細菌性疫苗制造技術

1、細菌性疫苗制造技術任務一 滅活苗的制造流程菌種的選擇（強毒株) 菌液培養(yǎng) 滅活 配苗（5份菌液+1份鋁膠配苗) 濃縮工序一 菌種與種子培養(yǎng)選取毒力強、免疫原性好的13個品系菌株，按規(guī)定定期復壯和鑒定，將合格菌種增殖培養(yǎng)并經(jīng)無菌檢驗、活菌計數(shù)達到標準后作為種子液。種子液保存于28冷暗處，在有效期內(nèi)用于菌苗生產(chǎn)種子使用。大腸桿菌病的菌種應采集動物心血、腹水、肝滲出物、氣囊附著物或正常動物的腸道內(nèi)容物作為接種物。如用含大腸桿菌的病料，首先對大腸桿菌進行分離、鑒定，符合要求方可作為菌種使用。工序二 菌液的培養(yǎng)用于規(guī)?；毦囵B(yǎng)的方法很多，有手工式、機械化或自動化等方式?？晒┚w培養(yǎng)的方法有：固體表面培

2、養(yǎng)法、液體靜置培養(yǎng)法、液體深層通氣培養(yǎng)法和透析培養(yǎng)法。一般固體培養(yǎng)易獲得高濃度細菌懸液，含培養(yǎng)基成分少，易稀釋成不同的濃度，但生產(chǎn)量較小。因此，大量生產(chǎn)疫苗時常用液體培養(yǎng)法。實例 大腸桿菌的菌液培養(yǎng)方法(1)將生化結果典型的菌種接種于伊紅美蘭瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板上，置37溫箱中培養(yǎng)1824h，挑取單個典型菌落接種于瓊脂斜面，置37溫箱中培養(yǎng)1824h，經(jīng)顯微鏡檢查無雜菌污染者，即可作為種子培養(yǎng)物。(2)取5ml馬丁肉湯加入瓊脂斜面洗下菌苔作為一級種子，用滅菌吸管按5%的量將一級種子接種于馬丁肉湯中，置37培養(yǎng)1824h后作為二級種子。(3)二級種子可以接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或馬丁肉湯中做進一

3、步擴大培養(yǎng)。如接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，37培養(yǎng)2448h后，加入滅菌生理鹽水，用滅菌接種環(huán)或特制的刮子將菌苔刮下，傾入滅菌的離心管中，低速離心5min (500r/min)，使其中可能摻雜的瓊脂塊下沉。吸取上層細菌懸浮液加入盛有玻璃珠的滅菌瓶中，用手或振蕩器振蕩30min，使細菌均勻分散,取少量菌液裝于滅菌試管中供計數(shù)用，其余細菌將滅活(強毒細菌須在殺菌后，再行計數(shù))。如接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)37培養(yǎng)2448h后，直接取少量菌液供計數(shù)用，其余細菌則滅活。工序三 菌數(shù)計算采用活菌計數(shù)法或比濁計數(shù)法，以概略地計算出每毫升菌液中的細菌總數(shù)。工序四 滅活與濃縮對大腸桿菌菌液應加入0.5甲醛溶液，置

4、37溫箱作用4872h，以達到殺死細菌的目的。滅活后需對菌液進行濃縮，常用的濃縮方法有離心沉降法、氫氧化鋁吸附沉淀法和羧甲基纖維沉淀法?？墒咕簼饪s1倍以上。工序五 配苗與分裝配苗就是在菌苗的制備過程中加入佐劑，以增強免疫效果。由于滅活菌苗所用的佐劑不同，所以配苗方法也不同。例如,大腸桿菌氫氧化鋁菌苗細菌計數(shù)所得原菌液的濃度，用滅菌生理鹽水將其稀釋成最終濃度為100億400億個/ml。按每5份菌液加入1份氫氧化鋁膠配苗，同時加入0.01%硫柳汞，充分振蕩，置28靜止23d，抽棄上清液，濃縮成全量的60%。塞上膠塞，用固體石蠟溶化封口，貼上標簽，注明菌苗名稱。使用前充分搖勻。,整個制備過程都必須

5、在無菌條件下按照無菌操作進行介紹常用滅活劑1.甲醛甲醛是最古典的、也是應用最廣的一種滅活劑。為無色氣體，易溶于水和乙醇，其3640水溶液稱為福爾馬林。甲醛用于疫苗滅活的濃度為0.10.5。一般需氧細菌用0.10.2的濃度，厭氧菌則多用0.40.5的濃度。病毒可在0.050.4的之間，多數(shù)使用0.10.3。2.苯酚 又稱石炭酸。為無色結晶或白色熔塊，有特殊氣味，有毒及腐蝕性，易潮解，溶于水及有機溶劑。置于空氣中易被氧化，應避光保存。滅活機制是使微生物的蛋白質發(fā)生變性和抑制特異酶系統(tǒng)（如脫氨酶、氧化酶等）的活性，從而導致微生物死亡。制作生物制品的常用濃度為0.30.5。3.-丙內(nèi)酯 又名為羥基丙酸

6、-內(nèi)酯，性狀為不穩(wěn)定，無色，有刺激氣味的液體，是一種良好的病毒滅活劑。-丙內(nèi)酯的滅活機制是破壞病毒的核芯，但不損害衣殼蛋白，因此能保持病毒良好的免疫原性，主要用于狂犬病滅活苗的制備。4.結晶紫 是一種帶有金屬光澤的綠色結晶或深綠色結晶狀粉末的堿性染料，易溶于醇、氯仿，不溶于水和醚。滅活機制主要是它的陽離子與微生物蛋白質的羧基形成帶弱電的化合 物，妨礙了微生物的正常代謝，擾亂微生物的氧化還原作用，使電勢太高而不適于微生物的增殖，對革蘭氏陽性菌主要是干擾細胞壁肽聚糖的合成。5.硫柳汞 又稱乙基汞硫代水楊酸鈉，為無色結晶或乳白色粉末，微有特殊氣味，易溶于水和乙醇，不溶于乙醚和苯，應避光保存。用于生物

7、制品的防腐和消毒，對霉菌、細菌和病毒都有一定的滅活作用。常用濃度為0.010.02。6.烷化劑 是含有烷基的分子中去掉一個氫原子與另一種化合物作用，將烷基引入，形成烷基取代物。其滅活機制是烷化微生物DNA、RNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙鏈交聯(lián)，也可與酶系統(tǒng)和核蛋白起作用，破壞核酸代謝、合成，使病毒喪失感染力，但不損害蛋白衣殼，從而保留其抗原性。這類烷化劑常用的有N-乙酰乙烯亞胺、 二乙烯亞胺及縮水甘油醛等。介紹常用的免疫佐劑(一)免疫佐劑的概念免疫佐劑又稱佐劑，是指單獨使用沒有免疫原性，與抗原物質合并使用能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答，發(fā)揮其輔佐作用的一類物

8、質。其作用特點是：對某些分子的相對質量小的多糖或多肽等抗原性微弱的物質，可明顯增強其抗原性；可用最小的抗原量、最少的接種次數(shù)，刺激機體產(chǎn)生足夠的免疫應答和高滴度的抗體，在血流中或黏膜表面維持較長時間，發(fā)揮持久作用。(二)常規(guī)免疫佐劑1.鋁鹽類佐劑(1)氫氧化鋁膠 簡稱鋁膠。鋁膠可用制造多種獸用疫苗。(2)明礬(3)磷酸三鈣2.弗氏佐劑弗氏不完全佐劑是由3份液體石蠟油、1份無水羊毛脂、4份磷酸緩沖鹽水（pH7.2）混合而成。制造時，先將各成分混合均勻，116高壓滅菌30min，冷卻后加入1吐溫-80混勻，使用時與抗原物質等量混合。弗氏完全佐劑是在不完全佐劑中加入殺死的分枝桿菌或卡介苗，按l2mg

9、ml的量加入，使用時與抗原物質等量混勻。3.油乳佐劑油乳佐劑是指一類由油類物質和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。4.蜂膠佐劑蜂膠是由蜜蜂上顎腺的分泌物和由蜜蜂采自柳樹、楊樹、栗樹和其他植物幼芽分泌的樹脂以及蜂蠟、花粉等組成。5.微生物佐劑(三) 新型免疫佐劑1.細胞因子類佐劑白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）白細胞介素-12（IL-12）-干擾素。2.免疫刺激復合物(ISCOM)佐劑任務二 活疫苗的制造流程 弱毒疫苗的制造流程菌種與種子菌液培養(yǎng)濃縮配苗與凍干工序一 菌種與種子。弱毒菌種多是凍干制品，在使用前應按規(guī)程規(guī)定進行復壯、挑選，并作形態(tài)、免

10、疫原性等鑒定，合格后將菌種接種于規(guī)定的培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查及有關的檢查合格者即作為種子液。種子液保存在04，有效期2個月。在保存期內(nèi)用作菌苗生產(chǎn)的批量種子使用。工序二 菌液培養(yǎng)。按培養(yǎng)基1%3%的比例接入種子液，依不同菌苗的要求制備菌液。如豬丹毒弱毒苗在深層通氣培養(yǎng)中要加入適當植物油作消泡劑，并通入過濾除菌的熱空氣。菌液于04暗處保存，經(jīng)抽樣無菌檢驗、活菌計數(shù)合格后使用。工序三 濃縮。經(jīng)上述檢驗合格的菌液進行濃縮，其目的是提高單位活菌數(shù)，進而提高某些弱毒菌苗的免疫效果。常用的濃縮方法有吸附劑吸附沉降法和離心沉降法。濃縮菌液應抽樣作純粹檢驗、無菌檢驗及活菌計數(shù)。工序四 配苗與凍干。將檢

11、驗合格的菌液按比例加入凍干保護劑（如5%蔗糖脫脂乳）配苗，充分搖勻后立即分裝。隨后將菌苗迅速放入凍干柜預凍和真空干燥，并立即加塞、抽空、封口，移入冷庫保存后由質檢部門抽樣檢驗介紹常用的凍干保護劑（一）凍干保護劑的組成和分類1低分子物質 又稱為營養(yǎng)液，是一種均勻的混懸液，使微生物保持穩(wěn)定的存活狀態(tài)及對水分子起緩解作用，使凍干生物制品保留一定量水分，促進高分子物質骨架形成，使凍干制品呈多孔的海綿狀，從而增加溶解度。如糖類和氨基酸類（谷氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、賴氨酸）等。2高分子物質 又稱為賦型劑，在凍干生物制品中主要起骨架作用，防止低分子物質的碳化和氧化；保護活性物質不受加熱的影響；使凍干制品形

12、成多孔性、疏松的海綿狀物，從而使溶解度增加。高分子物質范圍很廣，種類甚多。如白蛋白、血清、明膠、脫脂乳、各種液體培養(yǎng)基、淀粉、酵母浸膏、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纖維素等。3抗氧化劑 具有抑制凍干制品中酶的活化作用，從而促進、保持微生物等活性物質的穩(wěn)定性?？寡趸瘎┌ㄒ恍┯袡C物質和無機物質，如維生素C、維生素E、硫脲、碘化鉀、鉬酸銨和硫代硫酸鈉等。(二)、凍干保護劑分類1.根據(jù)凍干保護劑的化學性質分類可分為復合物、糖類、鹽類、醇類、酸類、堿類、聚合物等2.根據(jù)凍干保護劑的作用機制分類滲透劑 非滲透劑(三)常用的凍干保護劑15蔗糖脫脂乳保護劑2脫脂乳-谷氨酸鈉保護劑37.5葡萄糖血清保護劑4環(huán)乙醇-

13、血清保護劑5噴霧干燥用保護劑（四）不同微生物適用的保護劑1需氧和兼性厭氧菌可用5蔗糖脫脂乳，或含1谷氨酸鈉的10脫脂乳，或l0脫脂乳與犢牛血清，或5蔗糖，或1.5明膠等。2厭氧菌可用10脫脂乳，或7.5葡萄糖加血清，或用含0.1谷氨酸鈉的10乳糖等。3病毒可用明膠、血清、蛋白胨、乳糖、蔗糖、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮等，也可加入脫脂乳，或者幾種成分混合配成保護劑。4支原體 可用3脫脂乳加5葡萄糖混合液，或1牛血清白蛋白，或50健馬血清，或7.5葡萄糖加血清等。5立克次體 常用10脫脂乳。6酵母菌 可用健步馬血清，或7.5葡萄糖加血清，或脫脂乳加谷氨酸鈉和蔗糖等。任務三 類毒素的制造流程類毒素的制造

14、流程菌種與毒素脫毒類毒素的精制工序1菌種與毒素應選用中監(jiān)所分發(fā)或批準的產(chǎn)毒效價高、免疫力強的菌株，必要時可對菌種進行篩選。菌種應定期作全面性狀檢查（如細菌形態(tài)、純化試驗、糖發(fā)酵反應、產(chǎn)毒試驗及特異性中和試驗等），并有完整的傳代、鑒定記錄。菌種應用凍干或其他適宜方法保存在28。選擇適宜的培養(yǎng)基制造種子菌及毒素。毒素制造過程應嚴格控制雜菌污染，經(jīng)顯微鏡檢查或純化試驗發(fā)現(xiàn)污染者應廢棄。毒素須經(jīng)除菌過濾后方可進行下一步制造程序，亦可殺菌后進行精制。工序2脫毒目前采用最可靠的脫毒方法仍是甲醛溶液法，溫度控制在3739，終濃度控制在0.3%0.4%。脫毒后的制品即成粗制的類毒素。經(jīng)檢驗合格者，置28保存，

15、有效期可達3年。工序3類毒素的精制用人工培養(yǎng)法所制得的粗制類毒素液含有大量的非特異性雜質，而毒素含量較低。因此，有必要對類毒素進行濃縮精制，以獲得純的或比較純的類毒素制品。（1）物理學方法 可用冷凍干燥、蒸發(fā)、超濾、凍融等方法除水濃縮；也可用氧化鋁和磷酸鈣膠等固相吸附劑吸附。 （2）化學沉淀法 有酸沉淀法（鹽酸、硫酸、磷酸、三氯醋酸等）、鹽析法（硫酸鹽、硫酸鈉及磷酸鹽緩沖液等）、有機溶劑沉淀法（甲醇、乙醇及丙酮等）和重金屬陽離子沉淀法（Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+等，其中以氯化鋅應用最廣）。（3）層析法 有凝膠過濾和離子交換層析法。類毒素精制后應加終濃度0.01%硫柳汞防腐，并盡快除

16、菌過濾。保存于28，有效期為3年。實例 豬鏈球菌蜂膠苗制備1材料與試劑（1） 器材：粉碎機或墊板和錘頭.研磨器.量筒.玻璃棒.離心機.吸管等。（2） 試劑：95%酒精2蜂膠佐劑疫苗制備方法（1） 蜂膠的處理： 用市售蜂膠，放4以下低溫貯存，制備前用粉碎機或墊板和捶頭在4-8下粉碎。 過篩，按1：4加入95%乙醇，室溫浸泡24-48h。 冷卻，過濾或離心取上清液，即得透明栗色純凈蜂膠浸液。 除去干渣，計算出浸液中蜂膠含量，浸液置4以下保存?zhèn)溆?。?） 鏈球菌的培養(yǎng) 將至病性鏈球菌接踵于普通肉湯培養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)至細菌生長飽和狀態(tài)。 將菌液3000rpm 離心20min，棄去上清液，沉淀物用滅

17、菌生理鹽水或PBS液稀釋至所需濃度，同時要求純粹生長。 將菌液滅活：在菌液中緩慢加入終濃度為0.5%的甲醛溶液，邊加入變攪拌，使之完全混勻，置37滅活24h。（3）蜂膠佐劑疫苗的制備：在滅活菌液中加入蜂膠乙醇浸液，使每毫升菌液中喊蜂膠10mg，邊加邊搖蕩，迅即成為乳濁狀，即為蜂膠佐劑疫苗。（4）疫苗的檢驗自制菌苗的檢驗主要為安全檢驗，取注射計量的5-10倍的劑量注射實驗豬，豬在注射后應無異常反應，或反應很輕微。任務四 幾種主要細菌性疫苗的制作實例1布魯氏菌19號活疫苗的制作（1）菌種 制苗菌種為牛種布魯氏菌弱株A19，其生物學特性典型。（2）制備工序工序1種子繁殖 凍干菌種接種于胰蛋白瓊脂平板

18、培養(yǎng)基上,于36-37培養(yǎng)2-3d,選取典型菌落,再次接種于胰蛋白瓊脂平板營養(yǎng)48-72h,作為種子.工序2菌液培養(yǎng) 按培養(yǎng)基總量的1%-2%將種子液接種于馬丁肉湯,在 36-37下通氣培養(yǎng)36h期間于第12h、20h、28h分別按培養(yǎng)基總量的 1%-2%加入50%葡萄糖溶液。純粹檢驗合格。工序3濃縮與配苗 將菌液用PH6.3-6.8緩沖生理鹽水稀釋成120億-160億個/ml,無菌分裝即為濕苗,若制凍干苗,按總量的 0.2%_0.4%加入羧甲基纖維素鈉,濃縮沉淀菌體.濃縮的菌液純粹檢驗及活菌計數(shù)合格后,加入PH7.0的蔗糖明膠穩(wěn)定劑進行配苗,定量分裝,迅速冷凍真空干燥.實例2仔豬大腸桿菌三價

19、滅活苗制作（1）菌種 制苗用菌種為C83549.C83644.C83710菌株,檢驗用菌種,檢驗用菌種為 C83902 C83912 C83917菌株.要求用相應的 K88 K99和987P因子血清做平板凝集反應,達到強陽性反應.（2）制備工序工序1種子繁殖 將各株凍干菌種接種改良Minca湯中培養(yǎng)后,用改良Minca瓊脂平板劃線分離,選取典型菌落若干,分別用相應的 K88 K99和987P因子血清逐個做平板凝集反應,選取強陽性反應菌落,接種改良Minca湯中培養(yǎng),作為一級種子.取一級種子按上述方法繁殖,革蘭氏染色鏡檢后 ,無雜菌者作為二級種子.工序2菌液制備 將二級種子進行連續(xù)通氣培養(yǎng),攪拌速度為600r/min，通氣量大于1：1，第一代通氣培養(yǎng)7h，取樣檢驗合格，即收獲，并按加入培養(yǎng)基的3%-5%留有種子，然后加入培養(yǎng)基，通氣培養(yǎng)6-7h，再收獲，如此循環(huán)培養(yǎng)，但最多吧超過10代。培養(yǎng)溫度為36-37，0.01%花生油為消泡劑。工序3配苗與分裝 按總量加入20%氫氧化鋁膠，最后補加PBS和 0.01%硫柳汞，每1ml成品苗中應含有K88100個