紫外分光光度計(jì)的使用原理和方法

1、 紫外-可見吸收光譜朗伯朗伯-比耳定律比耳定律紫外-可見分光光度計(jì)分析條件的選擇分析條件的選擇測(cè)定方法在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS) 按所吸收光的波長區(qū)域不同，分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。 它是利用物質(zhì)的分子或離子對(duì)某一波長范圍的光的吸收作用，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定性分析分析、定量分析定量分析及結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析, 所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜。1 與其它光譜分析方法相比，其儀器設(shè)備和儀器設(shè)備和操作都比較簡單，費(fèi)用少，分析速度快操

2、作都比較簡單，費(fèi)用少，分析速度快;2 靈敏度高靈敏度高;3 選擇性好選擇性好;4 精密度和準(zhǔn)確度較高精密度和準(zhǔn)確度較高;5 用途廣泛用途廣泛。 1. 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收 物質(zhì)對(duì)光光的吸收是選擇性選擇性的，利用被測(cè)物質(zhì)對(duì)某波長的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，這就是光譜法的基礎(chǔ)光譜法的基礎(chǔ)。 通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)對(duì)不同波長的光的吸收強(qiáng)度（吸光度），以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得出該物質(zhì)在測(cè)定波長范圍的吸收曲線吸收曲線。如圖3-1； 在吸收曲線中，通常選用最大吸收波長max進(jìn)行物質(zhì)含量的測(cè)定。 飽合有機(jī)化合物飽合有機(jī)化合物的電子躍遷類型為*，n* 躍遷，吸收峰一般出現(xiàn)在真空紫外區(qū)，吸收峰低于200

3、nm，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。 不飽合機(jī)化合物不飽合機(jī)化合物的電子躍遷類型為n*，* 躍遷，吸收峰一般大于200nm。 生色團(tuán)：是指分子中可以吸收光子而產(chǎn)生電子躍遷的原子基團(tuán)。人們通常將能吸收紫外、可見光的原子團(tuán)或結(jié)構(gòu)系統(tǒng)定義為生色團(tuán)。見表3-1和3-2。助色團(tuán)：是指帶有非鍵電子對(duì)的基團(tuán)，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它們本身不能吸收大于200nm的光，但是當(dāng)它們與生色團(tuán)相連時(shí)，會(huì)使生色團(tuán)的吸收峰向長波方向移動(dòng)，并且增加其吸收強(qiáng)度。見表3-4。紅移和紫移 在有機(jī)化合物中，常常因取代基的變更或溶劑的改變，使其吸收帶的最大吸收波長max發(fā)生移動(dòng)。向長波方向移動(dòng)稱為紅移(表3

4、-3)，向短波方向移動(dòng)稱為紫移。鑭系和錒系元素的離子對(duì)紫外和可見光的吸收是基于內(nèi)層f電子電子的躍遷而產(chǎn)生的。其紫外可見光譜為一些狹長的特征吸收峰，這些峰幾乎不受金屬離子的配位環(huán)境的影響。 1. f電子躍遷吸收光譜過渡金屬的電子躍遷類型為d電子電子在不同d軌軌道道間的躍遷，吸收紫外或可見光譜。這些峰強(qiáng)烈受配位環(huán)境的影響。 例如 cu2+以水為配位體，吸收峰在794nm處，而以氨為配位體，吸收峰在663nm處。此類光譜吸收強(qiáng)度弱，較少用于定量分析。2. d電子躍遷吸收光譜3. 電荷遷移光譜 某些分子既是電子給電子給體體，又是電子受體電子受體，當(dāng)電子受輻射能激發(fā)從給體外層軌道向受體躍遷時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生較

5、強(qiáng)的吸收，這種光譜稱為電荷遷移光譜。如 苯酰基取代物在光作用下的異構(gòu)反應(yīng)。 物質(zhì)的吸收光譜與測(cè)定條件有密切的關(guān)系。測(cè)定條件（溫度、溶劑極性、pH等）不同，吸收光譜的形狀形狀、吸收峰吸收峰的位置、吸收強(qiáng)度吸收強(qiáng)度等都可能發(fā)生變化。1.溫度 在室溫范圍內(nèi)，溫度對(duì)吸收光譜的影響不大。 2. 溶劑 注意如下幾點(diǎn)：（1）盡量選用低極性溶劑；（2）能很好地溶解被測(cè)物，并且形成的溶液具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性；（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。3. pH值 紫外-可見吸收光譜除主要可用于物質(zhì)的定量定量分析分析外，還可以用于物質(zhì)的定性分析、純度鑒定、結(jié)構(gòu)分析。1.定性分析2.純度的鑒定 用紫外吸收光譜

6、確定試樣的純度是比較方便的。 如蛋白質(zhì)與核酸的純度分析中，可用A280/A260的比值，鑒定其純度。 3.結(jié)構(gòu)分析 紫外-可見吸收光譜一般不用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，但利用紫外吸收光譜鑒定化合物中的共軛結(jié)構(gòu)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)還是有一定價(jià)值。例如，某化合物在近紫外區(qū)內(nèi)無吸收，說明該物質(zhì)無共軛結(jié)構(gòu)和芳香結(jié)構(gòu)。 設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，吸收光強(qiáng)度為Ia,透射光強(qiáng)度為 It，反射光強(qiáng)度為Ir，則 I0= Ia+ It+ Ir由于反射光強(qiáng)度基本相同，其影響可相互抵消，上式可簡化為： I0= Ia+ It一、吸光度和透光度一、吸光度和透光度吸光度吸光度: 為透光度倒數(shù)的對(duì)數(shù)，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It透

7、光度：透光度：透光度為透過光的強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0二、朗伯二、朗伯-比爾定律比爾定律朗伯-比爾定律：當(dāng)一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即 A= cl 式中比例常數(shù)與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。 朗伯-比爾定律是紫外-可見分光光度法的理論基礎(chǔ)。三、吸光系數(shù)當(dāng)l以cm，c以g/L為單位，稱為吸光吸光系數(shù)系數(shù)，用 a表示。A= a cla的單位為L/(g.cm) 當(dāng)l以cm，c以mol/L為單位，稱為摩爾摩爾吸光系數(shù)吸光系數(shù)，用 表示。 的單位為的單

8、位為L/mol.cm，它表示物質(zhì)的濃度它表示物質(zhì)的濃度為為1mol/L，液層厚度為液層厚度為1cm時(shí)，溶液的吸光時(shí)，溶液的吸光度度。摩爾吸光系數(shù)比吸光系數(shù)比吸光系數(shù)是指百分含量為1%， l為1cm時(shí)的吸光度值，用 表示。%11cmE%111 . 0cmrEM四、偏離朗伯-比耳定律的因素（1）入射光為非單色光）入射光為非單色光（3）光程的不一致性。）光程的不一致性。 光源不是點(diǎn)光源，比色皿光徑長度不一致，光學(xué)元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。 實(shí)際樣品的混濁，加入的保護(hù)膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發(fā)射等，均可吸光質(zhì)點(diǎn)的吸

9、光特性變化大。一、主要部件的性能與作用基本結(jié)構(gòu):光源光源單色器單色器吸收池吸收池檢測(cè)器檢測(cè)器信號(hào)顯示系統(tǒng)信號(hào)顯示系統(tǒng) 樣品樣品 在紫外可見分光光度計(jì)中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源熱輻射光源和氣體放電光源 1 光源 熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準(zhǔn)直鏡等部分。 2 單色器 單色器質(zhì)量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質(zhì)量。色散元件常用棱鏡棱鏡和光柵和光柵。 吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。 3 吸收池 吸收池的種類很多，其光徑可在0.110

10、cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為常用。4 檢測(cè)器 檢測(cè)器的作用是檢測(cè)光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。現(xiàn)今使用的分光光度計(jì)大多采用光電管或光電倍增管作為檢測(cè)器。5 信號(hào)顯示系統(tǒng) 常用的信號(hào)顯示裝置有直讀檢流計(jì)，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動(dòng)記錄和數(shù)字顯示裝置等。二、紫外-可見分光光度計(jì)的類型 按其光學(xué)系統(tǒng)可分為單波長分光光度計(jì)和雙波長分光光度計(jì)。1.單波長單光束分光光度計(jì) 目前國內(nèi)廣泛采用721型分光光度計(jì)。具有結(jié)構(gòu)簡單、價(jià)格低廉、操作方便、維修也比較容易，適用于常規(guī)分析。 單波長單光束分光光度計(jì)還有國產(chǎn)751型、XG-125型、英國SP500型和伯克曼DU-8型等。2.單波長雙光束分光光度計(jì)

11、單波長雙光束分光光度計(jì)有國產(chǎn)710型、730型、740型、日立UV-340型等就屬于這種類型。3.雙波長分光光度計(jì)雙波長分光光度計(jì)的優(yōu)點(diǎn)：是可以在有背景干憂或共存組分吸收干憂的情況下對(duì)某組分進(jìn)行定量測(cè)定。國產(chǎn)WFZ800-5型、島津UV-260型、UV-265型等。三、分光光度計(jì)的校正和檢驗(yàn)1.波長校正2.吸光度校正3.雜散光的檢驗(yàn)4.穩(wěn)定性的檢驗(yàn) 一、 儀器測(cè)量條件的選擇 1.適宜的吸光度范圍由朗伯-比爾定律可知： A=lg1/T=cl 微分后得： dlgT=0.4343dT/T= -ldc 或 0.4343T/T= -lc代入朗伯-比爾定律有： c/c=0.4343T/TlgT要使測(cè)定的相

12、對(duì)誤差c/c最小最小，求導(dǎo)取極小得出： lgT=-0.4343=A即當(dāng)A=0.4343時(shí)，吸光度測(cè)量誤差最小時(shí)，吸光度測(cè)量誤差最小。 最適宜的測(cè)量范圍為0.20.8之間。 通常是根據(jù)被測(cè)組分的吸收光譜，選擇最強(qiáng)吸收帶的最大吸收波長為入射波長。當(dāng)最強(qiáng)吸收峰的峰形比較尖銳時(shí)，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強(qiáng)峰或肩峰進(jìn)行測(cè)定。 2.入射光波長的選擇3 狹縫寬度的選擇 為了選擇合適的狹縫寬度，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)試樣的吸光度不再增加吸光度不再增加為準(zhǔn)。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。 對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，常利用顯色反應(yīng)將被測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL范圍有吸收的物質(zhì)。常見的顯色反應(yīng)有配位

13、反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等。這些顯色反應(yīng)，必須滿足以下條件： 4.反應(yīng)生成物的組成恒定。3. 反應(yīng)生成的產(chǎn)物有足夠的穩(wěn)定性足夠的穩(wěn)定性，以保證測(cè)量過程中溶液的吸光度不變；2反應(yīng)有較高的選擇性較高的選擇性，即被測(cè)組分生成的化合物吸收曲線應(yīng)與共存物質(zhì)的吸收光譜有明顯的差別；1反應(yīng)的生成物必須在紫外紫外-可見光區(qū)可見光區(qū)有較較強(qiáng)強(qiáng)的吸光能力吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大；1酸度 顯色反應(yīng)最適宜的酸度范圍可通過實(shí)驗(yàn)來確定：測(cè)定某一固定濃度的試樣的吸光度隨酸度的變化，以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液的PH值為橫坐標(biāo)作圖。3.顯色時(shí)間和溫度2.顯色劑的用量 測(cè)定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度（吸光度為0）為10

14、0%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對(duì)光的反消除其它成分及吸光池和溶劑等對(duì)光的反射和吸收帶來的測(cè)定誤差射和吸收帶來的測(cè)定誤差。參比溶液的選擇視分析體系而定，具體有： 1溶劑參比溶劑參比 試樣簡單、共存其它成分對(duì)測(cè)定波長吸收弱，只考慮消除溶劑與吸消除溶劑與吸收池收池等因素； 2試樣參比試樣參比 如果試樣基體溶液在測(cè)定波長有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時(shí)，可按與顯色反應(yīng)相同的條件處理試樣，只是不加入顯色劑。3試劑參比試劑參比 如果顯色劑或其它試劑在測(cè)定波長有吸收，按顯色反應(yīng)相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。 4. 平行操作參比平行操作參比 用不含被測(cè)組分的試樣，在相同的條件下與被測(cè)試樣同時(shí)進(jìn)行處理，由此得到平行操作參比溶液。一、 單組分定量方法 單組分是指樣品溶液中含有一種組分，或者是在混合物溶液中待測(cè)組分的吸收峰與其他共有物質(zhì)的吸收峰無重疊。其定量方法包括校準(zhǔn)曲線法校準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法和吸收系數(shù)法。1 校準(zhǔn)曲線法方法：配制一系列