分子遺傳學(xué)復(fù)習(xí)題

1、1、 比較正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)，你怎么認(rèn)為？正向遺傳學(xué)大規(guī)模隨機(jī)誘變， 產(chǎn)生發(fā)育異常的突變個體，然后再尋找突變的基因正向遺傳學(xué)(forward genetics)經(jīng)典的遺傳學(xué)方法，開始研究突變表型以確定突變基因。最早的一個工具是分子遺傳學(xué)家提出遺傳的篩選。該技術(shù)的目的是為了確定突變，產(chǎn)生一定的表型。經(jīng)常用誘變劑來促進(jìn)這個過程。分離后，突變基因分子可以確定。正向遺傳學(xué)篩查是分子遺傳學(xué)家最初可使用的一種方法。該技術(shù)意在檢定產(chǎn)生特定表型的變異。為了提高變異的速度，常使用誘變劑來實(shí)現(xiàn)。而一旦分離出變異體，就可以鑒定出對應(yīng)的突變基因。傳統(tǒng)的遺傳學(xué)手段大致可以分為“正向遺傳學(xué)”（forward gene

2、tics）和“反向遺傳學(xué)”（reverse genetics）兩類。正向遺傳學(xué)是指，通過生物個體或細(xì)胞的基因組的自發(fā)突變或人工誘變，尋找相關(guān)的表型或性狀改變，然后從這些特定性狀變化的個體或細(xì)胞中找到對應(yīng)的突變基因，并揭示其功能。例如遺傳病基因的克隆。反向遺傳學(xué)的原理正好相反，人們首先是改變某個特定的基因或蛋白質(zhì)，然后再去尋找有關(guān)的表型變化。例如基因剔除技術(shù)或轉(zhuǎn)基因研究。簡單地說，正向遺傳學(xué)是從表型變化研究基因變化，反向遺傳學(xué)則是從基因變化研究表型變化。(本站摘自<生物谷>,08-7-10)反向遺傳學(xué)反向遺傳學(xué)(Reversed Genetics)經(jīng)典遺傳學(xué)的認(rèn)知路線為由表及里，即通

3、過雜交等手段觀察表型性狀的變化而推知遺傳基因的存在與變化。隨著分子遺傳學(xué)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)能夠在分子水平上進(jìn)行操作，有目的地對DNA進(jìn)行重組或者定點(diǎn)突變(in vitro site-directed mutagenesis)等。因此，現(xiàn)代遺傳學(xué)中就出現(xiàn)了另一條由里及表的認(rèn)知路線，即通過DNA重組等技術(shù)有目的地、精確定位地改造基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)以確定這些變化對表型性狀的直接影響。由于這一認(rèn)知路線與經(jīng)典遺傳學(xué)剛好相反，故將這個新的領(lǐng)域作為遺傳學(xué)的一個分支學(xué)科，稱為反向遺傳學(xué)。例如，將報告基因(reporter gene)，即編碼易于檢測的蛋白質(zhì)或酶的某些基因，分別與某些待測的DNA片段重組，轉(zhuǎn)

4、染合適的細(xì)胞，通過測定報告基因的產(chǎn)物即可推斷該片段在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。反向遺傳學(xué)是相對于經(jīng)典遺傳學(xué)而言的。經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的性狀、表型到遺傳物質(zhì)來研究生命的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律。反向遺傳學(xué)則是在獲得生物體基因組全部序列的基礎(chǔ)上,通過對靶基因進(jìn)行必要的加工和修飾,如定點(diǎn)突變、基因插入缺失、基因置換等,再按組成順序構(gòu)建含生物體必需元件的修飾基因組,讓其裝配出具有生命活性的個體,研究生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能,以及這些修飾可能對生物體的表型、性狀有何種影響等方面的內(nèi)容。與之相關(guān)的研究技術(shù)稱為反向遺傳學(xué)技術(shù)。2、 設(shè)計一個遺傳篩選試驗(yàn)？3、 調(diào)控元件1、增強(qiáng)子（Enhancer） 位于結(jié)構(gòu)基因附近，能夠

5、增強(qiáng)該基因轉(zhuǎn)錄活性的一段DNA順序稱為增強(qiáng)子（enhancer）（圖）。增強(qiáng)子的特點(diǎn)（Characteristics of Enhancer） 增強(qiáng)子的作用特點(diǎn)包括： 在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5'或3'側(cè)均能起作用； 相對于啟動子的任一指向均能起作用； 發(fā)揮作用與受控基因的遠(yuǎn)近距離相對無關(guān)； 對異源性啟動子也能發(fā)揮作用； 通常具有一些短的重復(fù)順序。增強(qiáng)子的種類(Types of Enhancer) 2、終止子（Terminator） 位于基因編碼區(qū)下游，能夠終止RNA轉(zhuǎn)錄合成的特殊DNA序列稱為終止子（terminator）。原核生物的終止子均具有回文結(jié)構(gòu)，可分為依賴因子和不依賴因子的終止

6、子兩種類型。真核生物的終止子則與polyA尾的添加相偶聯(lián)。 3、沉默子（Silencer） 位于結(jié)構(gòu)基因附近，能抑制該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的DNA序列稱為沉默子（silencer）。沉默子是一種負(fù)性調(diào)控元件。其作用特征與增強(qiáng)子類似，在組織細(xì)胞特異性或發(fā)育階段特異性的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用（圖）。4、絕緣子（Insulator） 在基因組內(nèi)建立獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域的邊界DNA序列稱為絕緣子/隔離子（insulator）。絕緣子能夠阻止鄰近的增強(qiáng)子或沉默子對其界定的基因的啟動子發(fā)揮調(diào)控作用。 絕緣子的抑制作用具有“極性”的特點(diǎn)，即只抑制處于絕緣子所在邊界另一側(cè)的增強(qiáng)子或沉默子，而對處于同一染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)

7、的增強(qiáng)子或沉默子沒有作用（圖）。 絕緣子由多種組分所構(gòu)成，它們自主協(xié)同阻斷增強(qiáng)子或沉默子的作用。原核生物大多數(shù)基因表達(dá)調(diào)控是通過操縱子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。操縱子通常由 2個以上的編碼序列與啟動序列、操縱序列以及其他調(diào)節(jié)序列在基因組中成簇串聯(lián)組成。啟動序操縱子 操縱子列是RNA聚合酶結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列。多種原核基因啟動序列特定區(qū)域內(nèi)，通常在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-10及-35區(qū)域存在一些相似序列，稱為共有序列。大腸桿菌及一些細(xì)菌啟動序列的共有序列在-10區(qū)域是TATAAT，又稱Pribnow盒（PribnowBox），在-35區(qū)域?yàn)?TTGACA。這些共有序列中的任一堿基突變或變異都會影響RNA聚合

8、酶與啟動序列的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始。因此，與共有序列的一致度決定啟動序列的轉(zhuǎn)錄活性大小。操縱序列是原核阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)操縱序列結(jié)合阻遏蛋白時會阻礙RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移動，阻遏轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)。原核操縱子調(diào)節(jié)序列中還有一種特異DNA序列可結(jié)合激活蛋白，使轉(zhuǎn)錄激活，介導(dǎo)正性調(diào)節(jié)。 5乳糖操縱子乳糖操縱子包括調(diào)節(jié)基因、啟動基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因。乳糖操縱子大腸桿菌的lac操縱子受到兩方面的調(diào)控：一是對RNA聚合酶結(jié)合到啟動子上去的調(diào)控（正調(diào)控）；二是對操縱基因的調(diào)控（負(fù)調(diào)控）。在含葡萄糖的培養(yǎng)基中大腸桿菌不能利用乳糖，只有改用乳糖時才能利用乳糖。調(diào)控機(jī)

9、理是：當(dāng)在培養(yǎng)基中只有乳糖時由于乳糖的代謝產(chǎn)物異乳糖是lac操縱子的誘導(dǎo)物，它可以結(jié)合在阻遏蛋白的變構(gòu)位點(diǎn)上，使構(gòu)象發(fā)生改變，破壞了阻遏蛋白與操縱基因的親和力，不能與操縱基因結(jié)合，于是RNA聚合酶結(jié)合于啟動子，并順利地通過操縱基因，進(jìn)行結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量分解乳糖的酶，這就是當(dāng)大腸桿菌的培養(yǎng)基中只有乳糖時利用乳糖的原因。在含乳糖的培養(yǎng)基中加入葡萄糖時，不能利用乳糖的原因，即在lac操縱子的調(diào)控中，有降解物基因活化蛋白（CAP），當(dāng)它特異地結(jié)合在啟動子上時，能促進(jìn)RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄（由于CAP的結(jié)合能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，稱為陽性調(diào)控方式）。但游離的CAP不能與啟動子結(jié)合，必須在細(xì)胞內(nèi)有

10、足夠的cAMP時，CAP首先與cAMP形成復(fù)合物，此復(fù)合物才能與啟動子相結(jié)合。葡萄糖的降解產(chǎn)物能降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量，當(dāng)向乳糖培養(yǎng)基中加入葡萄糖時，造成cAMP濃度降低，CAP便不能結(jié)合在啟動子上。此時即使有乳糖存在，RNA聚合酶不能與啟動子結(jié)合，雖已解除了對操縱基因的阻遏，也不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所以仍不能利用乳糖。常染色質(zhì)與異染色質(zhì)的區(qū)別與聯(lián)系（1）兩者結(jié)構(gòu)上連續(xù),化學(xué)性質(zhì)上沒有差異,只是核酸螺旋化程度(密度)不同.（2）異染色質(zhì)在間期的復(fù)制晚于常染色質(zhì).（3）異染色質(zhì)間期仍然高度螺旋化狀態(tài),緊密卷縮(異固縮),而常染色質(zhì)區(qū)處于松散狀態(tài),染色質(zhì)密度較低.（4）異染色質(zhì)在遺傳功能上是惰性的,一般

11、不編碼蛋白質(zhì),主要起維持染色體結(jié)構(gòu)完整性的作用常染色質(zhì)間期活躍表達(dá),帶有重要的遺傳信息.常染色體：賴氨酸 9 of Histone H3 is unmethylated. 賴氨酸 4 of Histone H3 is methylated異染色體（相反）DNA微陣列（DNA Microarray）也叫寡核苷酸陣列（Oligonucleitide array），是生物芯片中的一種。該技術(shù)的原理是在固體表面上集成已知序列的基因探針，被測生物細(xì)胞或組織中大量標(biāo)記的核酸序列與上述探針陣列進(jìn)行雜交，通過檢測相應(yīng)位置雜交探針，實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測。DNA微陣列技術(shù)的主要流程：芯片的制備：DNA芯片的制備

12、方法有光引導(dǎo)原位合成法、化學(xué)噴射法、接觸式點(diǎn)涂法、原位DNA控制合成、非接觸微機(jī)械印刷法TOPSPOT和軟光刻復(fù)制等。目前已能將40萬種不同的DNA分子放在1 cm2的芯片上。樣品的制備：包括樣品DNA或RNA的分離提純和用PCR技術(shù)對靶基因片段擴(kuò)增以及對靶基因標(biāo)記。雜交反應(yīng)：選擇合適的反應(yīng)條件使生物分子間的反應(yīng)處于最適反應(yīng)條件。芯片雜交屬固-液相雜交，影響雜交的有諸多因素，其中包括：靶標(biāo)濃度、探針濃度、雜交雙方的序列組成、鹽濃度、溫度及洗滌條件。芯片信號的檢測與分析：樣品中靶基因與固定在芯片上的探針發(fā)生特異性雜交而結(jié)合在芯片上的不同點(diǎn)，熒光素分子受特定波長的激發(fā)光照射出特定波長的熒光。通過特

13、定的掃描儀獲取雜交后的信號。DNA微陣列技術(shù)最突出的特點(diǎn)就是可一次性檢測多種樣品，獲得多種基因的差別表達(dá)圖譜，已成功地運(yùn)用cDNA微陣列同時檢測l萬多個基因的表達(dá)。因此，DNA微陣列是對不同材料中的多個基因表達(dá)模式進(jìn)行平行對比分析的一種高產(chǎn)出的、新的基因分析方法。與傳統(tǒng)研究基因差異表達(dá)的方法相比，它具有微型化、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，以及在同一芯片上同時大信息量平行檢測的優(yōu)勢。DNA微陣列技術(shù)在基因表達(dá)圖譜的繪制、尋找目的基因和功能基因等研究方面已取得了顯著的成績。但其不足之處在于所點(diǎn)樣的序列并不都是試驗(yàn)需要檢測的，且試驗(yàn)所需要的分析儀器比較復(fù)雜。另外，DNA微陣列技術(shù)在分析低豐度轉(zhuǎn)錄體方面比較

14、有限，要確保某種低豐度轉(zhuǎn)錄體包含于DNA微陣列上，需挑選非常大量的克隆進(jìn)行擴(kuò)增點(diǎn)樣.5.3 真核生物RNA的合成與加工mRNA的加工修飾包括：5端形成帽子結(jié)構(gòu)、3端加polyA、剪接除去內(nèi)含子和甲基化。5-端加帽成熟的真核生物mRNA的5-端有m7GPPPN結(jié)構(gòu)，稱為甲基鳥苷帽子。它是在RNA三磷酸酶，mRNA鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶，mRNA（鳥嘌呤-7）甲基轉(zhuǎn)移酶和mRNA（核苷-2）甲基轉(zhuǎn)移酶催化形成的。不同的甲基化可形成3種帽子類型：0、1和2。鳥苷以5-5三磷酸鍵與RNA的5-端相連。當(dāng)G第7位C被甲基化形成m7GPPPN時，此結(jié)構(gòu)稱為“帽子0”。存在于單細(xì)胞生物。如果RNA的第1位核苷酸的2-

15、O位也甲基化，形成m7GPPPNm，稱為“帽子1”，普遍存在；如果RNA的第1、2位核苷酸的2-O位均甲基化（2位必需是A），成為m7G-PPPNmNm，稱為“帽子2”，此結(jié)構(gòu)發(fā)生很少。真核生物帽子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度與生物進(jìn)化程度關(guān)系密切。5帽子的功能mRNA 5-端帽子結(jié)構(gòu)是翻譯起始所必要的，為核糖體識別mRNA提供了信號，并協(xié)助核糖體與mRNA結(jié)合使翻譯從AUG開始。帽子結(jié)構(gòu)可增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA免遭53核酸外切酶的攻擊。在3-端加尾巴大多數(shù)真核mRNA在3-端都有約150200nt的Poly（A）尾巴。Poly（A）尾是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上的。根據(jù)Poly（A）尾巴的特點(diǎn)可從眾多的

16、RNA中分離mRNA。真核基因的3端有AATAA、YGTGTGYY（Y為嘧啶）序列，作為mRNA 3-端加polyA尾的信號。hnRNA鏈被RNase在加尾巴信號下游1130nt處切斷磷酸二酯鍵，polyA聚合酶催化在3-OH上逐一引入100250個A。Poly（A）尾巴的功能防止核酸外切酶對mRNA信息序列的降解，起緩沖作用?？赡芘cmRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)送到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。但是相當(dāng)數(shù)量的沒有polyA尾巴的mRNA如組蛋白mRNA，也能通過核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。Poly（A）尾巴可能對真核mRNA的翻譯效率具有某種作用，使mRNA較容易被核糖體辨認(rèn)。3-脫氧腺苷（冬蟲夏草素）是多聚腺苷酸化的特異抑制劑，但

17、它不抑制hnRNA的轉(zhuǎn)錄，它的存在可阻止細(xì)胞中出現(xiàn)新的mRNA，表明多聚腺苷酸化對mRNA的成熟是必要的。mRNA甲基化真核mRNA往往有甲基化位點(diǎn)，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。這種甲基化修飾對翻譯沒有必要，可能在mRNA前體加工中起識別作用。mRNA前體（hnRNA）的拼接真核生物的結(jié)構(gòu)基因中具有可表達(dá)活性的外顯子，也含有無表達(dá)活性的內(nèi)含子（斷裂基因）。內(nèi)含子的數(shù)量與所在基因的大小有關(guān)。許多基因中的內(nèi)含子參與基因表達(dá)調(diào)控。外顯子一般大小為100200pb，內(nèi)含子1kb。RNA編輯(RNA editing)RNA編輯同基因的選擇剪接或可變剪接(alternative splicing)

18、一樣，使得一個基因序列有可能產(chǎn)生幾種不同的蛋白質(zhì)，這可能是生物在長期進(jìn)化過程中形成的、更經(jīng)濟(jì)有效地擴(kuò)展原有遺傳信息的機(jī)制。RNA編輯是通過比較成熟的mRNA與相應(yīng)基因的編碼信息時發(fā)現(xiàn)的，成熟的mRNA序列中有幾種意想不到的變化，包括尿嘧啶（U）突變?yōu)榘奏ぃ–）、胞嘧啶突變?yōu)槟蜞奏?、尿嘧啶的插入或缺失、多個鳥嘌呤（G）或胞嘧啶的插入等。由于RNA編輯是基因轉(zhuǎn)錄后在mRNA中插入、缺失或核苷酸的替換而改變DNA模板來源的遺傳信息，翻譯出多種氨基酸序列不同的蛋白質(zhì)，RNA編輯的結(jié)果不僅擴(kuò)大了遺傳信息，而且使生物更好地適應(yīng)生存環(huán)境。有些基因的主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必須經(jīng)過編輯才能有效地起始翻譯，或產(chǎn)生正確的可

19、讀框(ORF)。RNA修飾方式分別是N6-甲基腺苷化修飾（N6-methyladenosine, m6A），以及尿苷化修飾（uridylation，U-tail）。前者也就是第5個堿基N6-甲基腺苷（m6A）。RNA剪接（RNA splicing）：從DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄出的最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中除去內(nèi)含子，并將外顯子連接起來形成一個連續(xù)的RNA分子的過程。關(guān)鍵是依賴于剪接位點(diǎn)的判定.真核細(xì)胞pre-mRNA的剪接位點(diǎn)處存在一定的序列保守性，對于它所對應(yīng)的cDNA序列而言，內(nèi)含子5端（供體位點(diǎn)）和3端（受體位點(diǎn)）的堿基幾乎都是GU和AG，因此稱為GU-AG規(guī)則。RNA的再編碼mRNA在某些情況下不是以固定

20、的方式翻譯，而可以改變原來的編碼信息，以不同的方式進(jìn)行編碼 包括：+1/-1移位；核糖體跳躍剪接連接點(diǎn)（splicing junctions)是指在切斷和重接位點(diǎn)處的兩旁的順序。在內(nèi)含子左側(cè)的連接點(diǎn)稱為供體（donor)，在內(nèi)含子右側(cè)的稱為受體（acceptor)。在細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)基因（即編碼多肽的基因）中的所有內(nèi)含子在外顯子-內(nèi)含子連接處均有GU.AG的共同順序。MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA，幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因?？梢酝ㄟ^幾個miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個基因的表達(dá)。據(jù)推測，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。MicroRNA

21、存在多種形式，最原始的是pri-miRNA，長度大約為3001000個堿基；pri-miRNA經(jīng)過一次加工后，成為pre-miRNA即microRNA前體，長度大約為7090個堿基；pre-miRNA再經(jīng)過Dicer酶酶切后，成為長約2024nt的成熟miRNA。是一種大小約2123個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成.在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達(dá)模式具有分化的位相性和時序性提示miRNAs有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子，因而具有重要意義。RNA干擾（RNA interfer

22、ence, RNAi）是指由dsRNA介導(dǎo)的同源RNA降解過程?；虺聊?，主要有轉(zhuǎn)錄前水平的基因沉默(TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類機(jī)理：病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約2123 bp），即siRNA。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-i

23、nduced silencing complex，RISC)。RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完

24、全降解。同義突變：堿基被替換之后,產(chǎn)生了新的密碼子，但由于生物的遺傳密碼子存在簡并現(xiàn)象,新舊密碼子仍是同義密碼子，所編碼的氨基酸種類保持不變，因此同義突變并不產(chǎn)生突變效應(yīng)。非同義突變：不導(dǎo)致氨基酸改變的核苷酸變異我們稱為同義突變，反之則稱為非同義突變。一般認(rèn)為，同義突變不受自然選擇，而非同義突變則受到自然選擇作用。在進(jìn)化分析中，了解同義突變和非同義突變發(fā)生的速率是很有意義的。常用的參數(shù)有以下幾種：同義突變頻率(Ks)、非同義突變頻率(Ka)、非同義突變率與同義突變率的比值(Ka/Ks)。如果Ka/Ks>1，則認(rèn)為有正選擇效應(yīng)。如果Ka/Ks=1，則認(rèn)為存在中性選擇。如果Ka/Ks<

25、1，則認(rèn)為有純化選擇作用。無義突變（nonsense mutation ）是指由于某個堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，從而使肽鏈合成提前終止。 編碼氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，使肽鏈合成中斷。移碼突變：在正常的DNA分子中，堿基缺失或增加非3的倍數(shù)，造成這位置之后的一系列編碼發(fā)生移位錯誤的改變，這種現(xiàn)象稱移碼突變。翻譯：翻譯過程需要的原料：mRNA、tRNA、20種氨基酸、能量、酶、核糖體。翻譯的過程大致可分作三個階段：起始、延長、終止。翻譯主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核糖體中進(jìn)行，過程：氨基酸分子在氨基酰-tRNA合成酶的催化作用下與特定的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA結(jié)合并被帶到核糖體上。生成的多

26、肽鏈（即氨基酸鏈）需要通過正確折疊形成蛋白質(zhì)，許多蛋白質(zhì)在翻譯結(jié)束后還需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行翻譯后修飾才能具有真正的生物學(xué)活性。翻譯后修飾：前體蛋白是沒有活性的，常常要進(jìn)行一個系列的翻譯后加工，才能成為具有功能的成熟蛋白。翻譯后修飾包括以下加入官能團(tuán)的反應(yīng)：1、 磷酸化加入磷酸根至絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸或組氨酸。2、糖基化將糖基加入天冬酰胺、羥離氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，形成糖蛋白。3、甲基化烷基化中常見的一種，在賴氨酸、精氨酸等的側(cè)鏈氨基上加入甲基。4、泛素化 主要在蘇氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和賴氨酸。5、乙酰化通常于蛋白質(zhì)的N末端加入乙酰。DNA甲基化與CpG島： 在人類表觀遺傳學(xué)研究中，最常見的就

27、是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修飾。其主要過程是，在CpG甲基化結(jié)合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成為5甲基胞嘧啶。在正常人類的DNA中，約有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳動物中，約有50,000,000個CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非隨機(jī)的分布于基因組序列中，相反，在基因組的某些區(qū)域中，通常是基因的啟動子區(qū)域，5端非翻譯區(qū)和第一個外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過均值5倍以上

28、，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)，稱之為CpG島(CpG Islands, CGIs)。DNA甲基化檢測方法： 根據(jù)研究水平，又將這些方法歸為3大類，即：基因組甲基化水平(Methylation Content)的分析，候選基因甲基化分析，和基因組層次的DNA甲基化模式(Methylation pattern)與甲基化譜(Methylation Profiling)分析。主要方法分述如下：A 基因組甲基化水平(Methylation Content)的分析:1. 高效液相色譜(High-performance Liquid Chromatography, HPLC) 2. 高效毛細(xì)管電泳法(Hig

29、h-performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 以上各種方法雖然能夠明確檢測出目的序列中所有CpG位點(diǎn)的甲基化狀況，但并不能對甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定位。B候選基因(Candidate Gene)甲基化分析:1. 甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法( methylation-sensitive restriction Endonuclease -PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern) 2. 重亞硫酸鹽測序法(Bisulphite Sequencing)該方法首先用重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變

30、成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴(kuò)增所需片段,則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較,判斷是否CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化。此方法是精確度很高，能明確目的片段中每一個CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，但需要大量的克隆測序,過程較為繁瑣、昂貴。3. 甲基化特異性的PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR) 該方法同樣DNA先用重亞硫酸鹽處理，隨后行引物特異性的PCR。4. 甲基化熒光法(MethyLight)5. 焦磷酸測序(Pyrosequencing)6. 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulfiter

31、estriction analysis, COBRA) C. 基因組范圍的DNA甲基化模式(Methylationpattern)與甲基化譜(Methylation Profiling)分析: 1. 限制性標(biāo)記基因組掃描(Restriction Landmark Genomic Scanning, RLGS)2. 甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增(amplification of inter-methylated sites, AIMS) 3. 甲基化CpG島擴(kuò)增(Methylated CpG-island amplification, MCA) 4. 差異甲基化雜交(Differential Methyl

32、ation Hybridization,DMH) 5. 由連接子介導(dǎo)PCR出的HpaII小片斷富集分析(HpaII tiny fragement Enrichment by Ligation-mediated PCR, HELP) 6. 甲基化DNA免疫沉淀法(Methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP)這是一種高效富集甲基化DNA的方法。種種方法都有其局限性，諸如對酶的依賴，PCR擴(kuò)增的問題，芯片數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化問題等等。Methods to Study DNA methylation（1）Locus-specific: Southern blots

33、with methylation-sensitive isoschizomers(e.g. HpaII/MspI) or methylation-specific enzymes (McrBC) DNA methylation-sensitive chop-PCR Bisulfite genomic sequencing Bisulfite treatment converts C (but not methyl-C) to U Bisulfite treat DNA + PCR + clone + sequence clones（2）Genome-wide: Digest DNA with

34、methylation-sensitive or methylationspecificenzymes + microarray hybridization or sequencing Affinity purification or immunoprecipitation of methylatedDNA + microarray hybridization or sequencing Bisulfite treat DNA + high-throughput sequencing去甲基化有兩種方式： 1） 被動途徑： 由于核因子N F 粘附甲基化的DNA，使粘附點(diǎn)附近的DNA不能被完全甲基

35、化，從而阻斷DNM T1 的作用； 2） 主動途徑： 是由去甲基酶的作用，將甲基基團(tuán)移去的過程。在DNA 甲基化阻遏基因表達(dá)的過程中，甲基化CpG 粘附蛋白起著重要作用。雖然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感轉(zhuǎn)錄因子E2F、CREB、A P2、CM yc&ouml;M yn、N F2KB、Cmyb、Ets，使它們失去結(jié)合DNA 的功能從而阻斷轉(zhuǎn)錄，但是，甲基化CpG 粘附分子可作用于甲基化非敏感轉(zhuǎn)錄因子（SP1、CTF、YY1）,使它們失活，從而阻斷轉(zhuǎn)錄。人們已發(fā)現(xiàn)5 種帶有恒定的甲基化DNA 結(jié)合域（MBD ) 的甲基化CpG 粘附蛋白。其中M ECP2、MBD1、MBD2、MBD

36、3 參與甲基化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄阻遏；MBD1 有糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可將T 從錯配堿基對T&ouml;G 中移去，MBD4 基因的突變還與線粒體不穩(wěn)定的腫瘤發(fā)生有關(guān)。在MBD2 缺陷的小鼠細(xì)胞中，不含M ECP1 復(fù)合物，不能有效阻止甲基化基因的表達(dá)。這表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的選擇，以及DNA 甲基化與組蛋白去乙?；?、染色質(zhì)重組相互聯(lián)系中的有重要作用。染色質(zhì)修飾：異染色質(zhì)甲基化、組蛋白甲基化（復(fù)雜、保守，作用：Transcription activation， Transcription repression， Heterochromatin formation，DNA methylation，Imprinting，X chromosome inactivation），去甲基化、DNA為什么要包裝在His中？Why DNA needs to bepackaged? Efficient way of geneticinformation storageAn elegant way of ge