分子生物實驗課件：質(zhì)粒DNA的提取、電泳

1、一、質(zhì)粒DNA的提取主要方法：堿變性法煮沸法SDS法羥基磷灰石層析法等 各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。堿裂解法基本原理： 當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。主要試劑：溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100

2、ml,高壓滅菌15分鐘,儲存于4冰箱。溶液：0.2 mol/L NaOH (臨用前用10mol/L NaOH母液稀釋)，1 SDS。溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高壓滅菌。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。 質(zhì)粒DNA小量提取步驟：1）將1.5ml培養(yǎng)物倒入Ep管中，室溫 10000rpm離心1min，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4。2）棄上清，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。3）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100l用冰預(yù)冷的溶液中，。須確使細(xì)菌沉淀在溶液中完全分散。4）加200l新配制的溶液。蓋緊管口，快速顛倒Ep

3、管5次以混合內(nèi)容物。輕微振蕩，將Ep管放置于冰上5min。5）加150l用冰預(yù)冷的溶液。蓋緊管口，溫和顛倒數(shù)次使混勻，溶液在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上5 min。6）室溫12 000rpm離心10min，取上清 轉(zhuǎn)移到另一Ep管中。7）加等量酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），振蕩混勻，412 000rpm離心5min，取上清 轉(zhuǎn)移到另一Ep管中。8）向上清液加入0.6倍體積異丙醇，混勻后，于-20 放置30-60min.9 ) 412 000rpm離心10min。10）棄上清，把Ep管倒扣在吸水紙上，吸干液體。11）用500l 70%乙醇于4洗滌沉淀，12000rpm離心5

4、min， 棄上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10 min。（可用吹風(fēng)機吹干）12）沉淀溶于30l TE（含RNaseA20g/ml），37水浴15min以降解RNA分子，-20保存?zhèn)溆谩?1.提取過程中應(yīng)盡量保持低溫。2.加入溶液II 和溶液III 后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。3.提取質(zhì)粒DNA 過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。注意事項：二、電泳實驗原理： 溴化乙錠（EB）能夠嵌入到DNA分子的堿基對中形成熒光復(fù)合物，在紫外線激發(fā)下發(fā)射熒光。 電泳步驟： 1.配膠：取1g瓊脂糖放入100ml的1*TAE緩沖液中，加熱2min使溶化，冷卻至600C后加入EB （5 l）至終濃度為0.5 g/ml,混勻。 2.將凝膠趁熱導(dǎo)入先前準(zhǔn)備好的膠板中，達(dá)到3-5mm厚。冷卻至完全凝固。 3