乙肝疫苗的制備

1、基因工程 乙肝疫苗的制備 演 講 者： 鞠 林 PPT 制 作者：楊秀蘭 李翠華 歐永銀資料提供者：鞠林劉珍王偉杰彭博周永斌李凱向運新朱曉東基因工程定義：又稱為重組DNA技術(shù)，指將某些特定的基因或DNA片斷，通過載體或其它手段送入受體細胞，使它們在受體細胞中增殖并表達的一種遺傳學(xué)操作。是生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀并能穩(wěn)定遺傳。作用：可把來自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無關(guān)系的任何其他受體細胞中，可以任意改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀。某一段DNA可在受體細胞內(nèi)進行復(fù)制，為制備大量純化的DNA片段提供了可能.獲得目的基因表達載體重組的表達載體酶切、連接宿主細胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等

2、原核生物細胞植物細胞動物細胞卵細胞培養(yǎng)的動物細胞轉(zhuǎn)基因動物胚胎發(fā)育藥物、疫苗轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因微生物基因工程藥物人類細胞基因治療蛋白質(zhì)名稱 用 途 促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophic hormone） 治療風(fēng)濕（rheumatic disease）B細胞生長因子（B-cell growth factor） 治療免疫系統(tǒng)功能失調(diào)降鈣素(calcitonin) 治療軟骨病(osteomalacia)集落刺激因子(colony stimulating factor) 治療血液病、腫瘤輔助治療絨毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin) 治療不排卵癥內(nèi)啡肽和腦

3、啡肽(endorphine and enkephalin) 鎮(zhèn)痛劑(analgesic agent)上皮生長因子(epidermal growth factor) 促進傷口愈合紅細胞生成素(erythropoietin) 治療貧血(anemia)凝血因子(factor ) 治療血友病(hemophilia)凝血因子(factor ) 治療血友病生長激素(growth hormone) 促進生長生長激素釋放因子(growth hormone releasing factor) 促進生長胰島素(insulin) 治療糖尿病(diabetes)干擾素(interferon) 抗病毒抗腫瘤白細胞介素(

4、interleukin) 治療癌癥基因重組乙肝疫苗 用基因重組技術(shù)把乙型肝炎病毒的表面抗原 （HbsAg）基因片段插入酵母細胞或哺乳動物細胞的基因中，在體外培養(yǎng)增殖過程中組裝或分泌出乙型肝炎表面抗原，然后把表面抗原收集起來提純之后做成乙型肝炎疫苗。乙肝疫苗的制備產(chǎn)品蛋白質(zhì)的分離純化目的基因的表達工程菌的構(gòu)建目的基因的獲取目的基因的獲取編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取一般的目的基因的獲取方法有：反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法cDNA文庫的建立？cDNA文庫的建立Total RNA的提取mRNA的分離cDNA雙鏈的合成載體的制備cDNA與載體的連接重組體導(dǎo)入受體細胞cDNA文庫的鑒定 目

5、的cDNA克隆的分離和鑒定工程菌的構(gòu)建CHO細胞的特點具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能 ,表達的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最 接近于天然蛋白分子具有產(chǎn)物胞外分泌功能 ,便于下游產(chǎn)物分離純化;具有重組基因的高效擴增和表達能力; 具有貼壁生長特性 ,且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力 ,可以進行懸浮培養(yǎng) ,表達 水平較高; CHO 細胞屬于成纖維細胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的內(nèi)源蛋白 ,利于外源蛋白的后分離材料菌株質(zhì)粒及細胞大腸桿菌 DH5 和質(zhì)粒 pMD18-Sm（攜帶改變稀 有密碼子后的 S 基因）質(zhì)粒 pCIneoCHO dhfr-細胞pMD18-T 載體主

6、要試劑限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase、質(zhì)粒 DNA 提取和柱式膠回收試劑盒乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒DMEM 和透析胎牛血清胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂質(zhì)體 Lipofectamine TMHBsAg 血凝檢測試劑盒 目的基因的表達 蛋白質(zhì)的分離純化細胞破碎固液分離濃縮與初步純化高度純化成品加工濃縮與初步純化離子交換層析疏水層析親和層析固液分離離心沉淀膜過濾雙水相萃取高度純化DNA的去除熱原質(zhì)的去除病毒的去除分離純化的基本要求技術(shù)條件溫和，保持其生物活性選擇性好，達到有效分離純化的目的技術(shù)間可以直接連接，節(jié)省工藝步驟收率高，過程快選擇分離純化方法的依據(jù)根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇根據(jù)分

7、離單元之間的銜接來選擇根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇分離純化工藝流程HICButyl S Sepharose FF （疏水柱層析）IECDEAE Sepharose FF（陰離子交換柱層析）GFCSepharose 4 FF （凝膠過濾柱層析）1、發(fā)酵液的預(yù)處理連續(xù)高速離心，除去細胞殘片，再超濾濃縮2、疏水柱層析介質(zhì)： Butyl S Sepharose FF 加入適量硫酸銨，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率與柱層析平衡液電導(dǎo)率相等按照平衡柱床、上樣吸附、平衡液洗柱、降低硫酸銨濃度解析、清柱再生程序?qū)游?3、陰離子交換柱層析介質(zhì)：DEAE Sepharose FFHBsAg活性蛋白經(jīng)Sephadex G-25柱脫鹽換液，使緩沖鹽系統(tǒng)的PH、離子強度和IEC平衡液一