分子討論：遺傳病的基因診斷郭蓉

1、遺傳病的基因診斷中南大學(xué)預(yù)防1502班郭蓉例：鐮狀紅細胞貧血癥2 用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)， 通過檢測基因及其表達產(chǎn)物的存在狀通過檢測基因及其表達產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對人體疾病作出診斷的方法。態(tài)，對人體疾病作出診斷的方法。對對人人Genetic Diagnosis / Molecular Diagnosis基因診斷基因診斷的概念的概念3基因診斷的特點基因診斷的特點高特異性：診斷目標高特異性：診斷目標高靈敏度：分子生物學(xué)方法高靈敏度：分子生物學(xué)方法早期診斷性：分子遺傳學(xué)規(guī)律早期診斷性：分子遺傳學(xué)規(guī)律應(yīng)用廣泛性：疾病與非疾病檢查應(yīng)用廣泛性：疾病與非疾病檢查4v 基本策略 檢測

2、：1）DNA探針與靶基因形成分子雜交或限制性內(nèi)切酶對特定位點的識別；2）PCR及基于PCR的各種檢測結(jié)果。5 Commonly used Techniques核酸分子雜交核酸分子雜交 限制性酶譜與限制性片段長度多態(tài)性限制性酶譜與限制性片段長度多態(tài)性寡核苷酸探針雜交寡核苷酸探針雜交PCR及其衍生技術(shù)及其衍生技術(shù)DNA序列測定序列測定DNA芯片芯片Western免疫印跡檢測免疫印跡檢測6（一）核酸分子雜交（一）核酸分子雜交（nucleic acid hybridization) 兩條互補的兩條互補的單鏈核酸單鏈核酸在一定條件（溫度、在一定條件（溫度、鹽離子等）下，按堿基互補的原則重新配鹽離子等）下

3、，按堿基互補的原則重新配對形成對形成雙鏈雙鏈的的過程過程 雜交雙方：探針與待檢核酸序列基因的特異性識別基因的特異性識別71.1.制備合適的探針是核酸雜交用于基因制備合適的探針是核酸雜交用于基因診斷的關(guān)鍵診斷的關(guān)鍵 What is a probe? 標記的標記的序列已知的序列已知的核酸片段，包括核酸片段，包括 DNA、cDNA、RNA及及oligonucleotides等等8放射性同位素：放射性同位素： 32P和和35S非放射性標記：熒光基團和非放射性標記：熒光基團和生物素生物素92. 核酸分子雜交流程核酸分子雜交流程 待測核酸制備待測核酸制備濾膜上核酸固定濾膜上核酸固定雜交雜交去除未雜交的探針

4、去除未雜交的探針檢測雜交信號檢測雜交信號核酸探針制備核酸探針制備探針標記探針標記加入標記探針加入標記探針10 經(jīng)典經(jīng)典Southern blot包括限制性內(nèi)切酶包括限制性內(nèi)切酶消化、酶切產(chǎn)物的消化、酶切產(chǎn)物的DNA印跡轉(zhuǎn)移和探針印跡轉(zhuǎn)移和探針的膜雜交三個部分。的膜雜交三個部分。11 Southern blot一般流程： 提取提取DNA 限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶消化DNA以產(chǎn)生特以產(chǎn)生特定長度的片段定長度的片段凝膠電泳分離凝膠電泳分離變性處理變性處理DNA轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合標記探標記探針與膜針與膜DNA雜交雜交反應(yīng)反應(yīng)結(jié)果檢測與分析結(jié)果檢測與分析12限制性酶切分

5、析限制性酶切分析(restriction enzyme mapping)（RE） 分析致病基因分析致病基因DNA中因點突變導(dǎo)致限制性中因點突變導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶識別切割位點消失或新生的變化情況。內(nèi)切酶識別切割位點消失或新生的變化情況。 多與多與PCR結(jié)合使用（結(jié)合使用（PCR-RE），），屬于直屬于直接診斷途徑接診斷途徑。 13酶切圖譜：某DNA分子（DNA大分子或基因組DNA等）以一或數(shù)種限制性核酸內(nèi)切酶消化切割所產(chǎn)生的一組DNA片段，根據(jù)其電泳速率差異獲得的凝膠電泳分離結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳（AGE）是用于分離具有不同大小DNA片段的最為普通的技術(shù)。瓊脂糖是一種被純化的線性半乳

6、多聚糖，可在熱的溶劑中熔化并在冷卻時形成凝膠。核酸分子結(jié)構(gòu)的重復(fù)性使核苷酸數(shù)相同的不同核酸幾乎具有等量的凈電荷，所有的DNA都具有大約相同的分子電量質(zhì)量比例，即核酸攜帶的電荷的差異幾乎不造成對核酸遷移率的差異，DNA片段的分離完全基于大小上的差異。在AGE中，顆?；蚱卧陔娏鞯淖饔孟仑灤┉傊悄z板（介質(zhì)）來移動，后者可作為一種分子篩起作用，較小的分子介質(zhì)要比較大的分子更快。顯像：DNA在凝膠中可用溴化乙錠（EB）來顯像。它可嵌入DNA堆積堿基之中，在UV線（紫外線）下呈現(xiàn)熒光，高濃度DNA在凝膠中呈一條帶狀。15聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng) (polymerase chain reactio

7、n, PCR）模板模板引物引物dNTP Mg2+ Taq DNA聚合聚合酶酶變性變性延伸延伸退火退火1617TemplatePrimersEnzymes1819 2 2 基因診斷中的基因診斷中的PCRPCR及其衍生技術(shù)及其衍生技術(shù)（1 1）直接運用）直接運用PCRPCR擴增：異常缺失與存在擴增：異常缺失與存在（2）PCR產(chǎn)物的限制性酶譜分析（產(chǎn)物的限制性酶譜分析（PCR-RE)和限制性片段長度多態(tài)性分析（和限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP) 通過通過PCRPCR將包含待測位點的將包含待測位點的DNADNA片段擴增后，片段擴增后，用識別相應(yīng)位點的限制性核酸內(nèi)切酶水解，根用識別相應(yīng)位點的

8、限制性核酸內(nèi)切酶水解，根據(jù)所產(chǎn)生限制性片段的數(shù)量和長度作出診斷。據(jù)所產(chǎn)生限制性片段的數(shù)量和長度作出診斷。20（一）血紅蛋白病（一）血紅蛋白病 血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)或珠蛋白肽鏈量的異常血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)或珠蛋白肽鏈量的異常所引起的一組遺傳性疾病。所引起的一組遺傳性疾病。異常血紅蛋白：異常血紅蛋白：珠蛋白基因突變導(dǎo)致珠蛋白鏈結(jié)構(gòu)異珠蛋白基因突變導(dǎo)致珠蛋白鏈結(jié)構(gòu)異常而出現(xiàn)臨床表現(xiàn)。常而出現(xiàn)臨床表現(xiàn)。地中海貧血：地中海貧血：珠蛋白基因的缺失或突變而導(dǎo)致某種蛋珠蛋白基因的缺失或突變而導(dǎo)致某種蛋白鏈合成障礙，造成合成白鏈合成障礙，造成合成鏈或鏈或鏈失去平衡而導(dǎo)致的鏈失去平衡而導(dǎo)致的溶血性貧血。溶血性貧血。血紅蛋

9、白：四分子珠蛋白,四分子亞鐵血紅素鐮狀紅細胞貧血癥谷氨酸親水，位點位于血紅蛋白分子外部。纈氨酸疏水，此位點不易與水結(jié)合，水溶性降低，膜的性質(zhì)改變微黏度增加，血紅蛋白分子彈性降低，相互聚集沉淀，形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。鏈從N末端開始第六位的氨基酸殘基，在正常的HbA分子中是谷氨酸，在病態(tài)的HbS分子中卻被纈氨酸代替。本質(zhì)（分子水平）：基因突變（堿基）診斷鐮狀紅細胞貧血癥的方法：1.RE-Southern blot 用放射性自顯影技術(shù)確定在X射線片上所顯示的與探針DNA雜交的條帶位置（與電泳條帶位置相同）采集制備血液DNA 內(nèi)切酶Mst消化電泳轉(zhuǎn)膜 32P標記的-珠蛋白cDNA雜交放射自顯影230.2kb1

10、.15kb1.35kb正常人正常人 突變攜帶著突變攜帶著患者患者5 3 Mst（CCTGAGG-CCTGTGG)正?；蛘；? 3 突變基因突變基因1.15kb1.35kb基因組基因組DNA的的RE分析分析鐮鐮狀紅細胞貧血狀紅細胞貧血HBS-珠蛋白基因突變：珠蛋白基因突變：電泳方向2.PCR-RE設(shè)計引物PCR擴增產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶酶切電泳EB染色直接觀察設(shè)計引物PCR擴增珠蛋白基因第六密碼子區(qū)域110bpMst 識別的核苷酸序列為CCTGAGG，是珠蛋白基因第5,6密碼子序列和第七密碼子序列的第一個堿基組成。正常人的擴增產(chǎn)物經(jīng)Mst 消化可生成54bp和56bp兩個片段25PCR-RE分析（MstII：CCTGAGG-CCTGTGG）正常人 患者 雜合子 電泳方向3.PCR-ASOASO為等位基因特異性寡核苷酸雜交法的簡稱，是基于核酸雜交的一種方法。根據(jù)已知基因突變位點的堿基序列，設(shè)計和制備野生型和突變型基因序列互補的兩種探針，分別與被檢測樣品中的D