堿性磷酸酶染色NAP

1、 堿性磷酸酶染色（NAP） 目的 掌握卡氏偶氮偶聯(lián)法測定中性粒細胞堿性磷酸酶染色的原理、 方法、注意事項和臨床意義。 原理 中性粒細胞胞質(zhì)中的堿性磷酸酶在pH9.6的堿性條件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀定位于胞質(zhì)中的酶活性處。重氮鹽有多種，常用的有堅牢藍RR、堅牢藍BB、堅牢紫醬等。 1新鮮干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水輕輕沖洗3060s，待干。把涂片浸入基質(zhì)孵育液中，在室溫(冬季放水浴箱)下溫育1015min。流水沖洗1 2min，加蘇木素染色液中復染58min，流水沖洗，待干，鏡檢。結(jié)果判斷胞質(zhì)中出現(xiàn)紫黑色或棕紅色顆粒為陽性。判斷標準

2、如下： 0分：胞質(zhì)中無陽性染色顆粒。 1分：胞質(zhì)中含少量顆?；虺蕪浡\色。 2分：胞質(zhì)中含中等量的顆粒或呈彌漫著色。 3分：胞質(zhì)中含較多顆?；驈浡^深色。 4分：胞質(zhì)中充滿粗大顆?；驈浡钌? 計算陽性率和積分值。 方法步驟2磷酸萘酚鹽和重氮試劑品種繁多，應(yīng)根據(jù)基質(zhì)選擇相適應(yīng)的重氮鹽，堅牢藍等重氮鹽的質(zhì)量好壞是本法成敗的關(guān)鍵?；|(zhì)孵育液必須臨用前新鮮配制，先應(yīng)將血膜固定干燥后，才開始配制基質(zhì)液。若無2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇，可用巴比妥緩沖液(pH9.2)或0.2mol/L Tris緩沖液(pH9.2)代替。 注意事項3 臨床上主要用于鑒別：1.慢性粒細胞白血病與類白血病反應(yīng)： 慢性

3、粒細胞白血病(無繼發(fā)性感染者)時，NAP積分一般明顯下降，積分常13分，甚至為零分；類白血病反應(yīng)時則顯著增高，積分常200分。2.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥與再生障礙性貧血： 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥常降低；再生障礙性貧血常增高，病情好轉(zhuǎn)時，NAP積分則可逐漸下降。3.急性白血病的細胞類型：ALL增高，AML下降。臨床意義4 鐵染色（Iron stain）目的 掌握骨髓鐵染色的原理、方法、注意事項及臨床意義。原理 骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其所含的三價鐵經(jīng)稀鹽酸處理后而游離，并能與酸性亞鐵氰化鉀溶液發(fā)生普魯士藍反應(yīng)，生成藍色亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位。細胞內(nèi)鐵也可用此法顯示，根據(jù)反

4、應(yīng)的強弱可了解骨髓中鐵的含量。5干燥涂片用甲醇固定10min，待干。玻片上滴滿酸性亞鐵氰化鉀，37染色30min。用蒸餾水沖洗后用核固紅染液復染1015min。流水沖洗，待干，鏡檢。結(jié)果判斷 (1) 幼紅細胞核呈鮮紅色，胞質(zhì)呈淡黃紅色，鐵粒呈藍綠色。(2) 細胞外鐵 用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注 意翠藍色顆粒的存在，可分五級標準。(3) 細胞內(nèi)鐵 用油鏡計數(shù)100個中、晚幼紅細胞，記錄胞質(zhì)中含有藍色鐵顆粒的細胞(鐵粒幼細胞)的百分率。根據(jù)細胞內(nèi)鐵顆粒的數(shù)目、大小、染色深淺和顆粒分布的情況，將鐵粒幼細胞分為四型。方法步驟6細胞外鐵的劃分標準:(-)：無顆粒。(+)：有少數(shù)鐵顆粒

5、或偶見鐵小珠(顆粒體積大于嗜酸性粒細胞的顆粒者 稱為鐵小珠)。(+)：有較多的鐵顆?；蛐≈?。(+)：有很多的鐵顆粒、小珠和少數(shù)小塊狀。(+)：有極多鐵顆粒、小珠，并有很多的小塊，密集成堆。鐵粒幼細胞劃分：型：幼紅細胞內(nèi)含12個小鐵顆粒。型：幼紅細胞內(nèi)含35個小鐵顆粒。型：幼紅細胞內(nèi)含610個小鐵顆粒，或1-4個大鐵顆粒。型：幼紅細胞內(nèi)含10個以上小鐵顆粒，或5個以上大鐵顆粒。 環(huán)形鐵粒幼細胞：是指幼紅細胞含鐵粒6個，繞核2/3以上者。7玻片需經(jīng)去鐵處理 將新玻片用清潔液浸泡24h，取出后反復水洗浸入95%酒精中24h，晾干，再浸泡在5%鹽酸中24h，用雙蒸水反復浸洗玻片，取出烤干后備用。骨髓取材要滿意，外鐵一定要有骨髓碎塊或顆粒，取材不佳時，往往影響結(jié)果。酸性亞鐵氰化鉀溶液須新鮮配制。注意事項8鑒別缺鐵性貧血和非缺鐵性貧血：IDA時骨髓細胞外鐵顯著減少或消失，鐵粒幼紅細胞明顯減少，所見鐵粒細小色淺，且以型為主，型極少見，型以上不見。經(jīng)鐵劑治療后細胞外鐵及內(nèi)鐵可迅速增多，此檢查是診斷IDA及指導鐵劑治療的一種輔助方法；非IDA，如HA、MA、AA等病人的細胞外鐵通常增高，內(nèi)鐵亦增高，以型、型為主，可以見到型，罕見型。因此，有助于鑒別I