吸光光度法設(shè)計和分析法

1、吸光光度法設(shè)計和分析法6.1 概述6.2 光度分析法的設(shè)計 6.3 光度分析法的誤差6.4 其他吸光光度法及光度分析法的應(yīng)用7.1 概述1 吸光光度法的特點2 光吸收的基本定律3 比色法和吸光光度法及其儀器 6.1.1 吸光光度法的特點 1 定義：吸光光度法是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法，包括比色法、可見及紫外吸光光度法及紅外光譜法等。我們重點討論可見光區(qū)的吸光光度法。 1.光的基本性質(zhì) 2. 吸收光譜產(chǎn)生的原理* 吸收光譜分為：原子吸收光譜和分子吸收光譜。是因物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收作用而產(chǎn)生的。* 原子吸收光譜 Atomic absorption spectrum

2、由原子外層電子選擇性地吸收某些波 長的電磁波而引起的，為線狀光譜。 線狀光譜 - Line spectrum* 分子吸收光譜 -帶狀光譜 molecular absorption spectrum 由電子能級躍遷而產(chǎn)生吸收光譜能量差在120(eV)，是紫外及可見分光光度法。 UV/Vis Spectrophotometry 由分子振動能級(能量差約0.05l eV)和轉(zhuǎn)動能級(能量差小于0.05 eV)的躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜，為紅外吸收光譜。用于分子結(jié)構(gòu)的研究。 Infrared Spectrophotometry帶狀光譜 Band spectrum* 單色光（monochromatic li

3、ght）：具同一波長的光。* 復(fù)合光（multiplex light）：由不同波長組成的光。* 紫外光（ultraviolet light）：波長200400 nm。* 可見光（visible light）：人眼能感覺到的光，波長在400750 nm。它是由紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等各種色光按一定比例混合而成的* 波段（wave band）：各種色光的波長范圍不同。* 互補色光（complementary color light）：按一定比例混合，得到白光（white light）。* 物質(zhì)的顏色是因物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收作用而產(chǎn)生的。* 吸收光譜曲線或光吸收曲線（ absorpt

4、ion curve）：以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖。* 最大吸收波長（maximum absorption wavelengh ）：光吸收程度最大處的波長，用max表示* 吸光度（absorbance） 在可見光，KMnO4溶液對波長525 nm附近綠色光的吸收最強，而對紫色和紅色的吸收很弱。max=525 nm。濃度不同時，光吸收曲線形狀相同， max不變，吸光度不同。 3.目視比色法(colorimetry)和吸光光度法的特點 a 靈敏度高。常用于測定試樣中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%10-5的微量組分，甚至可測定低至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-610-8的痕量組分。 b 準(zhǔn)確度較高。目視比色法的相對誤差為5

5、%10%，吸光光度法為2%5%。 c 應(yīng)用廣泛。幾乎所有的無機離子和許多有機化合物都可以直接或間接地用目視比色法或吸光光度法進(jìn)行測定。 d 儀器簡單、操作簡便、快速。 6.1.2 光吸收的基本定律 1. 朗伯-比爾定律 （Lambert-Beer law） 當(dāng)一束平行單色光通過任何均勻、非散射的固體、液體或氣體介質(zhì)時，一部分被吸收，一部分透過介質(zhì)，一部分被器皿的表面反射。如圖6-3所示，設(shè)人射光強度為I0，吸收光強度為Ia，透過光強度為It，反射光強度為Ir。 在吸光光度分析法中，試液和空白溶液分別置于同樣質(zhì)料及厚度的吸收池中，然后讓強度為I0的單色光分別通過這兩個吸收池，再測量其透過光的強度

6、。此時反射光強度基本上是不變的，且其影響可以相互抵消。 透射比或透光度 （Transmittance） 透過光強度It與人射光強度Io之比稱為透射比或透光度，用T表示溶液的透射比愈大，表示它對光的吸收愈小;相反，透射比愈小，表示它對光的吸收愈大。 朗伯(Lambert J H)和比爾(Beer A)分別于1760和1852年研究了光的吸收與溶液層的厚度及溶液濃度的定量關(guān)系，二者結(jié)合稱為朗伯-比爾定律，也稱為光的吸收定律。 當(dāng)一束強度為I0的平行單色光垂直照射到長度為b的液層、濃度為c的溶液時，由于溶液中吸光質(zhì)點(分子或離子)的吸收，通過溶液后光的強度減弱為I：* 朗伯-比爾定律表明：當(dāng)一束單色

7、光通過含有吸光物質(zhì)的溶液后，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)的濃度及吸收層厚度成正比。這是進(jìn)行定量分析的理論基礎(chǔ)。比例常數(shù)K與吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長及溫度等因素有關(guān)。* 含有多種吸光物質(zhì)的溶液，由于各吸光物質(zhì)對某一波長的單色光均有吸收作用，若各吸光物質(zhì)的吸光質(zhì)點之間相互不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，當(dāng)某一波長的單色光通過這樣一種含有多種吸光物質(zhì)的溶液時，溶液的總吸光度應(yīng)等于各吸光物質(zhì)的吸光度之和。這一規(guī)律稱吸光度的加和性。 2. 摩爾吸收系數(shù)和桑德爾靈敏度 * 摩爾吸收系數(shù) molar absorptivity 當(dāng)濃度c用molL-1，液層厚度b用cm為單位表示，則K用另一符號來表示。稱為摩爾吸收系數(shù)，單位為Lm

8、ol-lm-1，它表示物質(zhì)的量濃度為l molL-1，液層厚度為l cm時溶液的吸光度。* 桑德爾(Sandell)靈敏度(靈敏度指數(shù)) S來表示。S是指當(dāng)儀器的檢測極限A時，單位截面積光程內(nèi)所能檢測出來的吸光物質(zhì)的最低含量，其單位為gcm-2，S與及吸光物質(zhì)摩爾質(zhì)量M的關(guān)系為： 6.1.3 比色法和吸光光度法及其儀器 1. 目視比色法 colorimetry 用眼睛觀察、比較溶液顏色深度以確定物質(zhì)含量的方法。優(yōu)點是儀器簡單，操作簡便，適宜于大批試樣的分析。靈敏度高，因為是在復(fù)合光-白光下進(jìn)行測定，故某些顯色反應(yīng)不符合朗伯-比爾定律時，仍可用該法進(jìn)行測定。主要缺點是準(zhǔn)確度不高，標(biāo)準(zhǔn)系列不能久存

9、，需要在測定時臨時配制。 2 吸光光度法 Spectrophotometry 借助分光光度計來測量一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)被測試液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得被測物質(zhì)的濃度或含量。 Standard curve- calibrated curve- working curve 吸光光度法與目視比色法在原理上不同。吸光光度法是比較有色溶液對某一波長光的吸收情況，目視比色法則是比較透過光的強度。例如，測KMnO4的含量，吸光光度法測量的是KMnO4溶液對黃綠色光的吸收情況，目視比色法則是比較KMnO4溶液透過紅紫色光的強度。 *吸光光度法特點：入射光是純度較高的單色光，故便偏離朗伯

10、-比爾定律的情況大為減少，標(biāo)準(zhǔn)曲線直線部分的范圍更大，分析結(jié)果的準(zhǔn)確度較高。因可任意選取某種波長的單色光，故利用吸光度的加和性，同時測定溶液中兩種或兩種以上的組分。由于入射光的波長范圍擴大了，許多無色物質(zhì)，只要它們在紫外或紅外光區(qū)域內(nèi)有吸收峰，都可以測定。 3. 分光光度計及其基本部件 分光光度計按工作波長范圍分類，紫外、可見分光光度計應(yīng)用于無機物和有機物含量的測定，紅外分光光度計主要用于結(jié)構(gòu)分析。分光光度計又可分為單光束和雙光束兩類。722型分光光度計是數(shù)字顯示的單光束、可見分光光度計（recording spectrophotometer）。 舊的光電比色計 （ photoelectric

11、 colorimeter） 分光光度計的基本部件:光源、單色器、比色皿、檢測器和顯示裝置。 a.光源 （light source） 用612 V鎢絲燈作可見光區(qū)的光源，發(fā)出的連續(xù)光譜在360800 nm 范圍內(nèi)。光源應(yīng)該穩(wěn)定，即要求電源電壓保持穩(wěn)定。為此，通常在儀器內(nèi)同時配有電源穩(wěn)壓器。 氫燈 氘燈 鎢燈 汞燈 hydrogen deuterium tungsten mercury lamp lamp lamp lamp b. 單色器 monochromator 單色器的作用是將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。分為棱鏡和光柵。 棱鏡（prism）：根據(jù)光的折射原理而將復(fù)合光色散為不同波長

12、的單色光，然后再讓所需波長的光通過一個很窄的狹縫（slit）照射到吸收池上。由玻璃或石英制成。玻璃棱鏡用于可見光范圍，石英棱鏡則在紫外和可見光范圍均可使用。 光柵（grating）是根據(jù)光的衍射和干涉原理將復(fù)合光色散為不同波長的單色光，然后再讓所需波長的光通過狹縫照射到吸收池上。它的分辨率比棱鏡大，可用的波長范圍也較寬。 濾光片（filter） c. 比色皿(coloritrough) 也稱吸收池。用于盛放試液的容器。 它是由無色透明、耐腐蝕、化學(xué)性質(zhì)相同、厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分為0.5 cm，l cm，2 cm，3 cm和5 cm。 在可見光區(qū)測量吸光度時使用玻璃吸收池， 紫外區(qū)則

13、使用石英吸收池。使用比色皿時應(yīng)注意保持清潔、透明，避免磨損透光面。 d.檢測器 detector 接受從比色皿發(fā)出的透射光并轉(zhuǎn)換成電信號進(jìn)行測量。分為光電管和光電倍增管。 光電管 （phototube）：一個真空或充有少量惰性氣體的二極管。陰極是金屬做成的半圓筒，內(nèi)側(cè)涂有光敏物質(zhì)，陽極為一金屬絲。光電管依其對光敏感的波長范圍不同分為紅敏和紫敏兩種。紅敏光電管是在陰極表面涂銀和氧化銫，適用波長范圍為6251000 nm;紫敏光電管是陰極表面涂銻和銫，適用波長范圍為200625 nm。 光電倍增管（photomultiplier） 由光電管改進(jìn)而成的，管中有若千個稱為倍增極的附加電極?？墒构饧ぐl(fā)的

14、電流得以放大，一個光子約產(chǎn)生106107 個電子。它的靈敏度比光電管高200多倍。適用波長范圍為160700 nm。光電倍增管在現(xiàn)代的分光光度計中被廣泛采用。 光電池 photocell e.顯示裝置 作用是把放大的信號以吸光度A或透射比T的光度分析法的設(shè)計方式顯示或記錄下來。分光光度計常用的顯示裝置是檢流計、微安表、數(shù)字顯示記錄儀。 6.2 光度分析法的設(shè)計 1 顯色反應(yīng)2 顯色條件的選擇3 測量波長和吸光度范圍的選擇4 參比溶液的選擇5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 顯色反應(yīng)（color reaction） 待測物質(zhì)本身有較深的顏色，直接測定；待測物質(zhì)是無色或很淺的顏色，需要選適當(dāng)?shù)脑噭┡c被測離子反應(yīng)生

15、成有色化合物再進(jìn)行測定，此反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)，所用的試劑稱為顯色劑 （color reagent）。 按顯色反應(yīng)的類型來分，主要有氧化還原反應(yīng)和絡(luò)合反應(yīng)兩大類，而絡(luò)合反應(yīng)是最主要的。（1） 顯色反應(yīng)的選擇A 選擇性好，干擾少，或干擾容易消除;靈敏度高，有色物質(zhì)的應(yīng)大于104。B 有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式。C 有色化合物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，至少保證在測量過程中溶液的吸光度基本恒定。這就要求有色化合物不容易受外界環(huán)境條件的影響。D 有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大，即顯色劑對光的吸收與絡(luò)合物的吸收有明顯區(qū)別，要求兩者的吸收峰波長之差(稱為對比度)大于60 nm。（2）顯色劑 無機顯色劑

16、不多，因為生成的絡(luò)合物不穩(wěn)定，靈敏度和選擇性也不高。如用KSCN顯色測鐵、鉬、鎢和鈮；用鉬酸銨顯色測硅、磷和釩;用H2O2顯色測鈦等。 有機顯色劑分子中含有生色團（chromophoric group）和助色團（auxochrome group）。生色團是某些含不飽和鍵的基團，如偶氮基、對醌基和羰基等。這些基團中的電子被激發(fā)時需能量較小，可吸收波長200 nm以上的可見光而顯色。助色團是含孤對電子的基團，如氨基、羥基和鹵代基等。這些基團與生色團上的不飽和鍵作用，使顏色加深。 有機顯色劑A 磺基水楊酸 OO型螯合劑，可與很多高價金屬離子生成穩(wěn)定的螯合物，主要用于測Fe3+。B 丁二酮肟 NN型螯

17、合顯色劑，用于測定Ni2+。C 1，10-鄰二氮菲 NN型螯合顯色劑，測微量Fe2+。D 二苯硫腙 含S顯色劑，萃取光度測定Cu2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+等。E 偶氮胂(鈾試劑) 偶氮類螯合劑，強酸性溶液中測Th(),Zr()，U()等；在弱酸性溶液中測稀土金屬離子。F 鉻天青S 三苯甲烷類顯色劑，測定Al3+。G 結(jié)晶紫 三苯甲烷類堿性染料，測定Tl3+。 （3）多元絡(luò)合物 多元絡(luò)合物是由三種或三種以上的組分所形成的絡(luò)合物。目前應(yīng)用較多的是由一種金屬離子與兩種配位體所組成的三元絡(luò)合物。三元絡(luò)合物在吸光光度分析中應(yīng)用較普遍。重要的三元絡(luò)合物類型。 * 三元混配絡(luò)合物 金屬離子

18、與一種絡(luò)合劑形成未飽和絡(luò)合物，然后與另一種絡(luò)合劑結(jié)合，形成三元混合配位絡(luò)合物，簡稱三元混配絡(luò)合物。例如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮間苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色絡(luò)合物，可用于釩的測定，其靈敏度高，選擇性好。* 離子締合物 金屬離子先與絡(luò)合劑生成絡(luò)陰離子或絡(luò)陽離子，再與帶反電荷的離子生成離子締合物。主要用于萃取光度法。 如，Ag+與1，10-鄰二氮菲形成陽離子，再與溴鄰苯三酚紅的陰離子形成深藍(lán)色的離子締合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽劑，可測定微量Ag+。 作為離子締合物的陽離子，有堿性染料、1，10-鄰二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、銻)等;作為陰離子，

19、有X-，SCN-，ClO4-，無機雜多酸和某些酸性染料等。 * 金屬離子-絡(luò)合劑-表面活性劑體系 金屬離子與顯色劑反應(yīng)時，加入某些表面活性劑，可以形成膠束化合物，它們的吸收峰向長波方向移動(紅移)，而測定的靈敏度顯著提高。目前，常用于這類反應(yīng)的表面活性劑有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基芐胺、氯化十六烷基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基銨 、溴化羥基十二烷基三甲基銨、OP乳化劑。例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反應(yīng)，生成三元絡(luò)合物，在pH 89時呈藍(lán)紫色，用于痕量稀土元素總量的測定。* 雜多酸 溶液在酸性的條件下，過量的鉬酸鹽與磷酸鹽、硅酸鹽、砷酸鹽等含氧的陰離子作用生成雜多酸，作為

20、吸光光度法測定相應(yīng)的磷、硅、砷等元素的基礎(chǔ)。雜多酸法需要還原反應(yīng)的酸度范圍較窄，必須嚴(yán)格控制反應(yīng)條件。很多還原劑都可應(yīng)用于雜多酸法中。氯化亞錫及某些有機還原劑，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亞硫酸鹽和氫醌常用于磷的測定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷鉬酸鹽和磷鉬酸鹽的還原劑?？箟难嵋彩禽^好的還原劑。 6.2.2 顯色條件的選擇 實驗條件包括:溶液酸度，顯色劑用量，試劑加入順序，顯色時間，顯色溫度，有機絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。 1. 溶液的酸度 M+HR=MR+H+* 影響顯色劑的平衡濃度和顏色* 影響被測金屬離子的存在狀態(tài)* 影響絡(luò)合物的組成 * pH與吸光度關(guān)系曲線確定pH范圍。 2.

21、 顯色劑的用量 M(被測組分)+R(顯色劑) =MR(有色絡(luò)合物) 為使顯色反應(yīng)進(jìn)行完全，需加入過量的顯色劑。但顯色劑不是越多越好。有些顯色反應(yīng)，顯色劑加人太多，反而會引起副反應(yīng)，對測定不利。在實際工作中根據(jù)實驗結(jié)果來確定顯色劑的用量。 3. 顯色反應(yīng)時間:有些顯色反應(yīng)瞬間完成，溶液顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，并在較長時間內(nèi)保持不變;有些顯色反應(yīng)雖能迅速完成，但有色絡(luò)合物的顏色很快開始褪色;有些顯色反應(yīng)進(jìn)行緩慢，溶液顏色需經(jīng)一段時間后才穩(wěn)定。制作吸光度-時間曲線確定適宜時間。 4. 顯色反應(yīng)溫度 ：顯色反應(yīng)大多在室溫下進(jìn)行。但是，有些顯色反應(yīng)必需加熱至一定溫度完成。 5. 溶劑：有機溶劑降低有色化合

22、物的解離度，提高顯色反應(yīng)的靈敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮顏色加深。還可能提高顯色反應(yīng)的速率，影響有色絡(luò)合物的溶解度和組成等。 6. 干擾及其消除方法:試樣中存在干擾物質(zhì)會影響被測組分的測定。例如干擾物質(zhì)本身有顏色或與顯色劑反應(yīng)，在測量條件下也有吸收，造成正干擾。干擾物質(zhì)與被測組分反應(yīng)或與顯色劑反應(yīng)，便顯色反應(yīng)不完全，也會造成干擾。干擾物質(zhì)在測量條件下從溶液中析出，便溶液變混濁，無法準(zhǔn)確測定溶液的吸光度。 為消除以上原因引起的干擾，可采取以下幾種方法。a. 控制溶液酸度b.加入掩蔽劑 選取的條件是掩蔽劑不與待測離子作用，掩蔽劑以及它與干擾物質(zhì)形成的絡(luò)合物的顏色應(yīng)不干擾待測離子的測定

23、。c.利用氧化還原反應(yīng)，改變干擾離子的價態(tài) d.利用校正系數(shù)e.用參比溶液消除顯色劑和某些共存有色離子的干擾。f.選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩLg.當(dāng)溶液中存在有消耗顯色劑的干擾離子時，可通過增加顯色劑的用量來消除干擾。h.分離 以上方法均不奏效時，采用預(yù)先分離的方法。 6.2.3 測量波長和吸光度范圍的選擇 1.測量波長的選擇 為了使測定結(jié)果有較高的靈敏度，應(yīng)選擇被測物質(zhì)的最大吸收波長的光作為入射光，這稱為“最大吸收原則”（maximum absorption）。選用這種波長的光進(jìn)行分析，不僅靈敏度高，且能減少或消除由非單色光引起的對朗伯-比爾定律的偏離。 但是，在最大吸收波長處有其他吸光物質(zhì)干擾測定時，則

24、應(yīng)根據(jù)入射光波長。例 丁二酮肟光度法測鋼中鎳，絡(luò)合物丁二酮肟鎳的最大吸收波長為470 nm，但試樣中的鐵用酒石酸鈉掩蔽后，在470 nm處也有一定吸收，干擾鎳的測定。為避免鐵的干擾，可以選擇波長 520 nm進(jìn)行測定，雖然測鎳的靈敏度有所降低，但酒石酸鐵不干擾鎳的測定。 2. 吸光度范圍的選擇 從儀器測量誤差的角度來看，為使測量結(jié)果得到較高的準(zhǔn)確度，一般應(yīng)控制標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測試液的吸光度在范圍內(nèi)。可通過控制溶液的濃度或選擇不同厚度的吸收池來達(dá)到目的。 6.2.4 參比溶液的選擇 利用參比溶液來調(diào)節(jié)儀器的零點，可消除由吸收池壁及溶劑對入射光的反射和吸收帶來的誤差，扣除干擾的影響。參比溶液選擇：a

25、試液及顯色劑均無色，蒸餾水作參比溶液。b 顯色劑為無色，被測試液中存在其他有色離子，用不加顯色劑的被測試液作參比溶液。c 顯色劑有顏色，可選擇不加試樣溶液的試劑空白作參比溶液。d 顯色劑和試液均有顏色，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑及其他試劑均按試液測定方法加入，以此作為參比溶液，這樣就可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。e 改變加入試劑的順序，使被測組分不發(fā)生顯色反應(yīng)，可以此溶液作為參比溶液消除干擾。 6.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)光的吸收定律:吸光度與吸光物質(zhì)的含量成正比，這是光度法進(jìn)行定量的基礎(chǔ)，標(biāo)準(zhǔn)曲線就是根據(jù)這一原理制作的。具體方法為

26、:在選擇的實驗條件下分別測量一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測組分的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到一條通過原點的直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線，此時測量待測溶液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以查到與之相對應(yīng)的被測物質(zhì)的含量。* 有時標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點?？赡苁怯捎趨⒈热芤哼x擇不當(dāng)，吸收池厚度不等，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清潔等原因所引起的。若有色絡(luò)合物的解離度較大，特別是當(dāng)溶液中還有其他絡(luò)合劑時，常便被測物質(zhì)在低濃度時顯色不完全。找出原因，加以避免。6.3 光度分析法的誤差1 對朗伯-比爾定律的偏離2 吸光度測量的誤差 對朗伯-比爾定律的偏離 在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈

27、直線的情況，特別是當(dāng)吸光物質(zhì)濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃度軸彎曲的現(xiàn)象(吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進(jìn)行定量，將會引起較大的誤差。 偏離朗伯比爾定律的原因主要是儀器或溶液的實際條件與朗伯-比爾定律所要求的理想條件不一致。 1. 非單色光引起的偏離 * 朗伯-比爾定律只適用于單色光，但由于單色器色散能力的限制和出口狹縫需要保持一定的寬度，所以目前各種分光光度計得到的入射光實際上都是具有某一波段的復(fù)合光。由于物質(zhì)對不同波長光的吸收程度的不同，因而導(dǎo)致對朗伯比爾定律的偏離。 * 克服非單色光引起的偏離的措施 使用比較好的單色器，從而獲得純度較高的 “單色光”

28、，使標(biāo)準(zhǔn)曲線有較寬的線性范圍。 人射光波長選擇在被測物質(zhì)的最大吸收處，保證測定有較高的靈敏度，此處的吸收曲線較為平坦，在此最大吸收波長附近各波長的光的值大體相等，由于非單色光引起的偏離要比在其他波長處小得多。 測定時應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臐舛确秶?，使吸光度讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。 2.介質(zhì)不均勻引起的偏離 朗伯比爾定律要求吸光物質(zhì)的溶液是均勻的。如果被測溶液不均勻，是膠體溶液、乳濁液或懸浮液時，入射光通過溶液后，除一部分被試液吸收外，還有一部分因散射現(xiàn)象而損失，使透射比減少，因而實測吸光度增加，便標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離直線向吸光度軸彎曲。故在光度法中應(yīng)避免溶液產(chǎn)生膠體或混濁。3.由于溶液本身的化學(xué)反應(yīng)引起的偏

29、離 溶液中的吸光物質(zhì)常因解離、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等化學(xué)變化而改變其濃度，因而導(dǎo)致偏離朗伯比爾定律。A 解離 大部分有機酸堿的酸式、堿式對光有不同的吸收性質(zhì)，溶液的酸度不同，酸(堿)解離程度不同，導(dǎo)致酸式與堿式的比例改變，使溶液的吸光度發(fā)生改變。B 絡(luò)合 顯色劑與金屬離子生成的是多級絡(luò)合物，且各級絡(luò)合物對光的吸收性質(zhì)不同，例如在Fe()與SCN-的絡(luò)合物中，F(xiàn)e(SCN)3顏色最深，F(xiàn)e(SCN)2+顏色最淺，故SCN-濃度越大，溶液顏色越深，即吸光度越大。 c 締合 例如在酸性條件下，CrO42-會締合生成Cr2O72-，而它們對光的吸收有很大的不同。 在分析測定中，要控制溶液的條件

30、，使被測組分以一種形式存在，以克服化學(xué)因素所引起的對朗伯比爾定律的偏離。6.3.2 吸光度測量的誤差 在吸光光度分析中，儀器測量不準(zhǔn)確也是誤差的主要來源。任何光度計都有一定的測量誤差。這些誤差可能來源于光源不穩(wěn)定，實驗條件偶然變動，讀數(shù)不準(zhǔn)確等。 在光度計中，透射比的標(biāo)尺刻度均勻。吸光度標(biāo)尺刻度不均勻。對于同一儀器，讀數(shù)的波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數(shù)波動則不再為定值。吸光度越大，讀數(shù)波動所引起的吸光度誤差也越大 透射比很小或很大時，濃度測量誤差都較大，即光度測量最好選吸光度讀數(shù)在刻度尺的中間而不落兩端。待測溶液的透射比T在15%65%之間，或使吸光度A在之間，才能保證測量的相對誤差較小

31、。 當(dāng)A=0.434(或透射比T=36.8%)時，測量的相對誤差最小。 6.4 其他吸光光度法及吸光光度法應(yīng)用1 示差吸光光度法2 雙波長吸光光度法3 弱酸和弱堿解離常數(shù)的測定4 絡(luò)合物組成的測定 6.4.1 示差吸光光度法（differential） 1.示差吸光光度法的原理 吸光光度法一般僅適用于微量組分的測定，當(dāng)待測定組分濃度過高或過低，會引起很大的測量誤差，導(dǎo)致準(zhǔn)確度降低。示差吸光光度法可克服這一缺點。目前，主要有高濃度示差吸光光度法、低濃度示差吸光光度法和使用兩個參比溶液的精密示差吸光光度法。它們的基本原理相同，且以高濃度示差吸光光度法應(yīng)用最多，僅介紹高濃度示差吸光光度法。 吸光度差與這兩種溶液的濃度差成正比。以把空白溶液作為參比的稀溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為A和c的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測得的A求出相應(yīng)的c值，從cx=co+c可求出待測試液的濃度，這就是示差吸光光度法定量的基本原理。 2.示差吸光光度法的誤差 c(即cxco)，測量誤差為x%， 結(jié)果為cx(cx-co)x%； 普通光度法的結(jié)果為cxcxx%。因cx只是稍大于co，故cx總是遠(yuǎn)大于c，故示差吸光光度法的準(zhǔn)確度