HPLC原理及應用

1、HPLC原理及應用原理及應用 苯濃度的測定方法苯濃度的測定方法實驗目的實驗目的 熟悉熟悉HPLC的工作原理的工作原理 熟悉熟悉HPLC在醫(yī)療實踐中的應用在醫(yī)療實踐中的應用 新藥研究新藥研究 藥品生產藥品生產 TDM 其他測定，如毒物，代謝產物，活性物質其他測定，如毒物，代謝產物，活性物質 了解了解HPLC在生物醫(yī)學科研方面的應用在生物醫(yī)學科研方面的應用 了解了解HPLC的操作方法的操作方法 了解生物樣品了解生物樣品(血、體液、組織血、體液、組織)處理過程處理過程High Performance Liquid Chromatography，HPLC Chromatography:最早源于對植物色

2、素物最早源于對植物色素物質的提取，呈現(xiàn)不同顏色的譜帶，故叫質的提取，呈現(xiàn)不同顏色的譜帶，故叫色色譜譜。流動相色譜的分類色譜的分類1 根據(jù)流動相根據(jù)流動相 以氣體作流動相以氣體作流動相氣相色譜氣相色譜(Gas Chromatography,GC) 固定相為液體固定相為液體 氣氣-液色譜液色譜 固定相為固體固定相為固體 氣氣-固色譜固色譜 以液體作流動相以液體作流動相液相色譜液相色譜(Liquid Chromatography,LC) 固定相為液體固定相為液體 液液-液色譜液色譜 固定相為固體固定相為固體 液液-固色譜固色譜 超臨界色譜超臨界色譜流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工流動相是在接近它

3、的臨界溫度和壓力下工作的液體作的液體色譜的分類色譜的分類2 根據(jù)固定相的附著方式根據(jù)固定相的附著方式 柱色譜柱色譜固定相裝在圓柱管中固定相裝在圓柱管中 平板色譜平板色譜 薄膜色譜薄膜色譜固定相涂敷在玻璃或金屬板上固定相涂敷在玻璃或金屬板上 紙色譜紙色譜液體固定相涂在紙上液體固定相涂在紙上色譜的分類色譜的分類3 根據(jù)極性根據(jù)極性 反相反相色譜色譜流動相極性固定相極性流動相極性固定相極性 正相色譜正相色譜流動相極性固定相極性流動相極性固定相極性色譜的分類色譜的分類4 根據(jù)分離機理根據(jù)分離機理 分配色譜分配色譜樣品組分的分配系數(shù)不同樣品組分的分配系數(shù)不同 吸附色譜吸附色譜 樣品組分對固定相表面吸附力

4、不同樣品組分對固定相表面吸附力不同 體積排阻色譜體積排阻色譜利用固定相孔徑不同，把樣品利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開組分按分子大小分開 離子交換色譜離子交換色譜不同離子與固定相內相反電荷不同離子與固定相內相反電荷間的作用力大小不同間的作用力大小不同基本原理基本原理 用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等比例的混合溶劑、緩沖液等流動相流動相(mobile phase，即兩相中移動的一相，即兩相中移動的一相)泵入裝有泵入裝有固定相固定相(stationary phase，即兩相中固定不動的一相，即兩相中固定不動的一

5、相)的的色譜柱色譜柱,經進樣閥注入經進樣閥注入供試品供試品,由流動相帶入柱由流動相帶入柱內內,由于溶于流動相中的各組分經過固定相時與固由于溶于流動相中的各組分經過固定相時與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間固定相中滯留時間不同不同，不同的物質順序離開色譜柱，不同的物質順序離開色譜柱,從而先后從固從而先后從固定相中流出。在柱內各成分被分離后定相中流出。在柱內各成分被分離后,通過通過檢測器檢測器得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些信號得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些信號來

6、判斷待側物所含有的物質。來判斷待側物所含有的物質?；靖拍罨靖拍?. 色譜圖色譜圖(chromatogram)樣品流經色譜柱和檢測器，樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile) 。2. 基線基線(base line)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。3. 色譜峰色譜峰(peak)組分流經檢測器時相應的連續(xù)信號產生組分流經檢測器時相應的連續(xù)信號產生的曲線。流出曲線上的突

7、起部分。正常色譜峰近似于對稱的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱性正態(tài)分布曲線性正態(tài)分布曲線(高斯高斯Gauss曲線曲線) 。不對稱色譜峰有兩種：。不對稱色譜峰有兩種：前延峰前延峰(leading peak) 和拖尾峰和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。前者少見。4. 保留時間保留時間(retention time,tR)從進樣開始到某個組分從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。5. 峰底峰底(peak base)基線上峰的起點至終點的距離?；€上峰的起點至終點的距離。6. 峰高峰高(peak height,h)峰的最高點至峰底的

8、距離。峰的最高點至峰底的距離。7. 峰寬峰寬(peak width,W)峰兩側峰兩側拐點拐點處所作兩條切線與基處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。線的兩個交點間的距離。W=4。8. 標準偏差標準偏差(standard error,)0.607倍峰高處所對應峰倍峰高處所對應峰寬之一半。寬之一半。9. 半峰寬半峰寬(peak width at half-height,Wh/2)峰高一半處峰高一半處的峰寬。的峰寬。W h/22.355。10. 峰面積峰面積(peak area,A)峰與峰底所包圍的面積。峰與峰底所包圍的面積。 A=2.507h=1.064Wh/2h11. 死時間死時間(dead

9、time,tM)不被固定相滯留的組分，從進不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。12.死體積死體積(dead volume,VM)不被固定相滯留的組分，不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的載氣從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的載氣(液液)體積。體積。HPLC 系統(tǒng)：系統(tǒng)： Waters Alliance HPLC System; Waters 2420 ELSD層析管柱：層析管柱： Waters Carbohydrate Analysis Column 3.9 300 mm移動相：移動相： CH3CN:H2O = 75:25流速：流速： 1.4m

10、L/min at 35 五種單糖五種單糖(Fructose,Glucose) 及雙糖及雙糖(Sucrose ,Maltose,Lactose)分析結果分析結果吸附色譜吸附色譜（adsorption chromatography） 分離原理：固定相是固體分離原理：固定相是固體吸附劑吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物，吸附劑是多孔性微粒物質，表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中心。質，表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留時間各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留時間不同和實現(xiàn)分離。不同和實現(xiàn)分離。 固定相：固定相： 固定相通常是固定相

11、通常是強極性強極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑。聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑?；钚怨枘z最常用活性硅膠最常用。 流動相：流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。乙腈等。 應用：應用： 對于極性，結構異構體分離和族分離仍是最有效對于極性，結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法，如農藥異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離。的方法，如農藥異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離。

12、 缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現(xiàn)象。缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現(xiàn)象。分配色譜分配色譜(partition chromatography) 原理：原理： 固定液機械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據(jù)固定液機械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據(jù)他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進入兩相分他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進入兩相分配而實現(xiàn)分離。配而實現(xiàn)分離。 固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。 分類：根據(jù)極性不同分類：根據(jù)極性不同 正相分配色譜正相分配色譜固定相載體上

13、涂布的是極性固定液；固定相載體上涂布的是極性固定液；流動相是非極性溶劑；流動相是非極性溶劑；可分離極性較強的水溶性樣品；可分離極性較強的水溶性樣品；弱極性組分先洗脫出來。弱極性組分先洗脫出來。 反相分配色譜反相分配色譜固定相載體上涂布的是非極性或弱極性固定液；固定相載體上涂布的是非極性或弱極性固定液；流動相是極性溶劑；流動相是極性溶劑；強極性組分先洗脫出來。強極性組分先洗脫出來。 液液-液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現(xiàn)性很差，且不能進行梯度洗脫，已經不相中去，所以重現(xiàn)性很差，且不能進行梯度洗脫，已經不大為人們所采用。大

14、為人們所采用。鍵合相色譜鍵合相色譜(bonded phase chromatography ) 原理：將各種不同的有機官能團通過化學反應原理：將各種不同的有機官能團通過化學反應共價結合共價結合到固定相惰性到固定相惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。鍵合固定相優(yōu)點：鍵合固定相優(yōu)點： 對極性有機溶劑有良好的化學穩(wěn)定性對極性有機溶劑有良好的化學穩(wěn)定性 使色譜柱的柱效高、壽命長使色譜柱的柱效高、壽命長 實驗重現(xiàn)性好實驗重現(xiàn)性好 幾乎適于各種類型的有機化合物的分離幾乎適于各種類型的有機化合物的分離 可以梯度洗脫可以梯度洗脫分類：根據(jù)極性不同分類：根據(jù)極性不

15、同 正相鍵合相色譜正相鍵合相色譜固定相極性流動相極性固定相極性流動相極性固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。適于分離固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。適于分離脂類、水溶性的極性、強極性化合物脂類、水溶性的極性、強極性化合物 正相正相HPLC（normal phase HPLC）：是由極性固定相和非極性（或弱極性）：是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC

16、。 反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜固定相極性流動相極性固定相極性流動相極性固定相：烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的固定相：烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS柱或柱或C18柱就柱就是最典型的代表，其極性很小。適于分離非極性、弱極性離子型樣品，是最典型的代表，其極性很小。適于分離非極性、弱極性離子型樣品，是當今液相色譜的是當今液相色譜的最主要分離模式最主要分離模式。 反相反相HPLC（reversed phase HPLC）：）： 由非極性固定相和極性流動相所組由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷

17、體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠基鍵合硅膠(ODS柱，柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流動相是甲醇，代表性的流動相是甲醇和乙腈。和乙腈。體積排阻色譜體積排阻色譜（size exclusion chromatograghy，SEC） 又稱凝膠色譜和分子篩色譜又稱凝膠色譜和分子篩色譜 原理：原理： 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯酰胺等）作固定相，依據(jù)樣品分子量大小聚丙烯酰胺等）作固定相，依據(jù)樣品分子量大小達到分離目的。大分子不進入凝膠孔洞，沿多孔達到分離目的。大分子不進入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙

18、流出，先被洗脫；小分子進入大部凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進入大部分凝膠孔洞，在柱中被強滯留，后被洗脫。分凝膠孔洞，在柱中被強滯留，后被洗脫。 分類：根據(jù)樣品性質分類：根據(jù)樣品性質 凝膠過濾（凝膠過濾（GFC）用于分析水溶性樣品，如多肽、用于分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖。蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖。 凝膠滲透（凝膠滲透（GPC）用于分析脂溶性樣品，如測定高用于分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。聚物的分子量。離子交換色譜離子交換色譜（ion exchange chromatography, IEC） 分離原理：使用表面有離子交換基團

19、的離分離原理：使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團團(如磺酸基和羧酸基如磺酸基和羧酸基)可以用于陽離子的分可以用于陽離子的分離；帶正電荷的交換基團離；帶正電荷的交換基團(如季胺鹽如季胺鹽)可以用可以用于陰離子的分離。不同離子與交換基的作于陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離。不同，從而被相互分離。HPLC組成組成 HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中測器、數(shù)據(jù)記錄

20、及處理裝置等組成。其中輸液泵、輸液泵、色譜柱、檢測器色譜柱、檢測器是關鍵部件。是關鍵部件。 有的儀器還有有的儀器還有梯度洗脫梯度洗脫裝置、裝置、在線脫氣機在線脫氣機、自動、自動進樣器、預柱或保護柱、進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器柱溫控制器等。等。 現(xiàn)代現(xiàn)代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng)，進行自動化儀儀還有微機控制系統(tǒng)，進行自動化儀器控制和器控制和數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理。 制備型制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。儀還備有自動餾分收集裝置。 輸液泵輸液泵 輸液泵是輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個質量和分析結果的可靠性能好壞直接影響到整個質

21、量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能性。輸液泵應具備如下性能: 流量穩(wěn)定，其流量穩(wěn)定，其RSD(Relative Standard Deviation)應應0.5，這對定性定量的準確性至，這對定性定量的準確性至關重要；關重要； 流量范圍寬，分析型應在流量范圍寬，分析型應在0.110ml/min范圍內范圍內連續(xù)可調，制備型應能達到連續(xù)可調，制備型應能達到100ml/min； 輸出壓力高，一般應能達到輸出壓力高，一般應能達到150300kg/cm2： 液缸容積小；液缸容積小； 密封性能好，耐腐蝕。密封性能好，耐腐蝕。泵的分類泵的分類 泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵的種類很多，按輸液性質

22、可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔往復泵。恒壓泵注射泵、柱塞往復泵和隔往復泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵己被淘汰。目前應用最多的大，這兩種泵己被淘汰。目前應用最多的是柱塞往復泵。柱塞往復泵的液缸容積小，是柱塞往復泵。柱塞往復泵的液缸容積小，可至可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫。特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫。泵的使用和維護注意事項泵的使用和維護注意事項 防止任何固體微粒進入泵體，因為塵?；蚱渌魏畏乐谷魏?/p>

23、固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因雜質微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。此應預先除去流動相中的任何固體微粒。 流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在柱內，尤其是在停泵過夜或更長時間動相不應保留在柱內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。的情況下。 泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產生則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產生漏液。漏液。 輸

24、液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產生漏液。則會使高壓密封環(huán)變形，產生漏液。 流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性。如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。量的穩(wěn)定性。如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。梯度洗脫梯度洗脫 HPLC有等強度（有等強度（isocratic）和梯度）和梯度（gradient）洗脫兩種方式。）洗脫兩種方式。等度洗脫等度洗脫是在同一是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數(shù)分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數(shù)目較少，性質差別不大的

25、樣品。目較少，性質差別不大的樣品。梯度洗脫梯度洗脫是在一是在一個周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、個周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和離子強度和pH值等，用于分析組分數(shù)目多、性質值等，用于分析組分數(shù)目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。 進樣器進樣器 早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用柱入口處?，F(xiàn)在大

26、都使用六通進樣閥六通進樣閥或自或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。閥進樣、自動進樣。 六通進樣閥六通進樣閥 一般一般HPLC分析常采用六通進樣閥。六通閥進分析常采用六通進樣閥。六通閥進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。 用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環(huán)用部分裝液法進樣時，進樣量應

27、不大于定量環(huán)體積的體積的50(最多最多75)，并要求每次進樣體積準，并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于取確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。 用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環(huán)用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環(huán)體積的體積的510倍倍9最少最少3倍），這樣才能完全置換倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內和流動相，消除管壁效應，確保進樣的定量環(huán)內和流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。準確度及重復性。 六通閥使用和維護注意事項六通閥使用和維護注意事項 樣品溶液進樣

28、前必須用樣品溶液進樣前必須用0.45m濾膜過濾，濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。以減少微粒對進樣閥的磨損。 轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；轉到進樣位增，甚至超過泵的最大壓力；轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。時，過高的壓力將使柱頭損壞。 為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水

29、沖洗。再用水沖洗。 色譜柱色譜柱 色譜是一種分離分析手段，分離是核心，色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。好，分析速度快等。 柱的使用和維護注意事項柱的使用和維護注意事項 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。 應逐漸改變溶劑的組成，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿繎饾u改變溶劑的組成，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。是水，反之亦然?一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖

30、一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去柱關的雜質時，才可以反沖除去柱關的雜質, ,否則反沖會迅速降低柱效。否則反沖會迅速降低柱效。 選擇使用適宜的流動相選擇使用適宜的流動相, ,尤其是尤其是pHpH，以避免固定相被破壞。，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱。有時可以在進樣器前面連接一預柱。 避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱骨避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱骨, ,需需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有固定相的短柱，保護柱可以而且護柱。保護

31、柱一般是填有固定相的短柱，保護柱可以而且應該經常更換。應該經常更換。 經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質，在進經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質，在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的2020倍左右，即倍左右，即常規(guī)分析需要常規(guī)分析需要50-7550-75l l。檢測器檢測器檢測器是檢測器是HPLC儀三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中儀三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變?yōu)殡娦盘?。組分的量轉變?yōu)殡娦盘枴PLC的檢測器要

32、求靈敏度高、的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。寬、重復性好和適用范圍廣。 按原理分類可把檢測器分為按原理分類可把檢測器分為:光學檢測器（如光學檢測器（如紫外紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散熱）、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散熱）熱學檢測器（如吸附熱）熱學檢測器（如吸附熱）電化學檢測器（如極譜、庫侖、安培）電化學檢測器（如極譜、庫侖、安培）電學檢測器（如電導、介電常數(shù)）電學檢測器（如電導、介電常數(shù)）放射性檢測器（如閃爍計數(shù)、電子捕獲）放射性檢測器（如閃爍計數(shù)、電子捕獲）氫火焰離子化檢測器。氫

33、火焰離子化檢測器。紫外檢測器紫外檢測器(ultraviolet detector) 紫外檢測器是紫外檢測器是HPLC中應用最廣泛的檢測中應用最廣泛的檢測器，當檢測波長為可見光時，又稱為紫外器，當檢測波長為可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高、噪音低、線性可見檢測器。它靈敏度高、噪音低、線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏度高，因此即使是那些備色譜。由于靈敏度高，因此即使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質也可用紫外光吸收小、消光系數(shù)低的物質也可用紫外檢測器進行微量分析。但要注意流動相中檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外

34、吸收截止波長。各種溶劑的紫外吸收截止波長。數(shù)據(jù)處理和計算機控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和計算機控制系統(tǒng) 計算機的用途包括三個方面：計算機的用途包括三個方面： （1）采集、處理和分析數(shù)據(jù)；）采集、處理和分析數(shù)據(jù)； （2）控制儀器；）控制儀器； （3）色譜系統(tǒng)化和專家系統(tǒng)。）色譜系統(tǒng)化和專家系統(tǒng)。使用范圍使用范圍 高效液相色譜法適用于分析高沸點不易揮發(fā)的、高效液相色譜法適用于分析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有機化合物；生物活性物質和多種天然產物；合成機化合物；生物活性物質和多種天然產物；合成的和天然的高分子化合物等。的和天然的高分子化合物

35、等。 它們涉及石油化工產品、食品、合成藥物、生物它們涉及石油化工產品、食品、合成藥物、生物化工產品及環(huán)境污染物等，約占全部有機化合物化工產品及環(huán)境污染物等，約占全部有機化合物的的80%。其余。其余20%的有機化合物，包括永久性氣的有機化合物，包括永久性氣體，易揮發(fā)低沸點及中等分子量的化合物，只能體，易揮發(fā)低沸點及中等分子量的化合物，只能用氣相色譜法進行分析。用氣相色譜法進行分析。流動相的處理流動相的處理 過濾溶劑過濾溶劑 溶劑在使用前一定要用溶劑在使用前一定要用0.5m的過濾器過濾，如的過濾器過濾，如果使用固體化學試劑（緩沖鹽）配制流動相，過果使用固體化學試劑（緩沖鹽）配制流動相，過濾特別重要

36、，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進樣濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進樣器和柱頭過濾片。過濾水溶性流動相時（如甲醇器和柱頭過濾片。過濾水溶性流動相時（如甲醇/水），先用水），先用1-2ml甲醇潤濕過濾膜，有助于快速甲醇潤濕過濾膜，有助于快速抽濾。抽濾。 保持儲液瓶的清潔保持儲液瓶的清潔 用普通溶劑瓶作流動相儲液器應不定期廢棄瓶子，用普通溶劑瓶作流動相儲液器應不定期廢棄瓶子，最后一次應用最后一次應用HPLC級的水或溶劑清洗，不能在級的水或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下污跡。清洗過程中留下污跡。 保證溶劑的質量保證溶劑的質量 一定要用一定要用HPLC級的溶劑，水也應達到級的溶劑，水也應達到HPL

37、C級，級，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。同樣也要使用高純度的緩沖鹽。 故障及解決方法故障及解決方法 故障故障1：流動相脫氣不充分：流動相脫氣不充分 原因：流動相受熱，或者流動相不同組分混原因：流動相受熱，或者流動相不同組分混合時會有氣體產生，氣泡進入泵內引起壓力合時會有氣體產生，氣泡進入泵內引起壓力波動，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺。波動，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺。 解決方法：流動相再脫氣；采用更有效的脫解決方法：流動相再脫氣；采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用；改系統(tǒng)內混合氣方法或兩種方法配合使用；改系統(tǒng)內混合為系統(tǒng)外預混合。為系統(tǒng)外預混合。故障故障2：流動相供給不暢：流動相供給不暢 原因

38、原因1：流動相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。：流動相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。解決辦法：解決辦法：1應經常觀察儲液器中流動相的量，加足流動相保證所有的樣品應經常觀察儲液器中流動相的量，加足流動相保證所有的樣品分析完畢。分析完畢。2輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲液器蓋上留一小孔正好夾輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲液器蓋上留一小孔正好夾住進液管，使其不能上下移動。住進液管，使其不能上下移動。原因原因2：過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過濾器被微粒所阻塞：過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過濾器被微粒所阻塞或長霉?；蜷L霉。解決辦法：去掉過濾器后如果系統(tǒng)運轉正常，說明已找出問

39、題，換上新的解決辦法：去掉過濾器后如果系統(tǒng)運轉正常，說明已找出問題，換上新的過濾器則可。有時候換上新的過濾器仍然不暢，那就需要查查流動相的過濾器則可。有時候換上新的過濾器仍然不暢，那就需要查查流動相的制備過程，或者換大孔徑的過濾器。不管如何，流動相都需要重新過濾。制備過程，或者換大孔徑的過濾器。不管如何，流動相都需要重新過濾。原因原因3：流速過高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管道內：流速過高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管道內徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10ml/min，常會出現(xiàn)這種，常會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。現(xiàn)象。解決辦

40、法：（解決辦法：（1）使用低流速；（）使用低流速；（2）換大孔徑的過濾器；（）換大孔徑的過濾器；（3）增加進液管）增加進液管道內徑；（道內徑；（4）抬高或加壓儲液器；（）抬高或加壓儲液器；（5）不用過濾器，但流動相一定要）不用過濾器，但流動相一定要先過濾；（先過濾；（6）儲液器蓋子太緊，在儲液器內形成真空，打出的流動相）儲液器蓋子太緊，在儲液器內形成真空，打出的流動相不連續(xù)。應松開蓋子或留有不連續(xù)。應松開蓋子或留有1mm的縫隙；（的縫隙；（7）進液管道阻塞或彎曲使）進液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調整進液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭泵抽不到液，注意調整進液管道或更換新的。其它問題

41、包括滲漏或接頭松動、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。松動、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。故障故障3：流動相和儲液器被污染：流動相和儲液器被污染 原因：由于污染，噪音越來越大，檢測器基線上升。污染物可能被泵原因：由于污染，噪音越來越大，檢測器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在色譜圖中以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時弱流動相可以使污染物聚在柱頂，流動不出多余的峰。用梯度洗脫時弱流動相可以使污染物聚在柱頂，流動相強度增加后污染物可能被洗脫出來一個大的偽峰。有時基線噪音突相強度增加后污染物可能被洗脫出

42、來一個大的偽峰。有時基線噪音突然增大或突然提高，都是因為反復加進新的流動相或系統(tǒng)用得太久然增大或突然提高，都是因為反復加進新的流動相或系統(tǒng)用得太久（通宵）所造成的。新加進的流動相有污染物或者流動相長霉，繁殖（通宵）所造成的。新加進的流動相有污染物或者流動相長霉，繁殖了細菌。臟的儲液器會污染清潔的流動相。每種流動相備有專用的儲了細菌。臟的儲液器會污染清潔的流動相。每種流動相備有專用的儲液器，或者定期報廢儲液器。液器，或者定期報廢儲液器。原因：流動相污染來自這幾個方面：試劑質量不高，玻璃器皿不合格；原因：流動相污染來自這幾個方面：試劑質量不高，玻璃器皿不合格；微生物的影響；配制流動相時操作不當?shù)取?/p>

43、微生物的影響；配制流動相時操作不當?shù)取?解決辦法：要求高純度化學試劑和解決辦法：要求高純度化學試劑和HPLC級溶劑。玻璃器皿按規(guī)定清洗級溶劑。玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈。為防止微生物生長，每天要用甲醇清洗系統(tǒng)。懷疑系統(tǒng)內生長干凈。為防止微生物生長，每天要用甲醇清洗系統(tǒng)。懷疑系統(tǒng)內生長了微生物，可用稀硝酸沖洗既可（注意不要損壞柱和管道系統(tǒng)）。真了微生物，可用稀硝酸沖洗既可（注意不要損壞柱和管道系統(tǒng)）。真空脫氣時防止泵油帶入流動相。用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和空脫氣時防止泵油帶入流動相。用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和玻璃器皿配制流動相。已經污染的流動相一定要廢棄掉。玻璃器皿配制流動相。已經污染的

44、流動相一定要廢棄掉。生物樣品處理原則生物樣品處理原則 生物樣品種類生物樣品種類 血血 體液體液 組織組織 處理原則處理原則 提取提取 純化純化 不破壞不破壞 易溶解易溶解苯濃度的測定苯濃度的測定 目的：目的： 原理：原理： 實驗器材：實驗器材： 試劑藥品：試劑藥品： 操作步驟：操作步驟：儀器、試劑及條件儀器、試劑及條件主要儀器主要儀器Waters 600 高效液相色譜儀高效液相色譜儀Waters 2487紫外檢測器紫外檢測器Auto science 真空脫氣儀真空脫氣儀色譜柱：菲羅門色譜柱：菲羅門 Gemini C18 250mm反相色譜柱反相色譜柱ChromStation 色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng) (version 5.3)主要試劑、藥品主要試劑、藥品苯苯 乙腈乙腈 超純水超純水 實驗條件實驗條件檢測波長：檢測波長：254nm流動相：乙腈：水流動相：乙腈：