法） 。 在 Run Method （運(yùn)行方法）屏幕上，執(zhí)行以下任意操作 輸入要應(yīng)用于 Cycling Stage （循環(huán)階段）的循環(huán)數(shù)。 若您想要將解鏈曲線階段添加到運(yùn)行的末尾，則選擇Add Melt Curve Stage to End（將解鏈曲線階段添加到末尾） 。 若您想要將保持階段添加到運(yùn)行的末尾，則選擇 AddHolding Stage to End （將保持階段添加到末尾）。 單擊 Send to Instrument （發(fā)送到擴(kuò)增儀）e. 啟用/禁用通知設(shè)置。取或取消選取 Enabl

53、e Notifications （啟用通知）復(fù)選框。2）遠(yuǎn)程監(jiān)視 若將您的 StepOne 擴(kuò)增儀連接到網(wǎng)絡(luò)，您可使用 StepOne 軟件的遠(yuǎn)程監(jiān)視功能從網(wǎng)絡(luò)上的任何一臺(tái)計(jì)算機(jī)上實(shí)時(shí)查看運(yùn)行進(jìn)度。4、卸載反應(yīng)板并傳輸數(shù)據(jù)當(dāng)StepOne 擴(kuò)增儀顯示 Run History （運(yùn)行歷史）屏幕時(shí)，從 StepOne 擴(kuò)增儀上卸載反應(yīng)板，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)以進(jìn)行分析。當(dāng) StepOne 擴(kuò)增儀完成一次運(yùn)行時(shí)，系統(tǒng)會(huì)將運(yùn)行詳情保存到運(yùn)行歷史記錄，在擴(kuò)增儀完成另一次運(yùn)行之前，該運(yùn)行歷史記錄會(huì)保留在系統(tǒng)中。1）當(dāng) StepOne 擴(kuò)增儀觸摸屏上顯示 Run Report （運(yùn)行報(bào)告）屏幕時(shí)2）打開(kāi)

54、擴(kuò)增儀抽屜。3）從樣本加熱塊中取出反應(yīng)板。4） 小心地關(guān)閉擴(kuò)增儀抽屜。切記！ 不要在運(yùn)行后關(guān)閉 StepOne 擴(kuò)增儀電源開(kāi)關(guān)。 不使用時(shí)，擴(kuò)增儀會(huì)自動(dòng)進(jìn)入休眠模式。并置數(shù)據(jù)的傳輸是自動(dòng)傳輸。四、實(shí)驗(yàn)分析StepOneTM 軟件使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)打開(kāi)StepOne，從Home屏幕上，單擊Open，在對(duì)話框中，導(dǎo)航到experiments文件夾，找到創(chuàng)建的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，打開(kāi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)文件，單擊Analyze （分析） ， 軟件使用默認(rèn)分析設(shè)置來(lái)分析數(shù)據(jù)。1）軟件元素 a.Experiment Menu （實(shí)驗(yàn)菜單）窗格 提供到以下軟件屏幕的鏈接： Setup （設(shè)置）屏幕

55、Run （運(yùn)行）屏幕 Analysis （分析）屏幕：Amplification Plot （擴(kuò)增曲線）Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線）Multicomponent Plot （多組分曲線）Raw Data Plot （原始數(shù)據(jù)曲線）QC Summary （ QC 摘要）Multiple Plots View （多曲線視圖）b. Plot （曲線）窗格 為已打開(kāi)的實(shí)驗(yàn)顯示所選分析屏幕。c. View （視圖）選項(xiàng)卡 為已打開(kāi)的實(shí)驗(yàn)顯示反應(yīng)板布局或反應(yīng)孔表d. Experiment （實(shí)驗(yàn)）選項(xiàng)卡 為每個(gè)打開(kāi)的實(shí)驗(yàn)顯示一個(gè)選項(xiàng)卡。2）如何選擇反應(yīng)孔要在分析屏幕上顯示特定反應(yīng)孔，在 Vi

56、ew Plate Layout （查看反應(yīng)板布局）選項(xiàng)卡上選擇相應(yīng)的反應(yīng)孔，操作如下：a. 要選擇某特定類型的反應(yīng)孔，使用 Select Wells With （選擇反應(yīng)孔類型）下拉菜單： 選擇 Sample （樣本） 、 Target （靶）或 Task （任務(wù)） ，然后選擇樣本、靶或任務(wù)名稱。b. 要選擇單個(gè)反應(yīng)孔，在反應(yīng)板布局中單擊該反應(yīng)孔。c. 要選擇多個(gè)反應(yīng)孔，按住 CTRL 鍵并單擊、或按住 Shift 鍵并單擊反應(yīng)板布局中的某反應(yīng)孔并拖移鼠標(biāo)覆蓋所需的反應(yīng)孔。d. 要選擇所有 48個(gè)反應(yīng)孔，單擊反應(yīng)板布局的左上角。3）如何顯示多條曲線使用 Multiple Plots （多曲線）

57、屏幕可同時(shí)顯示最多 4 條曲線。 要在 Multiple Plots（多曲線）屏幕內(nèi)導(dǎo)航：a. 從 Experiment Menu （實(shí)驗(yàn)菜單）窗格中，選擇 Analysis （分析）Multiple Plots View （多曲線視圖） 。b. 要顯示四條曲線，單擊 Show plots in a 2 × 2 matrix （以 2×2 窗格方式顯示曲線） 。c. 要在兩行中顯示兩條曲線，單擊 Show plots in two rows （以兩行顯示曲線） 。d. 要在兩列中顯示兩條曲線，單擊 Show plots in two columns （以兩列顯示曲線） 。e. 要顯示某特定曲線，從每條曲線顯示上方的下拉菜單中選擇該曲線。2、查看標(biāo)準(zhǔn)曲線Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線）屏幕顯示指定為標(biāo)準(zhǔn)品的樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 StepOne軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知靶的數(shù)量。在 Standard Curve （標(biāo)準(zhǔn)曲線）屏幕上檢查以下回歸系數(shù)值： Slope （斜率） /