重組DNA技術1概述ppt課件

1、 DNA重組技術概述天津科技大學：羅學剛 第一節(jié) DNA的重組 DNA Recombination基因表達的分子生物學根底一個典型的原核細胞基因構造表示圖原核細胞的基因是由成百上千個核苷酸對組成的。組成基因的核苷酸序列可以分為不同區(qū)段。在基因表達的過程中，不同區(qū)段所起的作用并不一樣。有的區(qū)段可以轉錄為相應的信使RNA，進而指點蛋白質的合成，也就是說可以編碼蛋白質的區(qū)段叫做編碼區(qū)。有的區(qū)段不能轉錄為信使RNA，也就是說不能編碼蛋白質的區(qū)段叫做非編碼區(qū)。一個典型的真核細胞基因構造表示圖真核細胞的基因是由編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分組成的。在非編碼區(qū)上，同樣有調控作用的核苷酸序列，但是真核細胞的基因構造要

2、比原核細胞的基因構造復雜。與原核細胞比較，真核細胞基因構造的主要特點是：編碼區(qū)是間隔的、不延續(xù)的。也就是說，可以編碼蛋白質的序列被不可以編碼蛋白質的序列分隔開來，成為一種斷裂的方式。其中，可以編碼蛋白質的序列叫做外顯子，普通不可以編碼蛋白質的序列叫做內含子。53加強子CAAT框TATA框轉錄起始點外顯子1外顯子2外顯子3內含子1內含子2AATAAA轉錄終止點真核細胞基因構造表示圖啟動子：主要包括兩個序列1在5端轉錄起始點上游約2030個核苷酸處有TATA框，它是一個短的核苷酸序列，是啟動子中的一個順序，它是RNA聚合酶的重要接觸點，能使酶準確識別轉錄的起始點并開場轉錄。當TATA框中的堿基順序

3、有所改動時，mRNA的轉錄就會從不正常的位置開場。53加強子CAAT框TATA框轉錄起始點外顯子1外顯子2外顯子3內含子1內含子2AATAAA轉錄終止點真核細胞基因構造表示圖啟動子：主要包括兩個序列2在5端轉錄起始點上游約7080個核苷酸的地方，有CAAT框，是啟動子中另一個短的核苷酸序列，是RNA聚合酶的另一個結合點，它的作用還不一定，普通以為它控制著轉錄的起始頻率，而不影響轉錄的起始點。當框中的堿基順序改動后，mRNA的構成量會明顯減少。53加強子CAAT框TATA框轉錄起始點外顯子1外顯子2外顯子3內含子1內含子2AATAAA轉錄終止點真核細胞基因構造表示圖加強子：在5端轉錄起始點上游約

4、100個核苷酸以遠處的位置，能使轉錄活性加強上百倍。終止子：在3端終止密碼的下游有一個核苷酸順序為AATAAA，AATAAA順序和下游的反向反復順序合稱為終止子，是轉錄終止的信號。終止子的特殊堿基陳列順序可以妨礙RNA聚合酶的挪動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來。反向反復順序AUUU5533ATT AAAGGCTCC TTTT GGAGCCTTT TTTTTTAA TTTCCGAGG AAAA CCTCGGAAA AAAAA模板鏈轉錄UUUUCCCCCGGGGG35UUUUUAAAUUAU某基因終止子的反向反復順序與發(fā)卡構造的構成圖解DNA重組包括：同源重組細菌的基因轉移與重組位點特異重組轉座

5、重組接協(xié)作用轉化作用轉導作用發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱根本重組。是最根本的DNA重組方式，經(jīng)過鏈的斷裂和再銜接，在兩個DNA分子同源序列間進展單鏈或雙鏈片段的交換。 以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組受體四、轉座重組 由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座transposition。 第二節(jié) 重組DNA技術 DNA Recombination Technique基因工程誕生的歷史背景： 1973年是基因工程誕生的元年。1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌

6、轉化證明了DNA是遺傳信息攜帶者。2. 1953年James Watson和Francis Crick 兩人提出了DNA構造的雙螺旋模型，提示了遺傳物質自我復制的機制。3. 1961-1965年,科學家破譯了生物界全部64個遺傳密碼,發(fā)表了劃時代的遺傳密碼字典，提出了遺傳信息由DNARNA蛋白質傳送的中心法那么。4. 1970年發(fā)現(xiàn)了反轉錄酶，豐富了中心法那么，為cDNA的制備奠定了根底。5. 染色體外DNA質粒的深化研討，為第一批重組DNA載體提供了資料。6. 1968-1970年，限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)和純化，為DNA的體外重組提供了有力的工具。7. 1972年，Berg.D等人初次用限制性內

7、切酶EcoRI切割噬菌體和SV40病毒DNA分子，將這兩種不同來源的DNA片段勝利地在體外銜接成雜合DNA分子。 至此，用重組DNA技術改動生物學性狀的嘗試在1973年由Cohen等人完成。從此，這項技術為生物學帶來了一場深化的革命，這類技術本身也迅速地開展起來，并廣泛地浸透到各個學科的研討領域。 一、重組DNA技術相關概念 一DNA克隆 克隆clone 來自同一始祖的一樣副本或拷貝的集合。 獲取同一拷貝的過程稱為克隆化cloning,即無性繁衍。技術程度： 分子克隆molecular clone 即DNA克隆 細胞克隆 個體克隆動物或植物內切核酸酶內切核酸酶，維持細菌遺傳性狀的穩(wěn)定。限制性內

8、切核酸酶或DNA結合蛋白所特異識別、結合的DNA位點的核苷酸序列，呈二元旋轉對稱，通常將這種特殊的構造順序稱為回文構造palindrome。 識別序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；產(chǎn)生的切口可以是粘性末端、平頭或鈍性末端、配伍末端。 。 (三)目的基因 目的基因：用來擴增作研討或消費某一種蛋白質的基因。就是在重組DNA時，人們感興趣的基因或DNA序列，又稱目的DNA(target DNA)。 類型： cDNA(complementary DNA)：指經(jīng)反轉錄合成的、與RNA互補的單鏈DNA，經(jīng)聚合可合成雙鏈cDNA。 基因組DNA(genetic DNA)：指代表一個細胞或生物體整套遺傳

9、信息(染色體及線粒體)的一切DNA序列。大容量載體 柯斯質粒載體 酵母人工染色體載體質粒DNA的提取及鑒定 1收獲細菌2堿裂解法小量抽提質粒1將細菌沉淀上述步驟3所得重懸于100l預冷的溶液50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA中，猛烈振蕩。2加200l新配制的溶液0.2mol/l NaOH, 1%SDS，緩和振蕩，水浴5min。3加150l預冷溶液50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml，緩和振蕩，冰浴5min。44以12000g離心5min，將上清轉移到另一離心管中。5可作不可作：加等量飽和酚，氯仿

10、，振蕩混勻6用2倍體積無水乙醇室溫沉淀DNA，室溫放置2min。74以12000g離心5min。8小心吸盡上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，再將附于管壁的液滴除盡。9用75%乙醇于4洗滌DNA，同上離心去上清真空抽干。10加50l的1TE含20g/ml無DNA酶的胰RNA酶，振蕩，儲存于-20。聚合酶鏈反響PCRPolymerase Chain Reaction根本原理： 變性、 退火、 延伸感受態(tài)細胞：指具備接受外源DNA才干的宿主細胞導入大腸桿菌1. 氯化鈣轉化法2. 電擊法3. 體外包裝感染法導入哺乳動物細胞1. 顯微注射法2. 電穿孔法3. DNA-磷酸鈣共沉淀4. DEAE-葡聚糖轉

11、染法5. 病毒感染法6. 脂質體介導法7. 細胞交融法8. 原生質體交融法9. 微細胞介導法大腸桿菌感受態(tài)的制備 1接種單菌落于2ml LB培育液中， 37過夜。2取0.25ml過夜菌入25ml LB培育液中，37振搖46h至A590=0.40.6。3倒入50ml管內，水浴10min，以25003000rpm離心5min，棄上清。4緩慢參與75mmol/L預冷CaCl2 5ml懸浮菌體，冰浴20min，同上離心棄上清。5緩慢參與75mmol/L預冷CaCl2 1.0ml悄然混勻后分裝在1.5ml Eppendorf管中，每管200l，冰浴12h。重組DNA的轉化 1將3只Eppendorf管按以下組作好標志，然后按下述進展：轉化組：受體菌重組DNA陰性對照組：受體菌陽性對照組：受體菌陽性DNA 2冰浴30min至1h。中間搖動3次，以防受體菌沉底。34290s。437水浴5min。5參與無相應抗生素的Lb 200l，混勻后，37水浴3060min。6分別取3組反響物各50l在含相應抗生素的固體LB培育基平皿上涂布，室溫下枯燥，然后倒置于37溫箱中培育過夜。(五)重組體的挑選 直接選擇法1. 抗藥性選擇2. 標志補救3. 分子雜交法間接挑選法 核酸程度*1. 酶切圖譜