光學(xué)顯微鏡的工作原理

1、光學(xué)顯微鏡的工作原理 顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器，已有300多年的發(fā)展史。自從有了顯微鏡，人們看到了過(guò)去看不到的許多微小生物和構(gòu)成生物的基本單元細(xì)胞。目前，不僅有能放大千余倍的光學(xué)顯微鏡，而且有放大幾十萬(wàn)倍的電子顯微鏡，使我們對(duì)生物體的生命活動(dòng)規(guī)律有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。在普通中學(xué)生物教學(xué)大綱中規(guī)定的實(shí)驗(yàn)中，大部分要通過(guò)顯微鏡來(lái)完成，因此，顯微鏡性能的好壞是做好觀察實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。 一、顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng) 顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡、反光鏡和聚光器四個(gè)部件。廣義的說(shuō)也包括照明光源、濾光器、蓋玻片和載玻片等。 （一）、物鏡 物鏡是決定顯微鏡性能的最重要部件，安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，接近被觀察的物體，故

2、叫做物鏡或接物鏡。 1、物鏡的分類 物鏡根據(jù)使用條件的不同可分為干燥物鏡和浸液物鏡；其中浸液物鏡又可分為水浸物鏡和油浸物鏡（常用放大倍數(shù)為90100倍）。 根據(jù)放大倍數(shù)的不同可分為 低倍物鏡（10倍以下）、中倍物鏡（20倍左右）高倍物鏡（4065倍）。 根據(jù)像差矯正情況，分為消色差物鏡（常用，能矯正光譜中兩種色光的色差的物鏡）和復(fù)色差物鏡（能矯正光譜中三種色光的色差的物鏡，價(jià)格貴，使用少）。 2、物鏡的主要參數(shù)： 物鏡主要參數(shù)包括：放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和工作距離。 、放大倍數(shù)是指眼睛看到像的大小與對(duì)應(yīng)標(biāo)本大小的比值。它指的是長(zhǎng)度的比值而不是面積的比值。例：放大倍數(shù)為100，指的是長(zhǎng)度是1m的標(biāo)本

3、，放大后像的長(zhǎng)度是100m，要是以面積計(jì)算，則放大了10,000倍。 顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。 、數(shù)值孔徑也叫鏡口率，簡(jiǎn)寫(xiě)NA 或A，是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，與顯微鏡的分辨力成正比。干燥物鏡的數(shù)值孔徑為0.05-0.95，油浸物鏡（香柏油）的數(shù)值孔徑為1.25。 、工作距離是指當(dāng)所觀察的標(biāo)本最清楚時(shí)物鏡的前端透鏡下面到標(biāo)本的蓋玻片上面的距離。物鏡的工作距離與物鏡的焦距有關(guān)，物鏡的焦距越長(zhǎng)，放大倍數(shù)越低，其工作距離越長(zhǎng)。例：10倍物鏡上標(biāo)有10/0.25和160/0.17，其中10為物鏡的放大倍數(shù)；0.25為數(shù)值孔徑；160為鏡筒長(zhǎng)度（單位mm）；0.17為蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)

4、厚度（單位 mm）。10倍物鏡有效工作距離為6.5mm，40倍物鏡有效工作距離為0.48mm 。 3、物鏡的作用是將標(biāo)本作第一次放大，它是決定顯微鏡性能的最重要的部件分辨力的高低。 分辨力也叫分辨率或分辨本領(lǐng)。分辨力的大小是用分辨距離（所能分辨開(kāi)的兩個(gè)物點(diǎn)間的最小距離）的數(shù)值來(lái)表示的。在明視距離（25cm）之處，正常人眼所能看清相距0.073mm的兩個(gè)物點(diǎn)，這個(gè)0.073mm的數(shù)值，即為正常人眼的分辨距離。顯微鏡的分辨距離越小，即表示它的分辨力越高，也就是表示它的性能越好。 顯微鏡的分辨力的大小由物鏡的分辨力來(lái)決定的，而物鏡的分辨力又是由它的數(shù)值孔徑和照明光線的波長(zhǎng)決定的。 當(dāng)用普通的中央照明

5、法（使光線均勻地透過(guò)標(biāo)本的明視照明法）時(shí)，顯微鏡的分辨距離為d=0.61/NA 式中d物鏡的分辨距離，單位 nm。 照明光線波長(zhǎng)，單位 nm。 NA 物鏡的數(shù)值孔徑 例如油浸物鏡的數(shù)值孔徑為1.25，可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍為400700nm ，取其平均波長(zhǎng)550 nm，則d=270 nm，約等于照明光線波長(zhǎng)一半。一般地，用可見(jiàn)光照明的顯微鏡分辨力的極限是0.2m。 （二）、目鏡 因?yàn)樗拷^察者的眼睛，因此也叫接目鏡。安裝在鏡筒的上端。 1、目鏡的結(jié)構(gòu) 通常目鏡由上下兩組透鏡組成，上面的透鏡叫做接目透鏡，下面的透鏡叫做會(huì)聚透鏡或場(chǎng)鏡。上下透鏡之間或場(chǎng)鏡下面裝有一個(gè)光闌（它的大小決定了視場(chǎng)的大?。?，因?yàn)?/p>

6、標(biāo)本正好在光闌面上成像，可在這個(gè)光闌上粘一小段毛發(fā)作為指針，用來(lái)指示某個(gè)特點(diǎn)的目標(biāo)。也可在其上面放置目鏡測(cè)微尺，用來(lái)測(cè)量所觀察標(biāo)本的大小。 目鏡的長(zhǎng)度越短，放大倍數(shù)越大（因目鏡的放大倍數(shù)與目鏡的焦距成反比）。 2、目鏡的作用 是將已被物鏡放大的，分辨清晰的實(shí)像進(jìn)一步放大，達(dá)到人眼能容易分辨清楚的程度。 常用目鏡的放大倍數(shù)為516倍。 3、目鏡與物鏡的關(guān)系 物鏡已經(jīng)分辨清楚的細(xì)微結(jié)構(gòu)，假如沒(méi)有經(jīng)過(guò)目鏡的再放大，達(dá)不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚；但物鏡所不能分辨的細(xì)微結(jié)構(gòu)，雖然經(jīng)過(guò)高倍目鏡的再放大，也還是看不清楚，所以目鏡只能起放大作用，不會(huì)提高顯微鏡的分辨率。有時(shí)雖然物鏡能分辨開(kāi)兩個(gè)靠得很

7、近的物點(diǎn)，但由于這兩個(gè)物點(diǎn)的像的距離小于眼睛的分辨距離，還是無(wú)法看清。所以，目鏡和物鏡即相互聯(lián)系，又彼此制約。 （三）、聚光器 聚光器也叫集光器。位于標(biāo)本下方的聚光器支架上。它主要由聚光鏡和可變光闌組成。其中，聚光鏡可分為明視場(chǎng)聚光鏡（普通顯微鏡配置）和暗視場(chǎng)聚光鏡。 1、光鏡的主要參數(shù) 數(shù)值孔徑（NA ）是聚光鏡的主要參數(shù)，最大數(shù)值孔徑一般是1.21.4，數(shù)值孔徑有一定的可變范圍，通?？淘谏戏酵哥R邊框上的數(shù)字是代表最大的數(shù)值孔徑，通過(guò)調(diào)節(jié)下部可變光闌的開(kāi)放程度，可得到此數(shù)字以下的各種不同的數(shù)值孔徑，以適應(yīng)不同物鏡的需要。有的聚光鏡由幾組透鏡組成，最上面的一組透鏡可以卸掉或移出光路，使聚光鏡的

8、數(shù)值孔徑變小，以適應(yīng)低倍物鏡觀察時(shí)的照明。 2、聚光鏡的作用 聚光鏡的作用相當(dāng)于凸透鏡，起會(huì)聚光線的作用，以增強(qiáng)標(biāo)本的照明。一般地把聚光鏡的聚光焦點(diǎn)設(shè)計(jì)在它上端透鏡平面上方約1.25mm處。（聚光焦點(diǎn)正在所要觀察的標(biāo)本上，載玻片的厚度為1.1mm左右） 3、可變光闌 可變光闌也叫光圈，位于聚光鏡的下方，由十幾張金屬薄片組成，中心部分形成圓孔。其作用是調(diào)節(jié)光強(qiáng)度和使聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑相適應(yīng)。可變光闌開(kāi)得越大，數(shù)值孔徑越大（觀察完畢后，應(yīng)將光圈調(diào)至最大）。 在可變光闌下面，還有一個(gè)圓形的濾光片托架。 說(shuō)明：在中學(xué)實(shí)驗(yàn)室只有教師用顯微鏡（1600或1500）才配有聚光器，學(xué)生用顯微鏡（

9、640或500）配的是旋轉(zhuǎn)光欄。緊貼在載物臺(tái)下，能做圓周轉(zhuǎn)動(dòng)的圓盤，旋轉(zhuǎn)光欄（也稱為遮光器），光欄上有大小不等的圓孔，叫光圈。直徑分別為2、3、6、12、16mm,轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)光欄，光欄上每個(gè)光圈都可以對(duì)正通光孔，通過(guò)大小不等的光圈來(lái)調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。 （四）反光鏡 反光鏡是一個(gè)可以隨意轉(zhuǎn)動(dòng)的雙面鏡，直徑為50mm，一面為平面，一面為凹面，其作用是將從任何方向射來(lái)的光線經(jīng)通光孔反射上來(lái)。平面鏡反射光線的能力較弱，是在光線較強(qiáng)時(shí)使用，凹面鏡反射光線的能力較強(qiáng)，是在光線較弱時(shí)使用。 反光鏡通常一面是平面鏡，另一面是凹面鏡，裝在聚光器下面，可以在水平與垂直兩個(gè)方向上任意旋轉(zhuǎn)。 反光鏡的作用是使由光源發(fā)出的

10、光線或天然光射向聚光器。當(dāng)用聚光器時(shí)一般用平面鏡，不用時(shí)用凹面鏡；當(dāng)光線強(qiáng)時(shí)用平面鏡，弱時(shí)用凹面鏡。 觀察完畢后，應(yīng)將反光鏡垂直放置。 （五）照明光源 顯微鏡的照明可以用天然光源或人工光源 1、天然光源 光線來(lái)自天空，最好是由白云反射來(lái)的。不可利用直接照來(lái)的太陽(yáng)光。 2、人工光源 、對(duì)人工光源的基本要求：有足夠的發(fā)光強(qiáng)度；光源發(fā)熱不能過(guò)多。 、常用的人工光源：顯微鏡燈；日光燈 （六）濾光器 安裝在光源和聚光器之間。作用是讓所選擇的某一波段的光線通過(guò)，而吸收掉其他的光線，即為了改變光線的光譜成分或削弱光的強(qiáng)度。分為兩大類：濾光片和液體濾光器。 （七）蓋玻片和載玻片 蓋玻片和載玻片的表面應(yīng)相當(dāng)平坦

11、，無(wú)氣泡，無(wú)劃痕。最好選用無(wú)色，透明度好的，使用前應(yīng)洗凈。 蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度是0.170.02mm，如不用蓋玻片或蓋玻片厚度不合適，都回影響成像質(zhì)量。 載玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度是1.10.04mm，一般可用范圍是11.2mm，若太厚會(huì)影響聚光器效能，太薄則容易破裂。 二、顯微鏡的機(jī)械裝置 顯微鏡的機(jī)械裝置是顯微鏡的重要組成部分。其作用是固定與調(diào)節(jié)光學(xué)鏡頭，固定與移動(dòng)標(biāo)本等。主要有鏡座、鏡臂、載物臺(tái)、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、與調(diào)焦裝置組成。 （一）、鏡座和鏡臂 1、鏡座 作用是支撐整個(gè)顯微鏡，裝有反光鏡，有的還裝有照明光源。 2、鏡臂 作用是支撐鏡筒和載物臺(tái)。分固定、可傾斜兩種。 （二）、載物臺(tái)（又稱工作臺(tái)、

12、鏡臺(tái)） 載物臺(tái)作用是安放載玻片，形狀有圓形和方形兩種，其中方形的面積為120mm110mm。中心有一個(gè)通光孔，通光孔后方左右兩側(cè)各有一個(gè)安裝壓片夾用的小孔。分為固定式與移動(dòng)式兩種。有的載物臺(tái)的縱橫坐標(biāo)上都裝有游標(biāo)尺，一般讀數(shù)為0.1mm，游標(biāo)尺可用來(lái)測(cè)定標(biāo)本的大小，也可用來(lái)對(duì)被檢部分做標(biāo)記。 （三）、鏡筒 鏡筒上端放置目鏡，下端連接物鏡轉(zhuǎn)換器。分為固定式和可調(diào)節(jié)式兩種。機(jī)械筒長(zhǎng)（從目鏡管上緣到物鏡轉(zhuǎn)換器螺旋口下端的距離稱為鏡筒長(zhǎng)度或機(jī)械筒長(zhǎng)）不能變更的叫做固定式鏡筒，能變更的叫做調(diào)節(jié)式鏡筒，新式顯微鏡大多采用固定式鏡筒，國(guó)產(chǎn)顯微鏡也大多采用固定式鏡筒，國(guó)產(chǎn)顯微鏡的機(jī)械筒長(zhǎng)通常是160mm。 安

13、裝目鏡的鏡筒，有單筒和雙筒兩種。單筒又可分為直立式和傾斜式兩種，雙筒則都是傾斜式的。其中雙筒顯微鏡，兩眼可同時(shí)觀察以減輕眼睛的疲勞。雙筒之間的距離可以調(diào)節(jié)，而且其中有一個(gè)目鏡有屈光度調(diào)節(jié)（即視力調(diào)節(jié)）裝置，便于兩眼視力不同的觀察者使用。 （四）、物鏡轉(zhuǎn)換器 物鏡轉(zhuǎn)換器固定在鏡筒下端，有34個(gè)物鏡螺旋口，物鏡應(yīng)按放大倍數(shù)高低順序排列。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器時(shí)，應(yīng)用手指捏住旋轉(zhuǎn)碟旋轉(zhuǎn)，不要用手指推動(dòng)物鏡，因時(shí)間長(zhǎng)容易使光軸歪斜，使成像質(zhì)量邊壞。 （五）、調(diào)焦裝置 顯微鏡上裝有粗準(zhǔn)焦螺旋和細(xì)準(zhǔn)焦螺旋。有的顯微鏡粗準(zhǔn)焦螺旋與裝在同一軸上，大螺旋為粗準(zhǔn)焦螺旋，小螺旋為細(xì)準(zhǔn)焦螺旋；有的則分開(kāi)安置，位于鏡臂的上端較

14、大的一對(duì)螺旋為是粗準(zhǔn)焦螺旋，其轉(zhuǎn)動(dòng)一周，鏡筒上升或下降10mm。 位于粗準(zhǔn)焦螺旋下方較小的一對(duì)螺旋為細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，其轉(zhuǎn)動(dòng)一周，鏡筒升降值為0.1mm，細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)焦范圍不小于1.8mm。 三、顯微鏡及其部件的使用 1、使用單筒顯微鏡時(shí)，要養(yǎng)成用左眼觀察的習(xí)慣（因一般用右手畫(huà)圖），觀察時(shí)要兩眼同時(shí)睜開(kāi)，不要睜一只閉一只，因?yàn)檫@樣易于疲勞。為了訓(xùn)練學(xué)生習(xí)慣于兩眼同時(shí)睜開(kāi)觀察，可剪一塊長(zhǎng)約14cm，寬約6cm的長(zhǎng)方形硬紙片，在靠近左端處挖一個(gè)直徑比鏡筒上端外徑略小的圓孔，把圓孔套在鏡筒上段，觀察時(shí)兩眼同時(shí)睜開(kāi)，利用紙片的右端擋住右眼的視線，這樣訓(xùn)練一段時(shí)間后，就能習(xí)慣于兩眼同時(shí)睜開(kāi)，然后把紙片去掉。

15、2、直筒顯微鏡的鏡臂與鏡座連接處，是一個(gè)機(jī)械關(guān)節(jié)，可用于調(diào)節(jié)鏡筒的傾斜度，便于觀察，鏡臂不能過(guò)于后傾，一般不超過(guò)40。但是在使用臨時(shí)裝片觀察時(shí)，禁止使用傾斜關(guān)節(jié)（當(dāng)鏡筒傾斜時(shí)，載物臺(tái)也隨之傾斜，載玻片上的液體易流出），尤其是裝片內(nèi)含酸性試劑時(shí)嚴(yán)禁使用，以免污損鏡體。 3、目鏡和物鏡的使用 一般都是用一個(gè)放大倍數(shù)適中的目鏡（10）和最低倍的物鏡開(kāi)始觀察，逐步改用倍數(shù)較高的物鏡，從中找到符合實(shí)驗(yàn)要求的放大倍數(shù)。 轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，先用低倍鏡觀察，調(diào)節(jié)到正確的工作距離（成像最清晰）。如果進(jìn)一步使用高倍物鏡觀察，應(yīng)在轉(zhuǎn)換高倍物鏡之前，把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央（將低倍物鏡轉(zhuǎn)換成高倍物鏡觀察時(shí)，視

16、野中的物像范圍縮小了很多）。低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦（同高調(diào)焦），在用低倍物鏡觀察清晰時(shí)，換高倍物鏡應(yīng)可以見(jiàn)到物像，但物像不一定很清晰，可以轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋進(jìn)行調(diào)節(jié)。 通常認(rèn)為，使用任何一個(gè)物鏡時(shí)，有效放大倍數(shù)的上限是1，000乘它的數(shù)值孔徑，下限是250乘它的數(shù)值孔徑。如40物鏡的數(shù)值孔徑是0.65，則上、下限分別為：10000.65=650倍和2500.65163倍，超過(guò)有效放大倍數(shù)上限的叫做無(wú)效放大，不能提高觀察效果。低于下限的放大倍數(shù)則人眼無(wú)法分辨，不利于觀察。一般最實(shí)用的放大倍數(shù)范圍是500700乘數(shù)值孔徑之間的數(shù)字。 4、油浸物鏡的使用 使用油浸物鏡時(shí)，一般不要使用同高調(diào)焦。同高調(diào)

17、焦只適用于每臺(tái)顯微鏡的原配物鏡，在使用低倍和高倍物鏡時(shí)，是一個(gè)極有利的方便條件，但在使用油浸物鏡時(shí)，則受到一定限制，一般地說(shuō)，用油鏡觀察未加蓋玻片的標(biāo)本片（載玻片）時(shí)，利用同高調(diào)焦的安全度較大，而對(duì)于有蓋玻片的標(biāo)本片，要小心使用，因?yàn)橛徒镧R的工作距離很短，在設(shè)計(jì)和裝配時(shí)所考慮的同高是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)厚度蓋玻片的。 用油浸物鏡時(shí)，只在標(biāo)本片上滴香柏油。觀察完畢后，要及時(shí)進(jìn)行清潔工作，如不及時(shí)進(jìn)行，香柏油粘上灰塵，擦拭時(shí)灰塵粒子可能磨損透鏡，香柏油在空氣中暴露時(shí)間長(zhǎng)，還會(huì)變稠、變干，擦拭很困難，對(duì)儀器很不利。擦拭要細(xì)心，動(dòng)作要輕。油浸物鏡前端先用干的擦鏡紙擦一兩次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦

18、兩次，最后再用干的擦鏡紙擦一次。標(biāo)本片上的香柏油可用“拉紙法”（即把一小張擦鏡紙蓋在香柏油上，然后在紙上滴一些二甲苯，趁濕把紙往外拉，這樣連續(xù)三四次，即可干凈，一般不會(huì)損壞未加蓋玻片的涂片標(biāo)本）擦凈。擦鏡紙也要防塵，一般在使用前，將每頁(yè)剪成8小塊，貯存在一個(gè)干凈的小培養(yǎng)皿中，用起來(lái)既節(jié)省又方便。 5、聚光器的使用方法 、使用聚光器的原因 當(dāng)放大倍數(shù)增加時(shí)，一方面由于放大倍數(shù)越高，透鏡數(shù)目越多，被透鏡吸收的光線也越多；另一方面由于視場(chǎng)（指的是所能看到被檢標(biāo)本的范圍）的亮度與放大倍數(shù)的平方成反比，即放大倍數(shù)越高，視場(chǎng)越暗。為了得到足夠的亮度，必須安裝聚光器，把光線集中到所要觀察的標(biāo)本上。 、觀察時(shí)聚光器應(yīng)處的高度 觀察時(shí)，要保證得到最好的觀察效果，聚光器的聚光焦點(diǎn)應(yīng)正好落在標(biāo)本上。要實(shí)現(xiàn)這個(gè)條件，就必須調(diào)節(jié)聚光器的高度。當(dāng)用平行光照明