微生物藥物產(chǎn)生菌

1、微生物制藥吳劍波 主編(zhbin)共六十六頁分離(fnl)微生物篩選(shixun)方法的建立微生物分類學(xué)抗生素發(fā)酵（選用不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件）篩選（采用微生物學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)或化學(xué)方法等進(jìn)行測定）早期鑒別化合物的分離與純化理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)的測定采集樣品新物質(zhì)臨床前藥理臨床試驗(yàn)開發(fā)研究生物合成作用機(jī)制耐藥機(jī)制全合成結(jié)構(gòu)改造結(jié)構(gòu)測定可能為新物質(zhì)毒性低，療效好陽性樣品全發(fā)酵液、上清液或菌絲體浸泡液（或粗提品等）新微生物藥物的篩選流程共六十六頁第1章 微生物藥物(yow)的產(chǎn)生菌藥物的產(chǎn)生菌；新藥產(chǎn)生菌的分離(fnl)；新微生物藥物的篩選。共六十六頁1.1微生物藥物(yow)的產(chǎn)生菌主要包

2、括放線菌、真細(xì)菌和絲狀真菌等。1、放線菌應(yīng)用于臨床的微生物藥物大部分來源于放線菌的次級代謝產(chǎn)物。放線菌產(chǎn)生的抗菌藥物中化學(xué)(huxu)類別較多。共六十六頁（1）放線菌產(chǎn)生(chnshng)的抗菌藥物-內(nèi)酰胺類氨基糖苷類大環(huán)內(nèi)酯類四環(huán)素類紫霉素類糖肽類多烯類其他(qt)抗細(xì)菌抗生素共六十六頁產(chǎn)生(chnshng)-內(nèi)酰胺類抗生素的放線菌抗菌藥物產(chǎn)生菌備注頭霉素C耐內(nèi)酰胺鏈霉菌（Streptomyces lactamdurans）帶小棒鏈霉菌（Str.clavuligerus）諾卡菌素A均勻諾卡菌（Nocardia uniformis）硫霉素卡特利鏈霉菌（Str.cattleya）由硫霉素半合成的

3、亞胺硫霉素亞胺培南（imipenem）在臨床治療耐藥菌感染中有較好療效棒酸帶小棒鏈霉菌（ Str.clavuligerus）抑制青霉素酶橄欖酸橄欖鏈霉菌（Str.olivaceus）抑制內(nèi)酰胺酶共六十六頁抗菌藥物產(chǎn)生菌鏈霉素streptomycin灰色鏈霉菌（Str.griseus）枝鏈霉菌（Str.rameus）鮮黃鏈霉菌（Str.galbus）比基尼鏈霉菌（Str.bikiniensis）新霉素neomycin弗氏鏈霉菌（Str.fradiae）巴龍霉素Paromomycin小串鏈霉菌NRRL 2455（Str.catenulae）卡那霉素kanamycin卡那霉素鏈霉菌（Str.kana

4、myceticus）慶大霉素gentamicin絳紅色小單孢菌NRRL 2953（Micromonospora purpurea）棘孢小單孢菌NRRL 2985(M. Echinospora)大觀霉素spectinomycin壯觀鏈霉菌（Str.spectabilis）產(chǎn)生氨基(nj)糖苷類抗生素的放線菌共六十六頁產(chǎn)生四環(huán)素類抗生素的放線菌抗菌藥物產(chǎn)生菌四環(huán)素tetracycline生綠鏈霉菌（Str. viridifaciens）吸水鏈霉菌（Str. hygroscopicus）氧四環(huán)素/土霉素terramycin龜裂鏈霉菌（Str. rimosus）褐黃鏈霉菌（Str. gilvus）氯四

5、環(huán)素/金霉素aureomycin金霉素鏈霉菌LSB2201 （Str. aurofaciens）佐山鏈霉菌（Str. sayamaensis）具有(jyu)廣譜的抗細(xì)菌活性。作用于細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成。產(chǎn)生菌均為鏈霉菌。共六十六頁產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的放線菌抗菌藥物產(chǎn)生菌紅霉素erythromycin紅霉素鏈霉菌ER-598, 2135（Str. erythreus）灰平鏈霉菌（Str. griseoplanus）竹桃霉素oleandomycin抗生鏈霉菌ATCC11891 （Str. antibioticus）麥迪加霉素midecamycin生米卡鏈霉菌（Str. mycarofaciens）螺

6、旋霉素產(chǎn)二素鏈霉菌（Str. ambofacoensis）大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的產(chǎn)生菌均為鏈霉菌。主要抗G+細(xì)菌，對軍團(tuán)菌、支原體、衣原體有抗菌作用(zuyng)。阻斷蛋白質(zhì)的合成。共六十六頁抗菌藥物產(chǎn)生菌備注兩性霉素amphotericin節(jié)狀鏈霉菌M-4575（Str. nodosus）七烯大環(huán)內(nèi)酯類，抗真菌抗生素制霉菌素nystatin諾爾斯鏈霉菌ATCC 11455（Str. noursei）四烯大環(huán)內(nèi)酯類，抗絲狀真菌和酵母樣真菌多烯類抗生素產(chǎn)生菌主要是鏈霉菌，作用于真菌，能與真菌細(xì)胞膜中的固醇結(jié)合，使膜受損，影響細(xì)胞正常代謝，導(dǎo)致(dozh)細(xì)胞死亡。產(chǎn)生(chnshng)多烯類抗生素的

7、放線菌共六十六頁抗菌藥物產(chǎn)生菌備注利福霉素rifamycin地中海擬無枝酸菌ME/83（Amycolatopsis maditerranei）利福霉素及其衍生物有廣譜的抗菌活性，可用于抗結(jié)核桿菌，作用于細(xì)菌RNA多聚酶氯霉素chloramphenicol委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Str. venezuelae）氯霉素是廣譜抗細(xì)菌抗生素，抑制蛋白質(zhì)合成磷霉素forfomycin弗氏鏈霉菌NRRL-3417（Str. fradiae）磷霉素抑制細(xì)胞壁合成，對G+和G-細(xì)菌均有抗菌活性環(huán)絲氨酸cycloserine蘭花鏈霉菌（Str. orchidaceus）環(huán)絲氨酸抑制細(xì)胞壁合成，對G+、G-細(xì)菌和結(jié)核分枝

8、桿菌均有抗菌作用長崎鏈霉菌（Str. nagasakiensis）產(chǎn)生其他(qt)抗細(xì)菌抗生素的放線菌共六十六頁蒽環(huán)類糖肽類色霉素類烯二炔類絲裂烷類其他(qt)抗腫瘤抗生素（2）放線菌產(chǎn)生(chnshng)的抗腫瘤藥物共六十六頁蒽環(huán)類抗生素產(chǎn)生(chnshng)菌道諾霉素daunomycin波塞鏈霉菌FI-1762（ Str. peuceticus）天藍(lán)微紅鏈霉菌NRRL3046 （ Str. coeruleorubidus）阿霉素adriamycin波塞鏈霉菌青灰變種IMRU3920（ Str. Peuceticus var. caesius）洋紅霉素carminomycin洋紅馬杜拉放線菌

9、（ Actinomadura carminata） 以發(fā)色團(tuán)插入DNA雙螺旋中而與DNA結(jié)合，抑制(yzh)依賴于DNA的RNA多聚酶，抑制(yzh)RNA合成和DNA復(fù)制共六十六頁糖肽類抗生素產(chǎn)生(chnshng)菌博來霉素bleomycin輪枝鏈霉菌（輪枝鏈輪絲菌） （ Streptoverticillum verticillus）平陽霉素pingyangmycin輪枝鏈輪絲菌平陽變種（ Streptoverticillum verticillus var. pingyangense）博安霉素boanmycin輪枝鏈輪絲菌平陽變種（ Streptoverticillum verticill

10、us var. pingyangense）與DNA結(jié)合，使DNA單鏈斷裂，抑制胸腺嘧啶進(jìn)入DNA中，終止(zhngzh)癌細(xì)胞的分裂共六十六頁色霉素類抗生素與DNA結(jié)合，抑制依賴于DNA的RNA多聚酶色霉素橄欖產(chǎn)色鏈霉菌69895 （ Str. olivochromogenes）光神霉素白泥鏈霉菌ATCC12957 （ Str. argillaceus）烯二炔類抗生素活化后形成芳香環(huán)二自由基，切斷DNA鏈，抑制了DNA的合成新制癌霉素neocarzinostatin抑癌鏈霉菌新抑癌亞種（ Str. Carzinostaticus subsp. neocarzinostaticus）絲裂烷類抗生

11、素能使互補(bǔ)的DNA雙鏈之間形成交聯(lián)，從而抑制DNA的合成絲裂霉素頭狀鏈霉菌NRRL2564 （ Str. caespitoseus）共六十六頁抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌放線菌素Dactinomycin抗生素鏈霉菌（Str. antibiotics）小小鏈霉菌（Str. parvullus）鏈黑菌素streptonigrin團(tuán)片鏈霉菌ATCC13257 （Str. flocculus）殺霉鏈霉菌ATCC13853 （Str. fungicidicus）鏈脲菌素streptozotocin不產(chǎn)色鏈霉菌NRRL2697 （Str. achromogenes）吡唑呋喃菌素pyrazofurin純白鏈霉菌（Str

12、. candidus）其他(qt)抗腫瘤抗生素共六十六頁藥物產(chǎn)生菌備注烏苯美司（bestatin）橄欖網(wǎng)狀鏈霉菌（Streptomyces olivoreticuli）免疫抑制劑，并對多種腫瘤有免疫治療作用藤霉素（fujimycin, ）鏈霉菌（S. tsukubaenis）有抗真菌活性，大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑雷帕霉素（rapamycin）吸水鏈霉菌（S. hygroscopicus）三烯大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，有抗真菌活性康樂霉素C（kanglemycin C）地中海諾卡菌康樂變種（Nocardia mediterranei var. kanglensis）免疫抑制劑（3）其他(qt)藥物產(chǎn)生菌

13、共六十六頁抗菌藥物產(chǎn)生菌備注桿菌肽bacitracin枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）地衣形芽孢桿菌（B. licheniformis）黏菌素colistin多粘芽孢桿菌黏菌素變種（B. polymyxa var. colistinus）多粘菌素polymycin多粘芽孢桿菌（ B. polymyxa ）丁酰苷菌素butirosin環(huán)狀芽孢桿菌NRRL B-3313（B. circulans）氨基糖苷類抗生素磺酰胺菌素sulfazecin嗜酸假單胞菌（Pseudomonas acidophila）單環(huán)-內(nèi)酰胺類抗生素單菌胺素monobactams紫色色桿菌（Chromobac

14、terium violaceum）單環(huán)-內(nèi)酰胺類抗生素硝吡咯菌素pyrrolnitrin吡咯假單胞菌2327 （P. pyrrocinia）堆囊菌素sorangicin纖維素堆囊菌(Sorangium cellulosum)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素琥蒼菌素ambruticin纖維素堆囊菌（S. cellulosum）抗真菌作用2、細(xì)菌(xjn)共六十六頁真菌是第一個應(yīng)用于臨床的抗生素青霉素的產(chǎn)生菌，并從此進(jìn)入(jnr)了抗菌治療中的抗生素時代。抗菌藥物產(chǎn)生菌備注青霉素penicillin點(diǎn)青霉（Penicillum notatum）產(chǎn)生菌很多，多數(shù)菌種屬于青霉屬。對細(xì)菌有抗菌作用，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。

15、產(chǎn)黃青霉（Pen. chrysogenum）巴恩青霉（Pen. baarnense）矮小青霉（Pen. humuli）黃曲霉（Aspergillus flavus）構(gòu)巢曲霉（Asp. nidulans）頭孢菌素C cephalosporin C頂頭孢霉（Cephalosporium acremonium）對細(xì)菌有抗菌作用，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。灰黃霉素griseofulvin灰黃青霉（Pen. griseofulvum）產(chǎn)生菌較多，均為青霉屬;作用于微孔蛋白，抑制真菌生長詹氏青霉250（Pen. janczewskii）3、真菌(zhnjn)共六十六頁藥物產(chǎn)生菌其他環(huán)孢菌素A cyclospor

16、inA光澤柱孢菌（Cylindrocarpon lucidum）有抗真菌活性，其結(jié)構(gòu)為11個氨基酸的環(huán)肽雪白白疆菌（Beauveria bassiana）腐皮鐮刀菌4-11（Fusarium solani）洛伐他汀lovastatin土曲霉（Aspergillus）抑制膽固醇生物合成4、其他(qt)藥物產(chǎn)生菌共六十六頁天然青霉素共六十六頁 二 新藥產(chǎn)生(chnshng)菌的分離（一）土壤(trng)微生物的分離土壤是微生物的重要棲息地。1.采集樣品2.分離微生物3.選留菌種及保存分離放線菌的樣品除土壤以外，還有河（湖、海）泥和水、枯樹葉、堆肥、動物糞便等。土壤樣品通常采表層土（5cm以下），樣

17、品以未開墾過的土壤為佳，要盡可能選擇不同地理和生態(tài)環(huán)境的土壤。共六十六頁2.分離(fnl)微生物樣品的處理分離培養(yǎng)基抑制劑的使用分離方法培養(yǎng)條件(tiojin)稀有放線菌的選擇性分離其他微生物的分離共六十六頁（1）樣品(yngpn)的處理利用放線菌孢子和細(xì)菌營養(yǎng)細(xì)胞及不同屬間放線菌孢子間的耐性(nixng)差異，用物理或化學(xué)的方法除去細(xì)菌及目的外放線菌，或者用花粉作為誘餌，增加某些特定放線菌的分出率。共六十六頁處理?xiàng)l件樣品分離的放線菌40，216 h土壤、植物根鏈霉菌55，6 min水、土壤、糞便小單孢菌、鏈霉菌、紅球菌、嗜酸放線菌和嗜堿放線菌等55干熱，10 d土壤高溫放線菌100干熱，15

18、 min土壤馬杜拉放線菌100120干熱，1 h土壤馬杜拉放線菌、小雙孢菌，小四孢菌，孢囊鏈霉菌溫度-分離前樣品(yngpn)加熱處理共六十六頁化學(xué)試劑的處理(chl)SDS-酵母膏處理法，SDS對放線菌孢子基本無害，酵母浸膏以及溫和的熱休克可以促進(jìn)放線菌孢子的出芽，使細(xì)菌數(shù)明顯減少。風(fēng)干的土壤與CaCO3混合后在26培養(yǎng)79 d，然后分離放線菌。風(fēng)干的土壤減少了細(xì)菌的數(shù)量，CaCO3有利于放線菌生長而不利于絕大多數(shù)真菌的生長。用0.01 mol/L NaOH處理土壤510 min（15）可減少細(xì)菌的數(shù)量，有利于分離小單孢菌。用1.4%酚處理土樣10 min或用1.4%酚130處理30 min

19、，分別(fnbi)有利于獲得鏈霉菌或小單孢菌。用乙酸乙酯或氯仿和苯處理樣品，過濾風(fēng)干后用來分離微生物，可以除去樣品中的真菌。共六十六頁物理(wl)方法的處理離心，1600 g離心20 min，上清液主要有放線菌孢子，沉淀含有細(xì)菌和真菌孢子。超聲波處理，分離小單孢菌和鏈霉菌。特殊器具捕集空氣(kngq)中的游離孢子，分離糖多孢菌。攪動，使干草上孢子脫落，用于從干草中分離高溫放線菌。膜過濾，將水經(jīng)膜（孔徑0.45um濾膜）過濾，濃縮水中微生物，再將膜直接貼在瓊脂平板上培養(yǎng)。誘餌法，在培養(yǎng)基中添加特殊物質(zhì)，如花粉、蛇皮、頭發(fā)等，可分離小瓶菌和發(fā)仙菌。共六十六頁（2）分離(fnl)培養(yǎng)基總的要求：盡量

20、使樣品中的全部放線菌都生長出來，而其他微生物（細(xì)菌和真菌）又盡可能不長。合成(hchng)培養(yǎng)基精氨酸培養(yǎng)基，高氏合成(hchng)一號培養(yǎng)基，天門冬素培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基等有機(jī)培養(yǎng)基Waksman培養(yǎng)基，Bennett培養(yǎng)基幾丁質(zhì)培養(yǎng)基只有放線菌能夠利用幾丁質(zhì)，生長的菌落小，白色，需轉(zhuǎn)接到產(chǎn)可溶性色素的適當(dāng)培養(yǎng)基上加以區(qū)分HV培養(yǎng)基以土壤腐殖質(zhì)為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基共六十六頁選擇性分離(fnl)放線菌所使用的培養(yǎng)基待分離的放線菌所用固體培養(yǎng)基中的主要成分馬杜拉放線菌屬葡萄糖，甘油，L-天冬酰胺，微量鹽，維生素（AV培養(yǎng)基）小雙孢菌屬AV培養(yǎng)基小單孢菌屬微量鹽，丙酸鈉，硫胺素（M3培養(yǎng)基）小四

21、孢菌屬下層：葡萄糖，L-天冬酰胺，微量鹽上層：（水解）酪蛋白氨基酸諾卡菌屬微量鹽，丙酸鈉，硫胺素（M3培養(yǎng)基）嗜高溫放線菌屬半濃度營養(yǎng)瓊脂鏈孢囊菌屬葡萄糖，L-天冬胺酰，微量鹽（NH2），維生素，土壤浸出液各種菌屬膠體幾丁質(zhì)，微量鹽共六十六頁（3）抑制劑的使用(shyng)加入抗真菌試劑（制霉菌素、兩性霉素B、放線菌酮、丙酸鈉以及使真菌形成較小菌落的rose bengal等），抑制真菌生長；加入抗細(xì)菌抗生素（青霉素、鏈霉素）抑制細(xì)菌生長，增加(zngji)放線菌的分出率；加入某些抗生素也可抑制部分放線菌，有利于分離到一定種類的放線菌。如新生霉素有利于分離北里孢菌屬。共六十六頁（4）分離(fnl

22、)方法稀釋法最常用，將土壤樣品用無菌水（或生理鹽水、磷酸緩沖液）制成懸液，倍比稀釋，涂布平板，恒溫培養(yǎng)。干土噴射法用噴土機(jī)或其他方法將風(fēng)干碾細(xì)的土樣直接噴在分離平板上。孢子飛揚(yáng)法將樣品置于特制瓶中，其瓶口剛好能倒置一個分離平板，劇烈振蕩使孢子飛揚(yáng)，撞到分離平板上進(jìn)行(jnxng)分離培養(yǎng)。濾膜法將0.220.45um的濾膜放在分離平板上，接種菌懸液或噴撒干土，適溫培養(yǎng)一段時間，放線菌菌絲可穿過濾膜小孔生長到培養(yǎng)基上，細(xì)菌只能在濾膜表面生長，去掉濾膜，深入培養(yǎng)基的放線菌經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后長出菌落。共六十六頁（5）培養(yǎng)(piyng)條件一般培養(yǎng)溫度為2530，也有3237，培養(yǎng)714 d，生長(shng

23、zhng)慢的放線菌可延長培養(yǎng)1個月；分離高溫放線菌用4550培養(yǎng)12 d；海水放線菌用20培養(yǎng)6周左右。共六十六頁（6）稀有(xyu)放線菌的選擇性分離稀有放線菌的特征：生長(shngzhng)速度比較緩慢；營養(yǎng)需求較為復(fù)雜；比較缺乏孢子分化的能力；不能穩(wěn)定保存。共六十六頁分離幾種稀有(xyu)放線菌的方法稀有放線菌種類形態(tài)特征預(yù)處理方法分離方法分離方法的特征馬杜拉放線菌100加熱15 min，并懸浮于無菌的25（V/V）Ringers溶液中懸浮液涂布于含有100 ug/mL放線菌酮、25 ug/mL利福平的固體培養(yǎng)基上高溫處理土樣與使用含有利福平的固體培養(yǎng)基相結(jié)合的選擇性分離方法共六十六頁

24、稀有放線菌種類形態(tài)特征預(yù)處理方法分離方法分離方法的特征游動放線菌不形成真正的氣生菌絲，并且菌落呈鮮艷的橘黃色。營養(yǎng)菌絲上形成孢子囊。游動孢子由成熟的孢子囊產(chǎn)生。土樣浸泡于飽和的硫酸鎂鹽溶液中，再洗去鎂鹽，干燥土樣。將經(jīng)過干濕處理后的土樣涂布于幾丁質(zhì)瓊脂上，可得到大量的游動放線菌利用了生物趨化方法分離(fnl)幾種稀有放線菌的方法共六十六頁稀有放線菌種類形態(tài)特征預(yù)處理方法分離方法分離方法的特征小單孢菌大多數(shù)種缺乏氣生菌絲，形成橘黃色或橘紅色的菌落孢子；分化的菌落表面變成黑色或暗褐色，有時呈光滑或粘稠。單孢子只在營養(yǎng)菌絲上形成，沒有運(yùn)動性。堿處理有效的降低了革蘭氏陰性細(xì)菌的生長含有衣霉素的固體培養(yǎng)

25、基可選擇性的支持小單孢菌的生長將土樣進(jìn)行堿處理和使用含有衣霉素的固體培養(yǎng)基相結(jié)合的獨(dú)特方法分離幾種稀有(xyu)放線菌的方法共六十六頁稀有放線菌種類形態(tài)特征預(yù)處理方法分離方法分離方法的特征諾卡菌大多數(shù)種形成蠟樣的或有光澤的菌落而不形成氣生菌絲，但也有一些種會產(chǎn)生不成熟的氣生菌絲，營養(yǎng)菌絲可斷裂成球狀或桿狀片斷用石蠟棒在土壤樣品的懸液中富集然后將石蠟從棒上剝離，接種到DST（Oxoid）瓊脂平板上，25 培養(yǎng)3 w分離幾種稀有(xyu)放線菌的方法共六十六頁稀有放線菌種類形態(tài)特征預(yù)處理方法分離方法分離方法的特征鏈孢囊菌營養(yǎng)和氣生菌絲與鏈霉菌菌株一樣發(fā)育良好，包含著不能移動孢子的孢囊位于氣生菌絲的

26、頂端可先將土樣在室溫風(fēng)干，然后在120 加熱1 h將處理后的土樣或用土壤懸液涂布于含有維生素的培養(yǎng)基上分離(fnl)幾種稀有放線菌的方法共六十六頁稀有放線菌種類形態(tài)特征預(yù)處理方法分離方法分離方法的特征北里孢菌屬形態(tài)特征以及菌落特征與鏈霉菌屬非常相似，但它們的細(xì)胞壁中含有LL-DAP、meso-DAP、甘氨酸、半乳糖，與鏈霉菌屬完全不同50 ug/mL新生霉素的培養(yǎng)基利用了北里孢菌屬菌種對新生霉素具有抗性的特征分離幾種(j zhn)稀有放線菌的方法共六十六頁真菌的分離常用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、Martin培養(yǎng)基、察氏蔗糖（葡萄糖）瓊脂培養(yǎng)基，pH偏酸性。為了抑制細(xì)菌的生長一般在分離培養(yǎng)基中加入

27、-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類等抗生素。細(xì)菌的分離常用有機(jī)培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂加氨基酸維生素的培養(yǎng)基等，pH偏堿性。分離時一般加入一定量的抗真菌抗生素如制霉菌素、兩性霉素、放線菌酮等，抑制真菌生長，有利于細(xì)菌分離。加入多粘菌素可大大減少G細(xì)菌生長，使G細(xì)菌得以富集。其他(qt)微生物的分離共六十六頁3.選留(xun li)菌種及保存將菌株的優(yōu)良特性保存下來，保持微生物的活力。低溫保藏(bocng)法傳代培養(yǎng)保藏法液體石蠟保藏法沙土保藏法冷凍干燥保藏法共六十六頁（二）海洋(hiyng)微生物的分離共六十六頁目的從海水和海底沉淀物中分離放線菌分離的樣品用采樣器采集海水和海底沉淀物前處

28、理離心和過濾海水達(dá)到濃縮，沉淀物直接涂平板培養(yǎng)基各種培養(yǎng)基，包括含人造海水的一些培養(yǎng)基（淀粉水解酪蛋白海水）培養(yǎng)20 ，6 w挑選菌落挑出全部放線菌菌落結(jié)果有幾株產(chǎn)生新抗生素的菌種，包括沉淀物中得到的產(chǎn)生aplasmomycin的Str. griseusOkami等從海洋中分離(fnl)放線菌的程序共六十六頁（3）普通分離放線菌培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，再加入(jir)人造海水蛋白胨5 g磷酸鐵0.1 g酵母膏1 g人造海水1000 ml瓊脂1.7%pH7.6分離(fnl)海洋放線菌的培養(yǎng)基（1）SC培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g酪蛋白1 g人造海水500 ml蒸餾水500 ml瓊脂1.7%pH7.4（2）

29、Z培養(yǎng)基：共六十六頁（三）極端(jdun)微生物的分離極端微生物是在特殊環(huán)境（如高溫、低溫、高鹽、高堿、高壓等）中形成的一類特殊的微生物，因而在分離這類微生物時，需考慮它們生長繁殖所需的特殊條件，以設(shè)計(jì)分離與培養(yǎng)條件。分離嗜熱微生物，有些菌株的最適生長溫度(wnd)高達(dá)80，pH在1-6；分離嗜鹽微生物時培養(yǎng)基中的鹽濃度可高達(dá)2.5 mol/L。共六十六頁粘細(xì)菌(xjn)基因(jyn)重組微生物利用基因工程技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)生新的次級代謝產(chǎn)物的基因重組微生物，逐步創(chuàng)立組合生物合成。利用基因重組微生物提高已有抗生素的產(chǎn)量和有效組分的含量。纖維素堆囊菌（Sorangium cellulosum）大環(huán)內(nèi)酯類

30、抗生素堆囊菌素，琥蒼菌素（抗真菌）（四）其他微生物資源共六十六頁組合生物合成將產(chǎn)生不同抗菌藥物(yow)或其他生理活性中間體的基因重組到一種微生物中，使其生物合成途徑重新組合，生產(chǎn)迄今自然界還沒有的新的抗生素或生理活性化合物。共六十六頁（五）難培養(yǎng)(piyng)微生物的分離與培養(yǎng)(piyng)研究VBNC（viable but nonculturable）指那些可培養(yǎng)的不分化的微生物在受到外界壓力刺激后，通過一系列的類似分化的遺傳程序而使自身處于一種能抵抗饑餓和壓力的狀態(tài)(zhungti)；盡管此后不能用常規(guī)的培養(yǎng)方法恢復(fù)其生長繁殖，但實(shí)驗(yàn)證明它們?nèi)员３稚媪εc致病因子和/或基因。共六十六頁三

31、. 新微生物藥物(yow)的篩選（一）初篩發(fā)酵初篩發(fā)酵是能否產(chǎn)生抗生素的關(guān)鍵，需要選擇適合的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件(tiojin)，以利于抗生素的合成。共六十六頁碳源糖類、脂肪、某些有機(jī)酸、醇或碳?xì)浠衔锕┙o微生物生命活動所需要的能量以及構(gòu)成菌體細(xì)胞成分和代謝產(chǎn)物。氮源蛋白胨、黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、肉膏、酒泥硫酸銨、氨水、硝酸鹽等供給微生物生長所需的氮素，構(gòu)成菌體原生質(zhì)無機(jī)鹽、微量元素磷、鎂、鉀、鈉等鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬等可以作為生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物培養(yǎng)基成分(chng fn)培養(yǎng)基主要是供給微生物生長(shngzhng)和合成抗生素的材料共六十六頁初篩方式(fngs

32、h)固體平板發(fā)酵便于大量篩選抗菌物質(zhì)時采用。液體振蕩(zhndng)培養(yǎng)放線菌大都為好氧菌，增加溶解氧有利于放線菌生長和抗生素的合成。共六十六頁（二）篩選(shixun)模型的研究與應(yīng)用10000株新分離(fnl)的放線菌30株（可能是新抗生素）10種新化合物1種有希望的化合物，低毒性，體內(nèi)有效新抗生素/分離的菌株數(shù)：1/1000新抗生素/已知抗生素：1/50有希望的抗生素/分離的菌株數(shù)：1/100002500株對細(xì)菌有抗菌活性500株250株鏈絲菌素類125株鏈霉素類40株四環(huán)素類55株其他已知抗生素交叉耐藥試驗(yàn)和紙層鑒別Woodruff等的經(jīng)典篩選毒性試驗(yàn)共六十六頁1.常規(guī)的篩選(shix

33、un)方法瓊脂擴(kuò)散法利用多種微生物作為檢定菌，篩選(shixun)有抗菌活性的物質(zhì)。非致病菌抗生素耐藥突變株和超敏菌株厭氧菌協(xié)同活性檢測共六十六頁以作用機(jī)理(j l)為依據(jù)的篩選方法以耐藥機(jī)制為依據(jù)的篩選方法2.定靶篩選(shixun)從臨床有效的抗生素的作用機(jī)理和細(xì)菌的耐藥機(jī)理來設(shè)計(jì)篩選模型，有目的地篩選具有某種作用機(jī)理的抗生素，試圖獲得抗菌作用強(qiáng)、對耐藥菌有效、毒性小的新抗生素。共六十六頁（1）以作用(zuyng)機(jī)理為依據(jù)的篩選方法細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制劑的篩選；細(xì)菌葉酸代謝抑制劑的篩選；蛋白質(zhì)合成抑制劑的篩選；細(xì)菌DNA回旋酶抑制劑的篩選；改變(gibin)細(xì)胞膜通透性藥物的篩選；作用于細(xì)

34、菌外膜的藥物的篩選；作用于細(xì)菌外排泵的藥物的篩選；作用于非甲羥戊酸生物合成途徑的篩選；氨基糖苷類抗生素的篩選共六十六頁細(xì)菌細(xì)胞壁合成(hchng)抑制劑的篩選土壤分離的微生物（10200株）（細(xì)菌(xjn)、真菌和放線菌）第二步：測定抑制同位素滲入meso-3H二氨基庚二酸L-14C亮氨酸用Diaflo UM-2膜測定相對分子質(zhì)量（1000以下）小分子量：azureomycin A和B（新）AM-1034AM-5289Amphomycin，青霉素G大分子量：ristocetin A 和B其他（11種）+-+-+（487）（238）（1530）+-+-+第一步：抗微生物活性：細(xì)菌支原體細(xì)胞壁合成

35、抑制劑（141）asukamycinSetomimycinvineomycinsnanaomycinA、B、C、D、Efreonolicin Bcervinomycins其他共六十六頁（2）以耐藥機(jī)制為依據(jù)的篩選(shixun)方法抗生素的廣泛使用和一些(yxi)不合理的濫用，引起細(xì)菌耐藥性的增加，而細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展又使耐藥性的解決成為可能。共六十六頁（2）以耐藥機(jī)制(jzh)為依據(jù)的篩選方法耐藥機(jī)制一是細(xì)菌產(chǎn)生一種或多種水解酶或鈍化酶來水解或修飾進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞(xbo)內(nèi)的抗生素，使之失去生物活性；二是抗生素的作用靶點(diǎn)由于發(fā)生突變或被細(xì)菌的某種酶修飾而使抗菌藥物無法發(fā)揮作用，以及抗生素作用的靶酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變使之與抗生素的親和力下降；三是由于細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的改變或其他有關(guān)特性的改變；四是細(xì)