熒光分光光度計(jì)課件

1、2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)1光學(xué)分析儀器（2）熒光分光度計(jì)的原理與應(yīng)用技術(shù)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)2熒光分光光度法 光光的基本性質(zhì) 光是一定波段范圍的電磁波，具有波粒二象性。光的波動(dòng)性可用波長(zhǎng)、頻率、光速c、波數(shù)（cm-1）等參數(shù)來(lái)描述： = c ； 波數(shù) = 1/ = /c 光的粒子性說(shuō)明光是有能量的： E = h = h c / （Planck常數(shù)：h=6.626 10 -34 J S )1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)3熒光分光光度法 光學(xué)分析儀器主要是通過(guò)電磁波與物質(zhì)互作用后，物質(zhì)對(duì)電磁輻射產(chǎn)生吸收或再發(fā)射，測(cè)量所得到的信息來(lái)對(duì)物質(zhì)加以研究的分

2、析儀器。這方面的儀器很多，在這里我們主要對(duì)紫外可見分光光度計(jì)和熒光分光光讀計(jì)加以討論。1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)4熒光分光光度法光學(xué)分析儀器 因?yàn)槲镔|(zhì)對(duì)光的選擇性吸收的特點(diǎn)，他的吸收有 如下的特性性 M + h M * M + 熱 基態(tài)基態(tài) 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài) M + 熒光或磷光1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)5 熒光分光光度法 原子發(fā)射光譜法：原子熒光分析 發(fā)射光譜法 分子發(fā)射光譜法 ： 熒光分析、磷光分析 光譜分析法 原子吸收光譜法：原子吸收分光分析 吸收光譜法 分子吸收光譜發(fā)：紫外可見、紅外吸收光譜 1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2022-5-18

3、光學(xué)分析儀器培訓(xùn)6熒光分光光度法 熒光分光光度法 熒光現(xiàn)象早在16世紀(jì)就比發(fā)現(xiàn)，但對(duì)熒光產(chǎn)生的原理和條件直到19世紀(jì)才基本清楚。Stokes在1852年考察了奎寧和葉綠素的熒光后發(fā)現(xiàn)，他們的熒光波長(zhǎng)要比照射的波長(zhǎng)要長(zhǎng)。認(rèn)定是物質(zhì)吸收光能后重新發(fā)射的光，并且波長(zhǎng)不同，熒光是發(fā)射光才被證實(shí)。 1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)7熒光分光光度法 熒光分光光度法 當(dāng)用紫外光照射某種物質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)會(huì)發(fā)出各種顏色和不同強(qiáng)度的光，當(dāng)紫外光停止照射時(shí)，這種光線也隨之消失。我們這種光線稱為熒光。依據(jù)物質(zhì)所發(fā)熒光的顏色和強(qiáng)度建立起來(lái)的定性和定量的分析方法稱為熒光分光光度法。 1、熒光分光光

4、度法簡(jiǎn)介2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)8熒光分光光度法 熒光的產(chǎn)生： 熒光是一種自然現(xiàn)象，在我們的日常生活中到處可以看見。產(chǎn)生熒光的原因是：熒光物質(zhì)分子吸收了特征頻率的能量后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后內(nèi)能轉(zhuǎn)換消耗部分能量，返回到最低電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再?gòu)倪@個(gè)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)所發(fā)的光，這束光我們稱為熒光。熒光發(fā)射的能量要比吸收光的能量?。úㄩL(zhǎng)要長(zhǎng)）。在這里我們用分子能級(jí)圖就能夠很好的理解它的產(chǎn)生過(guò)程。 1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)9熒光分光光度法n分子能級(jí)圖：n 1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)10熒光分光光度法 2、熒光分光光度計(jì)的

5、基本結(jié)構(gòu) F-7000熒光分光光度計(jì)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)11熒光分光光度法熒光分析儀器的結(jié)構(gòu)和主要部件： 2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)12熒光分光光度法 2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2.1、光源： 對(duì)光源的要求是必須有足夠的強(qiáng)度且具有連續(xù)光譜，其波長(zhǎng)范圍能滿足儀器的需要。大部分儀器由氙燈組成,它對(duì)能量的要求沒有紫外可見分光光度計(jì)那么嚴(yán)格。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)13熒光分光光度法 2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)14熒光分光光度法 2、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2.2、單色器： 色器也是熒光分光度計(jì)的核心部件。它有

6、兩個(gè)單色器。激發(fā)單色器它的作用是將光源發(fā)出的白色光色散成各種波長(zhǎng)的單色光用于照射樣品，發(fā)射單色器的作用只讓樣品發(fā)出的熒光通過(guò)。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)15熒光分光光度法 2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2.3、樣品室 樣品室比較寬大，以容納各種光徑的樣品池和附件。如流動(dòng)池，微量池等。樣品池全用石英材料制成，沒有玻璃樣品池。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)16熒光分光光度法 F-7000 熒光分 光光度 計(jì)樣品 室2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)17熒光分光光度法 2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)18熒光分光光度法 2、熒光分光

7、光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2.4、檢測(cè)器 熒光分光光度計(jì)常用的是光電檢測(cè)器。如光電池、光電管、光電倍增管和二極管陣列檢測(cè)器?，F(xiàn)在大部分是光電管 2.5、數(shù)據(jù)測(cè)量和控制： 控制儀器，并把測(cè)量到的熒光強(qiáng)度顯示出來(lái)。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)19熒光分光光度法 2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2.3、樣品室 樣品室比較寬大，以容納各種光徑的樣品池和附件。如流動(dòng)池，微量池等。樣品池全用石英材料制成，沒有玻璃樣品池。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)20熒光分光光度法n熒光分光光度計(jì)于紫外-可見分光光度計(jì)的區(qū)別 2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)21熒光分光光度法 3、熒光分光光度

8、法的特點(diǎn) 3.1、特點(diǎn)有以下幾點(diǎn)： （1）靈敏度高 熒光分析的最大特點(diǎn)是靈敏度高，通常比紫外可見光度計(jì)高出23個(gè)數(shù)量級(jí)。 （2）選擇性強(qiáng) 熒光光譜包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。因此確定恰當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光譜和發(fā)射波長(zhǎng)，能達(dá)到很高的選擇。 2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)22熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) （3）試樣量少和方法簡(jiǎn)單 由于熒光分析法靈敏度高，因而分析時(shí)需試樣量較小。特別在使用微量池時(shí)，用樣量可以大大減小。 （4）能獲得更多的信息 熒光分析可提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、總熒光量、峰位、譜帶寬度、量子產(chǎn)率、熒光壽命等參數(shù)。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)23熒光分光光度法 3、熒

9、光分光光度法的特點(diǎn) （5）受外界影響較大 ， 外界因素如溫度、PH值、溶劑和其它因素都可能顯著地影響分析結(jié)果。其中溫度對(duì)他的影響最大，這也是熒光分析需標(biāo)準(zhǔn)的原因。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)24熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.2、熒光分光光度法的發(fā)展 近年來(lái)，熒光分光度計(jì)隨著新技術(shù)的的采用，發(fā)展非?？?，特別是計(jì)算機(jī)和其它先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用的引入，是熒光光度計(jì)發(fā)生了根本的變化，相應(yīng)的分析方法也得到很快的發(fā)展，象激光熒光分析技術(shù)、時(shí)間分辨熒光分光光度法、同步熒光分析法，這些又大的推動(dòng)了分析方法在理論和應(yīng)用方面的進(jìn)展。同時(shí)促進(jìn)熒光分析技術(shù)的不斷完善。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)2

10、5熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.3、熒光和分子的關(guān)系： 熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系是個(gè)比較重要而復(fù)雜的問(wèn)題，但是，由于對(duì)激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解得不多，所以對(duì)他們的關(guān)系還不十分清楚。一般來(lái)說(shuō)，能發(fā)出熒光的物質(zhì)具有較大的吸收光能力、較高的熒光量子效率和合適的環(huán)境。分子中含有能發(fā)熒光的基團(tuán)稱為熒光團(tuán)。對(duì)于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)與分子結(jié)構(gòu)之間關(guān)系的描述可簡(jiǎn)單的總結(jié)以下幾點(diǎn)，僅供參考。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)26熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.3、熒光和分子的關(guān)系： 3.3.1、 有機(jī)物的熒光 （1） 共軛效應(yīng)： 具有共軛雙鍵的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，其電子共軛程度越大，越容易產(chǎn)生熒

11、光;環(huán)越多，發(fā)光峰紅移程度越大,發(fā)光也越強(qiáng)。同一共軛環(huán)數(shù)的芳族化合物，線性環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光波長(zhǎng)比非線性者要長(zhǎng)。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)27熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.3、熒光和分子的關(guān)系： （2）鰲合物中配位體的發(fā)光：不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性的分子不處于同一平面，因而不發(fā)熒光。若這些化合物和金屬離子形成鰲合物，隨著分子的剛性增加，平面結(jié)構(gòu)增大，常常會(huì)發(fā)熒光。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)28熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.3、熒光和分子的關(guān)系： （3）剛性結(jié)構(gòu)和平面結(jié)構(gòu)效應(yīng)：一般來(lái)說(shuō)，熒光物質(zhì)的剛性和平面性增強(qiáng)，可使分子與溶劑或其

12、它溶質(zhì)分子的相互作用減小，既使外轉(zhuǎn)移能量損失減小，從而有利于熒光的發(fā)射。如果分子內(nèi)取代基之間形成氫鍵，加強(qiáng)了分子的剛性結(jié)構(gòu)，其熒光強(qiáng)度將增加。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)29熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.3、熒光和分子的關(guān)系： 取代基的類型和位置：取代基對(duì)熒光體的影響分為加強(qiáng)熒光的、減弱熒光的和影響不明顯的。 加強(qiáng)熒光的取代基有OHORRNH2CN、NHR、NR2、OCH3等給電子取代基，由于它們n電子的電子云幾乎與芳環(huán)上的軌道平行，因而共享了功軛 電子結(jié)構(gòu)，同時(shí)，擴(kuò)大了共軛雙鍵體系。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)30熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.3、

13、熒光和分子的關(guān)系： 減弱熒光的有COOH、NO2、NO、SH等得電子取代基，它們n電子的電子云并不與芳環(huán)上電子平面。影響不明顯的取代基有NH3、R、SO3H等。 （4）電子躍遷類型：含有氮、氧、硫雜原子的有機(jī)物，它們的熒光強(qiáng)度與電子躍遷類型有關(guān)。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)31熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.3、熒光和分子的關(guān)系： 3.3.2、金屬鰲合物的熒光： 除過(guò)元素的順磁性原子會(huì)發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類金屬離子在溶液中只能發(fā)生無(wú)輻射躍遷，因而不產(chǎn)生熒光。但是,在某些條件下，金屬鰲合物卻能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，并可用于痕量金屬離子的測(cè)定。2022-5-18光學(xué)分析儀

14、器培訓(xùn)32熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.3、熒光和分子的關(guān)系： （1）鰲合物中配位體的發(fā)光：不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性的分子不處于同一平面，因而不發(fā)熒光。若這些化合物和金屬離子形成鰲合物，隨著分子的剛性增加，平面結(jié)構(gòu)增大，常常會(huì)發(fā)熒光。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)33熒光分光光度法 3、熒光分光光度法的特點(diǎn) 3.3、熒光和分子的關(guān)系： （2）鰲合物中金屬離子的特征光譜：這類發(fā)光過(guò)程通常是鰲合物首先通過(guò)配位體的*躍遷而被激發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)移給金屬離子，導(dǎo)致dd*或f f*路遷，最終 發(fā)射的是d*d或f *f路遷光譜。2022-5-18光學(xué)分析儀器培

15、訓(xùn)34熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù)4.1、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜是用熒光分析法進(jìn)行定量和定性分析是的基本參數(shù)和依據(jù)。因次我們?cè)趯W(xué)習(xí)熒光分光光度法時(shí)要對(duì)它加以了解。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)35熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.1、激發(fā)光譜: 將樣品放入光路中選擇合適的發(fā)射單色器的波長(zhǎng)和帶寬并使之固定不變，讓激發(fā)單色器的波長(zhǎng)掃描，所得的圖譜既為激發(fā)光譜。它反映了物質(zhì)的熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)36熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.1、激發(fā)光譜: F激發(fā)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)37熒光分

16、光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.1、激發(fā)光譜: 它的特性：激發(fā)光譜從理論上講同一物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大吸收波長(zhǎng)一致，但由于熒光測(cè)量?jī)x器的特性如光源的分布、單色器的透射和檢測(cè)器響應(yīng)的影響，實(shí)際測(cè)量的熒光激發(fā)光譜與吸收光譜不完全一致。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)38熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.2、發(fā)射光譜（也叫熒光光譜）： 將熒光樣品放入光路中后，選擇合適的激發(fā)單色器波長(zhǎng)與帶寬使之固定不變，讓發(fā)射單色器的波長(zhǎng)掃描圖譜，所得光譜既為發(fā)射光譜。它反映了物質(zhì)的熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)39熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.

17、1.2、發(fā)射光譜（也叫熒光光譜）： F發(fā)射2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)40熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.1.2、發(fā)射光譜（也叫熒光光譜）： 熒光光譜通常具有如下特性； （1）斯托克斯位移； （2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)； （3）熒光光譜與吸收光譜的鏡像關(guān)系。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)41熒光分光光度法n分子能級(jí)圖：n 4、熒光分析中常用參數(shù)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)42熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.2 熒光強(qiáng)度 熒光強(qiáng)度是表示發(fā)射相對(duì)強(qiáng)度的物理量，它是最常用的熒光參數(shù)之一。目前一般的商品儀器都采用熒光強(qiáng)度來(lái)表示，所以單位為任意單位，

18、表示的是相對(duì)強(qiáng)度。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)43熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.2 熒光強(qiáng)度 物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度與它吸收的光能成正比，當(dāng)測(cè)量的溶液很稀時(shí)，可用如下公式表示： F=KI0CL2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)44熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù)4.2 熒光強(qiáng)度 F=KI0CL F-熒光強(qiáng)度 K-儀器常數(shù) I0-激發(fā)光強(qiáng)度 C-樣品濃度 L-池的光徑長(zhǎng)度 -樣品消光系數(shù) -樣品的量子產(chǎn)率 2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)45熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.3、量子產(chǎn)率： 因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度只是相對(duì)強(qiáng)度，只能在同一儀器相同條件下加以比較，所以要想比較

19、不同物質(zhì)的熒光強(qiáng)弱，應(yīng)當(dāng)用量子產(chǎn)率來(lái)表示。 量子產(chǎn)率=發(fā)射量子數(shù)/吸收量子數(shù)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)46熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅 廣義的講,指任何可使某種熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度下降的作用或任何可使熒光量子產(chǎn)率降低的作用。 狹義的說(shuō),熒光熄滅指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)47熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅 導(dǎo)致熒光熄滅作用的幾種主要類型: a 碰撞熄滅; b 能量轉(zhuǎn)移; c 電荷轉(zhuǎn)移 ; d 轉(zhuǎn)入三重態(tài); e 光化學(xué)反應(yīng)熄滅; f 自熄滅和自吸收;202

20、2-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)48熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅a 碰撞熄滅; 碰撞熄滅是熒光熄滅的主要原因是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與熄滅劑發(fā)生碰撞，使激發(fā)態(tài)分子以無(wú)輻射躍遷方式回到基態(tài)，因而產(chǎn)生熒光熄滅。 碰撞熄滅與溶液的粘度有關(guān)，粘度大熄滅作用較小。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)49熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅b 能量轉(zhuǎn)移; 這種熄滅作用產(chǎn)生于熄滅劑與處于激發(fā)但重態(tài)的熒光分子作用后，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移是熄滅劑得到激發(fā)。如果溶液中熄滅劑濃度足夠大，可能引起熒光物質(zhì)的熒光光譜發(fā)生畸變，造成熒光強(qiáng)度測(cè)量的誤差。2022-5-18光學(xué)分析儀

21、器培訓(xùn)50熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅c 電荷轉(zhuǎn)移 ; 這種熄滅作用產(chǎn)生于熄滅劑與處于激發(fā)態(tài)分子間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而引起的。由于激發(fā)態(tài)分子往往被基態(tài)分子具有更強(qiáng)的氧化還原能力，因此熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子比基態(tài)分子更容易與其它物質(zhì)的分子發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移作用。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)51熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅d 轉(zhuǎn)入三重態(tài); 由于內(nèi)部能量轉(zhuǎn)移，發(fā)生由激發(fā)單重態(tài)到三重態(tài)的系間竄躍，多余的振動(dòng)能在碰撞中損失而使熒光熄滅。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)52熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅e 光化學(xué)反應(yīng)熄滅;

22、由光致激發(fā)態(tài)分子所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)稱為光化學(xué)反應(yīng)，它可以是單分子也可以是雙分子反應(yīng)。熒光分析中因發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致熄滅現(xiàn)象經(jīng)常遇到，其中，影響最大的是光解反應(yīng)。表現(xiàn)在熒光測(cè)定過(guò)程中熒光強(qiáng)度隨光照時(shí)間而減弱。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)53熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4.4、熒光的熄滅f 自熄滅和自吸收; 當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，經(jīng)常發(fā)生自熄滅現(xiàn)象，使熒光強(qiáng)度降低。這可能是由于激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞引起的能量損失。 當(dāng)熒光物質(zhì)的熒光光譜曲線與吸收光譜曲線重疊時(shí)，熒光被溶液中處于基態(tài)的分子吸收。稱為自吸收。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)54熒光分光光度法 4、熒光分析中常用參數(shù) 4

23、.5、熒光分析法的靈敏度 a 、 絕對(duì)靈敏度Sa；是用熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率和摩爾吸收系數(shù)的乘積。 b 、 以硫酸奎寧的檢出線表示儀器的靈敏度。 c 、 用純水拉曼峰信噪比(S/N)表示儀器的靈敏度。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)55熒光分光光度法 5、熒光分光光度計(jì)的分析方法 5.1、定性分析 熒光分光光度劑的定性分析是根據(jù)掃描出來(lái)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜進(jìn)行的特性定性分析。 2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)56熒光分光光度法5、熒光分光光度計(jì)的分析方法： 5.2、定量 分析 儀器分析方法的定量基礎(chǔ)是： S=f(c) 當(dāng)S=f(c)為線性響應(yīng)時(shí)： F=kic 當(dāng)S=f(c)為非線性響應(yīng)時(shí)： F

24、=kic+b 2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)57熒光分光光度法5、熒光分光光度計(jì)的分析方法： 5.2、定量 分析 在定量分析時(shí)，除庫(kù)倫法和重量法外，所有的分析方法都需要校正，即需要建立待測(cè)組分的濃度與分析信號(hào)間的真正關(guān)系。儀器分析方法中常用的校正方法有：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；標(biāo)準(zhǔn)加入法和內(nèi)標(biāo)法。我們要根據(jù)儀器和分析對(duì)象的條件，選擇適合的校正方法。 2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)58熒光分光光度法 5、熒光分光光度計(jì)的分析方法 5. 2、定量分析 對(duì)熒光分光光度計(jì)而言定量分析的依據(jù)是熒光強(qiáng)度的關(guān)系公式進(jìn)行定量分析的，其主要的分析方法有：標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照法和內(nèi)標(biāo)法。2022-5-18光學(xué)分析

25、儀器培訓(xùn)59熒光分光光度法 5、熒光分光光度計(jì)的分析方法 5.2、定量分析 5.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法； 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度在待樣品的濃度范圍內(nèi)。選擇合適的激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)其熒光強(qiáng)度并與濃度C繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在測(cè)未知樣品的強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出未知樣品的濃度。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)60熒光分光光度法 5、熒光分光光度計(jì)的分析方法 5.2、定量分析 5.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法； 熒熒光光強(qiáng)強(qiáng)度度標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)61熒光分光光度法 5、熒光分光光度計(jì)的分析方法 5. 2、定量分析 5.2.2、內(nèi)標(biāo)法： 在樣品溶液中加入已知的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別測(cè)量樣品加標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液和空白溶液的熒光強(qiáng)度，在根據(jù)它們之間的關(guān)系進(jìn)行計(jì)算。2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)62熒光分光光度法 5、熒光分光光度計(jì)的分析方法 5. 2、定量分析 5.2.2、內(nèi)標(biāo)法： 其計(jì)算公式如下： C樣/C標(biāo)=F樣/(F標(biāo)+樣-F樣)2022-5-18光學(xué)分析儀器培訓(xùn)63熒光分光光度法 5、熒光分光光度計(jì)的分析方法 5. 2、定量分析 5.2.3、標(biāo)準(zhǔn)、樣品對(duì)照法(單點(diǎn)校正法) 當(dāng)樣品溶液遵循