土壤酶活性及土壤微生物計數(shù)測定方法

1、土壤酶活性及微生物測定土壤酶活性測定取樣工具及取樣方法在選好適當(dāng)?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的士約10g,盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。土樣在 自然條件下烘干裝入袋中備用。所需試劑：酒石酸鈉、NaCl、阿拉伯膠、納氏試劑、硫酸鏤（NH4）2SO4、甲苯、苯磷酸二鈉、NaAc.3H 2。、 HAc、酚、鐵氧化鉀、4-氨基安替口比咻、碘化鉀、氯化汞、氫氧化鉀、配置方法:錢態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.4717g（精確至0.0001g）干燥的硫酸?。∟H4）2SO4溶于水中，再加水 稀釋至1000mL,此溶液1mL含100闖N。往50

2、0ml容量瓶中注入 10、25、40、60、75、90ml標(biāo)準(zhǔn)溶液并用蒸儲水稀釋至刻度，制備成的溶液在490nm下比色，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。醋酸緩沖液：PH5.0, NaAc.3H 2050g,溶于適量水中，加 6mol/LHAc34ml ,稀釋至500ml。 硼酸緩沖液:PH9.0, 80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。納氏試劑：將碘化鉀10g溶于10ml水中，邊攪拌邊慢慢地加入氯化汞飽和水溶液，直至生成的紅色沉淀不再溶解為止。加入氫氧化鉀 30g并溶解之，再加入氯化汞飽和溶液1ml,加水至200ml。靜置，取上層清液，貯于棕色瓶中酚的標(biāo)準(zhǔn)溶

3、液：（1）原液一1克酚溶于蒸儲水中定容至 1升，溶液在暗色中穩(wěn)定，（2）工作 液一取50ml原液稀釋至1升（1ml含0.05mg酚）；分別向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、 5、6、7ml工作液并顯色定容（分別相當(dāng)于 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克 酚）,待顏色穩(wěn)定后，570nm比色繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定方法磷酸酶活性測定一、試驗原理土壤中的磷，很大部分以有機(jī)磷化合物的形式存在。磷酸酶能促進(jìn)有機(jī)磷化合物的水解。實驗表明，土壤微生物對于土壤含磷有機(jī)物質(zhì)的礦化起著主要作用；土壤的磷酸酶活性， 在很大程度上取決于土壤的腐殖質(zhì)含量， 活性磷量，能礦化有機(jī)磷化

4、合物的微生物數(shù)量， 植物 類型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力狀況。二、實驗儀器恒溫箱、分光光度計、三、實驗藥品甲苯、苯磷酸二鈉、酚、醋酸緩沖液、硼酸緩沖液、鐵氧化鉀、4-氨基安替口比咻、四、實驗步驟取5克過20目篩的風(fēng)干土樣于 50毫升容量瓶中，用 0.8（16滴）毫升甲苯處理，15分鐘 后，加入5毫升苯磷酸二鈉溶液 （6.75克苯磷酸二鈉溶于水，并稀釋至1升）和5毫升相應(yīng)的緩沖液（堿性磷酸酶用pH10的硼酸緩沖液，中性磷酸酶用pH7.0的檸檬酸緩沖液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸緩沖液）。仔細(xì)混合后，將反應(yīng)物置于37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng) 12小時，然后用蒸儲水定容至刻度，搖勻過濾，

5、用5毫升水代替基質(zhì)以設(shè)置對照。為了測定反應(yīng)混合物中的酚量，取1毫升濾液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸緩沖液（pH9.0）,再加 入3毫升2.5%的鐵氧化鉀和3毫升0.5%的4-氨基安替口比咻，搖動，溶液呈粉紅色，然后再 加水定容，待顏色褪到穩(wěn)定時（約需 2030分鐘），在分光光度計上于波長570納米處測定溶液的光密度，根據(jù)用酚制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出供試濾液中酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克數(shù)表示。月尿酶活性測定一、試驗原理土壤的胭酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān)。 根基土壤可測得最大的胭酶活性，人們常用土壤的胭酶活性表征土壤的氮素狀況。二、實驗儀器錐形瓶

6、、定性濾紙、震蕩器、分光光度計、1mm篩、三、實驗藥品酒石酸鈉、NaCl、阿拉伯膠、納氏試劑、錢態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液、雙蒸水四、實驗步驟1、準(zhǔn)確稱取10.00g過1mm篩的風(fēng)干土樣，置于 150mL錐形瓶中，注入 50mL20%的 NaCl溶液，將瓶塞緊，在振蕩 30min（120r/min）后，用定性濾紙過濾。2、取20mL濾液于50mL容量瓶中，加雙蒸水稀釋至 40mL左右，加2mL25%酒石酸鈉， 充分搖動靜置5min,使其與Cd, Mg離子絡(luò)合；3、再加入10滴1%阿拉伯膠，搖動后加 2mL納氏試劑，邊加邊搖，定容至刻度，5min后用490nm比色，配制俊態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，比色后求

7、算土壤月尿酶活性。4、結(jié)果分析滴定法測定過氧化氫酶活性、試驗原理土壤的過氧化物酶活性， 與土壤的呼吸強(qiáng)度和土壤微生物活動相關(guān)，在一定程度上反映土壤微生物過程的強(qiáng)度。根際土壤的過氧化物酶活性，遠(yuǎn)較根際外土壤為高。有機(jī)質(zhì)含量高的土壤，過氧化氫酶活性較強(qiáng)。因此，土壤過氧化物酶的活性可以表征土壤總的生 物學(xué)活性和肥力狀況。本試驗采用滴定法測定過氧化氫酶活性，即通過定量滴定酶促反應(yīng)后剩余的過氧化氫 量。二、實驗儀器致密濾紙、酸式滴定管、1mm篩三、實驗藥品雙蒸儲水、H2SO4、過氧化氫、KMnO 4、四、實驗步驟準(zhǔn)確稱取5.00g過1mm篩的風(fēng)干土樣，置于 150mL錐形瓶中，注入 40mL雙蒸儲水和

8、5mL0.3%過氧化氫，另設(shè)對照，塞緊瓶蓋，振蕩30min（120r/min）后，注入5mL1.5mol/LH 2SO4 終止反應(yīng)，用致密濾紙過濾，取濾液 25mL,用0.1mol/LKMnO 4滴定至微紅色。土壤的過氧 化氫酶活性，用100g 土重的0.1mol/LKMnO 4毫升數(shù)表示。土壤微生物檢測一、取樣工具無菌刮鏟、土樣采集器、鐐子、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。二、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面 5-15cm處的士約10g,盛入清潔的 牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使 土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品

9、立即進(jìn)行處理或放在4 C冰箱中暫存。三、所需培養(yǎng)基及配置方法1、牛肉膏蛋白臍培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌用）牛肉膏3g,蛋白月東10g, NaCl 5g,瓊脂1520g,水1000ml , pH7.07.2, 121c滅菌 20min。2、局氏（Gause） 1號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）可溶性淀粉 20g, KNO3 1g, NaCl 0.5g , K2HPO4 0.5g, MgSO4 .7H2O 0.5g, FeSO4 0.01g, 瓊脂20g,水1000ml, pH7.27.4。配制時，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的 水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其它成分， 溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml。1

10、21c滅菌20min。 3、無氮培養(yǎng)基（自身固氮菌、鉀細(xì)菌）甘露醇（或葡萄糖）10g, KH 2PO4 0.2g, MgSO4 7H2O 0.2g , NaCl 0.2g , CaSO4 2H2O 0.2g, CaCO3 5g,蒸儲水 1000ml, pH7.0 7.2, 113 c滅菌 30min。4、馬丁氏（Martin ）瓊脂培養(yǎng)基（分離真菌用）葡萄糖 10g,蛋白月東 5g, KH2PO4 1g, MgS04 7H2O 0.5g, 1/3000 孟加拉紅（rosebengal, 玫瑰紅水溶液）100ml,瓊脂1520g, pH自然，蒸儲水 800ml, 121度滅菌30min。臨用前加

11、入0.03%鏈霉稀釋液10ml,使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30聞。5、蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基蛋白月東 5 克、KH 2PO40.5g, NaCl 0.25g ,瓊脂 18 克，MgS04 7H2O 0.5g, FeSO4 0.01 克， 水1000毫升，pH7.2, 一氣壓滅菌 20分鐘滅菌。四、所需藥品牛肉膏、蛋白月東、 NaCl、瓊脂、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgS04、FeS04、甘露醇（或葡萄糖）、 CaS04 2H 2。、CaCO3、孟加拉紅、鏈霉素五、檢測方法土壤中放線菌的檢測一、試驗原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中檢測放線菌 二、實驗儀器及試劑7個土樣，3個重復(fù)，共需252個滅菌培

12、養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶高氏一號培養(yǎng)基可溶性淀粉 20g, KN0 3 1g, NaCl 0.5g , K2HPO4 0.5g, MgS04 0.5g, FeS04 0.01g,瓊 脂20g,水1000ml, pH7.27.4。配制時，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水 中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其它成分，溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml o 121c滅菌20min。三、實驗步驟1、在超凈工作臺中，無菌稱取所取土樣10g,分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤

13、懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。（另外，要知道所稱土樣的含水量）2、倒人45c恒溫水浴的滅菌高氏l號培養(yǎng)基，水平放置，凝固待用；分別無菌吸取各樣品10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液，加入滅菌平皿中（每稀釋度3皿，每皿lml）,用玻璃涂布棒涂抹均勻，將平皿倒置于 28c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。放線菌的培養(yǎng)時間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多3、培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進(jìn)行計算，最后換算成每克干土壤中菌落形成單位。每克土壤中菌落形成單位=同一稀釋度3次重復(fù)的平均

14、菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)。土壤中細(xì)菌的檢測一、試驗原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中分離細(xì)菌二、實驗儀器及試劑7個土樣，3個重復(fù)，共需252個滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基牛肉膏3g,蛋白月東10g, NaCl 5g ,瓊脂1520g,水1000ml , pH7.07.2, 121c滅菌 20min。三、實驗步驟1、在超凈工作臺中，無菌稱取所取土樣10 g ,分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶 中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液 1ml移入裝9ml無菌 水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到 10-10。稀釋。（另外，要 知道所稱

15、土樣的含水量）2、分別無菌吸取各樣品105、10-6、10-7、10-8稀釋液，加入滅菌平皿中（每稀釋度3皿，每皿 lml）,倒人45c恒溫水浴的滅菌牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基，混勻。（稀釋倍數(shù)是情況而定）3、待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于37c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進(jìn)行計算，最后換算成 每克干土壤中菌落形成單位。每克土壤中菌落形成單位=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)。土壤中真菌的檢測 一、試驗原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中檢測真菌 二、實驗儀器及試劑

16、7個土樣，3個重復(fù)，共需252個滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶、滅 菌水馬丁氏（Martin ）瓊脂培養(yǎng)基（分離真菌用）葡萄糖 10g,蛋白月東 5g, KH 2PO4 1g, MgS04 7H2O 0.5g, 1/3000 孟加拉紅（rose bengal, 玫瑰紅水溶液）100ml,瓊脂1520g, pH自然，蒸儲水 800ml, 121度滅菌30min。臨用 前加入0.03%鏈霉稀釋液10ml,使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30四。（鏈霉素在培養(yǎng)基融化并冷卻至50攝氏度時加入，用剩的鏈霉素在冰箱可保存4個月，但每過一月，在 1升培養(yǎng)基中需多加0.1ml）。 三、實驗步驟1、在超凈

17、工作臺中，無菌稱取所取土樣10g,分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中， 于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液 1ml移入裝9ml無菌水試管 中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到 10-10。稀釋。（另外，要知道所稱土 樣的含水量）2、分別無菌吸取各樣品10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液，加入滅菌平皿中（每稀釋度3皿，每皿 lml）,倒人45 c恒溫水浴的滅菌馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基，混勻。（稀釋倍數(shù)是情況而 定）3、待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于28c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計數(shù)的稀釋度，算出同一稀

18、釋度3個平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進(jìn)行計算，最后換算成 每克干土壤中菌落形成單位。每克土壤中菌落形成單位=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)。土壤中自身固氮菌的檢測一、試驗原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中檢測自身固氮菌。二、實驗儀器及試劑7個土樣，3個重復(fù)，共需 個滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶、滅菌水無氮培養(yǎng)基甘露醇（或葡萄糖）10g, KH 2PO4 0.2g, MgS04 7H2O 0.2g, NaCl 0.2g, CaS04 2H2O 5g,CaC03 1000ml,蒸儲水 1000ml, pH7.0 7.2, 113 c 滅菌

19、 30min。三、實驗步驟1、在超凈工作臺中，無菌稱取所取土樣10 g ,分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。（另外，要知道所稱土樣的含水量）2、分別無菌吸取各樣品10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液，加入滅菌平皿中（每稀釋度3皿，每皿 lml）,倒人45c恒溫水浴的滅菌無氮培養(yǎng)基，混勻。（稀釋倍數(shù)視情況而定）3、待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于28c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計數(shù)的稀釋度，算出同

20、一稀釋度3個平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進(jìn)行計算，最后換算成 每克干土壤中菌落形成單位。每克土壤中菌落形成單位=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)。土壤中氨化細(xì)菌的檢測一、試驗原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中檢測自身固氮菌。二、實驗儀器及試劑7個土樣，3個重復(fù)，共需252個滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶、滅菌水蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基蛋白豚 5 克、KH 2PO40.5g, NaCl 0.25g,瓊月旨 18 克，MgS0 4 7H2O 0.5g, FeSO4 0.01 克， 水1000毫升，pH7.2, 一氣壓滅菌 20分鐘滅菌。三、實驗步驟1、在超凈工作臺中，無菌稱取所取土樣10g,分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中， 于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液 1ml移入裝9ml無菌水試管 中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到 10-1。稀釋。（另外，要知道所稱土 樣的含水量）2、分別無菌吸取各樣品10-6、10-7、10-8、10-9稀釋液，加入滅菌平皿中（每稀釋度3皿，每皿 lml）