分光光度技術(shù)簡介

1、PAGE PAGE 131分光光度技術(shù)簡介6.1 基本原理利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計，這種分光光度計靈敏度高，測定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重點討論紫外/可見分光光度法的基本原理、儀器構(gòu)造及其在生化領(lǐng)域中的應(yīng)用等。1. 光譜：光是電磁波，可用波長“”表示，電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續(xù)波長的光譜所組成，對于生物化學來說，最重要的波長區(qū)域是可見光和紫外光。光的波長是二個相鄰的波峰之間的距

2、離。光的傳播是由相互垂直的電場分量“E”和磁場分量“H”所構(gòu)成。 C/波長 C光速 頻率，單位時間通過一個定點的波數(shù)。光又可以看作是由具有能量的粒子所組成。這些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：EhH普朗克常數(shù)（ 6.62410-27爾格秒）頻率紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠紫外）。由于吸收池（又稱樣品池、比色杯等）和光學元件以及氧氣能吸收小于190nm波長的光，因此常規(guī)紫外測定集中在近紫外區(qū)，即 200nm400nm?？梢姽鈪^(qū)為400nm800nm。組成物質(zhì)的分子均處于一定能態(tài)并不停地運動著，分子的運動可分為平動、轉(zhuǎn)動、振動和分子內(nèi)電子的運動，每種運動狀態(tài)都處于一定的能級，因此分

3、子的能量可以寫成：EE0+E平+E轉(zhuǎn)+E振+E電E0是分子內(nèi)在的不隨分子運動而改變的能量，平動能E平只是溫度的函數(shù)，因此與光譜有關(guān)的能量變化是分子的轉(zhuǎn)動能量、振動能量和分子的電子能量。分子的每一種能量都有一系列的能級，能級不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子處于基態(tài)，當它吸收一定能量躍遷到激發(fā)態(tài)，則產(chǎn)生吸收光譜。分子轉(zhuǎn)動、振動和電子能級的躍遷，相應(yīng)地產(chǎn)生轉(zhuǎn)動、振動及電子光譜。按照量子力學原理，分子能態(tài)按一定的規(guī)律跳躍式地變化，物質(zhì)在入射光的照射下，分子吸收光時，其能量的增加是不連續(xù)的，物質(zhì)只能吸收一定能量的光，吸收光的頻率和兩個能級間的能量差要符合下列關(guān)系：EE2- E1hE1、E2分別

4、表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量，初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長愈長）。由于吸收是不連續(xù)的，因此在光的一定部位出現(xiàn)一系列吸收暗帶。因為分子轉(zhuǎn)動、振動及電子能級躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現(xiàn)在不同的光譜區(qū)域。分子轉(zhuǎn)動能級級差小，E0.05電子伏特（ev），分子轉(zhuǎn)動光譜的吸收出現(xiàn)在遠紅外或微波區(qū)。振動能級縱間的差別較大， E0.051.0 ev，振動光譜出現(xiàn)在中紅外區(qū)。電子能級的級差更大， E120 ev，所以由電子躍遷得到的光譜出現(xiàn)在可見、紫外或波長更短的光譜區(qū)?？梢姽狻⒆贤夤馕展庾V，是由于分子中聯(lián)系較松散的價電子

5、被激發(fā)產(chǎn)生躍遷從而吸收光輻射能量形成的，即分子由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，電子由一個低能級的軌道（即成鍵軌道），吸收了光能量躍遷到高能級軌道（稱為反鍵軌道）。與吸收光譜有關(guān)的三種電子是： 二個原子的電子沿其對稱方向相互形成的共價鍵（即單鍵），稱 鍵， 構(gòu)成 鍵的電子稱 電子，如CC、CH鍵。 平行于二個原子軌道形成的價鍵（即雙鍵），稱 鍵，形成鍵的電子稱為 電子，如C=C鍵。 未共享成鍵的電子，稱n電子。各種電子躍遷所需能量大小的順序是：n* n*紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共軛雙鍵中的電子和未共享的電子對的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分子的雙鍵數(shù)目和未共享電子對的

6、共軛情況等。如下表所示： 電子躍遷類型與紫外吸收波長(nm)關(guān)系表電子躍遷類型 例 子紫外吸收波長范圍* CH 100150 nm *( 非共軛 ) CO 200 nm *( 共軛 ) CC 200300 nm n* CO 300 nm *躍遷：此類躍遷所需能量較小，吸收波長在紫外區(qū)的200300 nm，不飽和烴、共軛烯烴及芳香烴均可發(fā)生這類躍遷，氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸均含有大量共軛雙鍵，因而200300 nm的紫外吸收測定，在生化實驗技術(shù)中有極廣泛的用途。若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長，并測定物質(zhì)對各種波長光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波長作橫

7、坐標，“A”或“T”為縱座標，畫出連續(xù)的“A”或“T”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。吸光度 A D C B max min 波長(nm) 由上圖可以看出吸收光譜的特征：曲線上“A”處稱最大吸收峰，它所對應(yīng)的波長稱最大吸收波長，以max表示。曲線上“B”處有一谷，稱最小吸收，它所對應(yīng)的波長，所對應(yīng)的波長，稱最小吸收波長，以min 表示。曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱肩峰。在吸收曲線的波長最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當強，但不成峰形，此處稱為末端吸收。max是化合物中電子能級躍遷時吸收的特征波長，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，max、min、

8、肩峰以及整個吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。測定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標準的紫外光譜圖相對照，對照時須注意測定的條件，如溶劑、濃度等。常用標準的紫處吸收光譜是薩德勒研究實驗公司編制的“Sadtler”紫外標準圖譜集，到七十年代末為止已收集28585個化合物紫外光譜圖，此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜是許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進行化合物定性鑒定時，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團或基團，

9、因此在鑒定時應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。由于電子躍遷的同時也引起分子的轉(zhuǎn)動和振動光譜，要把電子躍遷和分子振動、轉(zhuǎn)動的躍遷完全分開是不可能的，因此我們常見的紫外吸收光譜是由一個或幾個寬的吸收譜帶所組成。紫外光譜中常用的術(shù)語有發(fā)色團、助色團、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。發(fā)色團：凡是與飽和碳氫化合物連接能引起n*、*、 n* 等電子躍遷的基團稱為發(fā)色團。例如：CC、CO等發(fā)色團。助色團：助色團是一些具有非共價鍵的基團（如OH、NH2、SH等）。這些基團在波長200 nm處沒有吸收，當它與發(fā)色團相連接時，使發(fā)色團的吸收帶向長波移動，稱為紅移（或淺色效應(yīng)），紅移的同時吸收帶的強度增加。若助色團與發(fā)色團相連接，產(chǎn)生 n*

10、 躍遷，使吸收波長向短波移動，稱為蘭移（或深色效應(yīng)）。增色效應(yīng)（hyperchromic effect）:核酸變性或降解，使得DNA或RNA溶液對紫外光的吸收明顯增加，即 值（吸光系數(shù)或稱消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在260nm處測量。減色效應(yīng)（hypochromic effect）:在一定的條件下，變性的核酸又可以復性，此時值又明顯減少，回復到原來的核酸分子值較低的水平，即此時DNA或RNA溶液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在260nm條件下測量。2. 光吸收定律：朗

11、伯比爾（Lambertbeer）光吸收定律： AlgTb cA吸光度，又稱光密度“O.D”。T透光度， TI / I。， I。為照射到吸收池上的光強，I為透過吸收池的光強。摩爾吸光系數(shù)或克分子吸光系數(shù)（Lmol1cm1）。b樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。C樣品濃度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。摩爾吸光系數(shù)： ， 是物質(zhì)對某波長的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越強，相應(yīng)的分光度法測定的靈敏度就越高。值越大，說明電子躍遷的幾率大，通常 10105：一般認為 104為強吸收；103104 為較強吸收； 10

12、2 為弱吸收，此時分光光度法不靈敏。因為通常使用分光光度計可檢測出的最小吸光度A0.001, 所以，當b1cm, 105時，可檢測的溶液最小濃度是C10-8 mol/L。常用的吸光系數(shù)還有一種百分吸光系數(shù)，即在某一波長下，溶液濃度為1%（W / V），液層厚度b1cm時的吸光度，以E1%max表示。C百分濃度（W / V）。L液層厚度，吸收杯光徑長度。 A吸光度。最大吸收波長max時的 和E1%max值可用下式換算： E1%max分子量 / 10吸光度“A”有一個重要性質(zhì)是其具有加和性：A1C1b12C2b23C3b3即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的算術(shù)和。這是多元混

13、合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例如，離子交換柱層析分離核苷酸實驗中可利用吸光度計算回收率：mCV ， ， m溶質(zhì)的量 C溶質(zhì)濃度V溶液體積 A吸光度吸光系數(shù) b吸收池光徑 回收率（100%） （上式中假設(shè)總和各核苷酸的近似相等）例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定 260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù) = 8.2103 M1cm1（Mmol / L）。 A bC A（溶劑加樣品的吸光度）（溶劑的吸光度） A0.6500.0700.58

14、0 b1cm C=7.1105 mol / L 例二：1%（W/V，10 mg / ml）酪氨酸酶溶液的吸光度為24.9（1cm吸收池，280nm），計算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的濃度。由于這兩種酶溶液的百分吸光系數(shù)“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法計算濃度。 C未知0.010.1mg / ml6.2 分光光度計的組成和構(gòu)造：1. 組成：各種型號的紫外/可見分光度計，不論是何種型式，基本上都由五部分組成：（1）光源；（2）單色器（包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測器的光學系統(tǒng)）；（3）樣品室；（4）接收檢測放大系統(tǒng)；（5）顯示或記錄器。光 源 單色器 樣品室 檢測放大系

15、統(tǒng) 顯示器國產(chǎn)分光光度計近年來已有很大的發(fā)展，各種檔次的分光光度計都已更新升級換代，可見光系列有：721、722、723等型號，紫外/可見光系列有：751、752、753、754、756等型號，主要生產(chǎn)廠為上海分析儀器總廠等。我系1985年購買的瑞士KONTRON康強公司生產(chǎn)的UNICON 860型紫/可見光分光光度計，是雙光束、快速自動掃描、熒屏顯示的高檔分光光度計。這種雙光束分光光度計的特點是來自光源的連續(xù)光譜經(jīng)凹面全息光柵分光后，由出射狹縫得到單色光，經(jīng)過由電機帶動的25周/秒左右的旋轉(zhuǎn)鏡分解為“樣品”、“參比”光束，順序分時通過參比池和樣品吸收池，照射到光電倍增管上，由于兩條光路是幾乎

16、同時測量，參比信號又不斷與標準電壓比較，使參比信號恒定，所以由光源、單色器、外界雜光、光電倍增管以及電源電壓等帶來的影響，儀器均能自動消除。最快波長掃描速度為1200nm/min，有五種測量功能和五種數(shù)據(jù)處理功能。我系2000年購買的德國耶拿（蔡司）公司生產(chǎn)的SPECORD 200型高檔紫外/可見光分光光度計的光路原理圖如下：SPECORD 200分光光度計的樣品和參比光路，分別有各自的帶溫控的光電二極管檢測器，因而取消了電機帶動的旋轉(zhuǎn)鏡，大大提高了儀器的穩(wěn)定性及各項檢測指標，其波長范圍是190nm1100nm，吸光度測定范圍是03A，可變狹縫寬度為1nm、2nm和5nm，儀器使用微機控制時，

17、掃描速度最高可達6000nm/min，寬大的樣品室可以安裝各種附件，儀器性能優(yōu)良，適合教學、科研使用。該儀器的使用說明詳見附錄。2. 構(gòu)造： 光源：理想光源的條件是：能提供連續(xù)的輻射；光強度足夠大；在整個光譜區(qū)內(nèi)光譜強度不隨波長有明顯變化；光譜范圍寬；使用壽命長，價格低。用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogen lamp），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長范圍是3201100nm。由于能量輸出的波動為電壓波動的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuterium lamp），適用波長范圍是195400nm，由于氘燈壽命有限，

18、國產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時左右，要注意節(jié)約燈時。 單色器：單色器是分光光度計的心臟部分，它的作用是把來自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長。它的主要組成部件和作用是：入射狹縫限制雜散光進入。色散元件即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。準直鏡把來自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。 出射狹縫只讓額定波長的光射出單色器。轉(zhuǎn)動棱鏡或光柵的波長盤，可以改變單色器出射光束的波長；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。光柵：光柵有透射光柵和反射光柵，實際應(yīng)用的都是反射光柵，它又可分為平面反射光柵（即通稱的反射光柵或閃爍光柵）和凹面

19、反射光柵兩類，凹面反射光柵可以起色散元件和準直鏡兩個作用，使色散后的光束聚焦于出射狹縫，得到銳線光譜。光柵的刻制方法有兩種：機刻光柵：用金剛刀擠壓鍍于硬質(zhì)玻璃上0.51的鋁反射層而得?？讨乒ぷ髁繕O大，一般每分鐘只能刻10條線，刻100mm寬的600線/mm的光柵要100小時。最多刻到3600線/mm。由于其制造周期長，成本高，一般只能制得少量的母光柵，而實際應(yīng)用的多是復制光柵，即在母光柵上涂上硅油，再鍍上一層鋁，用環(huán)氧樹脂粘下來，就得到復制光柵。機刻光柵的缺點是線槽稍有缺陷時就會出現(xiàn)“鬼線”，即位于光譜強線兩側(cè)的模糊不清的假線。 全息光柵：用全息照相法刻制的高精度光柵。即用高強度的相干性極好的

20、單色光，如激光，用高分辨的感光材料光致抗蝕劑記錄干涉條紋，曝光1小時，化學處理掉受光部分，再進行真空鍍膜（鍍鋁），得到全息反射光柵。這種光柵幾乎沒有線槽間的周期誤差，幾乎沒有“鬼線”，雜散光很少。最大線槽密度可達6500線/mm，最大直徑可達400mm，刻線越多，分辨率就越高，最常用的是12001500線/mm的全息光柵。狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率：出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法：一為狹縫的實際寬度，以毫米（mm）表示，另一種為光譜頻帶寬度，即指由出射狹縫射出光束的光譜寬度，以毫微米nm表示。例如，出射狹縫的寬度是6nm，并不是說出射狹縫的寬度是6nm，而是指由此狹縫射出的光具有6nm的光譜

21、帶寬。純粹的單色光只是一種理想情況，分光光度計所能得到的“單色光”，實際上只是具有一定波長范圍的譜帶，狹縫越寬，所包括的波長范圍也愈寬。 對單色光純度來說，狹縫是愈窄愈好，但光的強度也就越弱，因此狹縫不能無限制地小，狹縫的最小寬度取決于檢測器能準確地進行測量的最小光能量。目前達到的最小寬度為0.1nm。光譜有效頻帶寬度“b”是檢測器檢測到的光能量為峰值一半處的二點間的波長間隔，如下圖所示： 光強度 Pb 光譜有效頻帶寬（nm）b 狹縫寬度（mm） 1/2h 線色散率 b 光譜有效頻帶寬b d波長差 1/2hdS出射狹縫平面上二條 波長 光線（d）所分開的距離（mm） 由上式可以看出，b與b成正

22、比， 與線色散率成反比。線色散率越大，則可得到的有效頻帶寬度越小。分辨率：是儀器對相鄰的兩個峰可分辨的最小波長間隔，是儀器分辨鄰近二條譜線的能力。分辨率 ： 例如若可分開鈉雙線：則 高的分辨率可達：R=105。所以，狹縫寬度b越小，光譜帶寬b越小，分辨率就越高。何種情況算是能夠分辨：定義為二條譜線的峰與谷處于同一位置時，此二個峰認為是剛好能分辨。由于光柵分光其色散是線性的，所以只用一種狹縫寬度對各種波長的光的測量，其分辨率都相同，即狹縫寬度不必經(jīng)常調(diào)節(jié)。只要光強能達到要求，應(yīng)使用盡可能小的狹縫寬度，以提高分辨率。 樣品室：包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒

23、溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為 0.1，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達 0.05。吸收池有光學玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學玻璃杯因為普通光學玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見光，適用波長范圍是400nm2000nm。石英玻璃杯可透過紫外光、可見光和紅外光， 是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm3000nm。吸收池的形狀有長方形，方形和園筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容積3ml），光程要求極精確，透光的玻璃面要嚴格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭頭“”，標明杯子使用時的透光方向，反方向使用

24、會有偏差。有各種用途的石英吸收池：如液體池、氣體池、微量池（容積5l1ml）、流動池（測量連續(xù)流動的樣品）、長光徑池（測量稀溶液用）、可裝拆池（便于清洗）等。石英杯通常還配有玻璃或塑料蓋，用以防止樣品揮發(fā)和氧化，以及杯內(nèi)樣品的快速混合。吸收池使用注意事項： 要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時可放在 1洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個小刷子清洗杯子。 嚴禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。 嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風吹

25、干。決不可用超聲波清洗器清洗。 吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻璃面上寫上記號。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測定吸光度“A0”，樣品杯換上樣品液后測定的吸光度為“A1”，則校正后的實際吸光度A為：A= A1A0 高檔的分光光度計有自動置零系統(tǒng)，可將二個杯子的偏差置零。其他重要附件：高檔分光光度計的樣品室還可以更換各種重要附件，用于各種特殊量測。如換上“積分球”，可用來檢測微弱透光和不透光的樣品。換上“凝膠掃描裝置”，可用于電泳凝膠膠條上樣品帶的掃描測量。 檢測器：檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電二極管等三種。光電管：光電管可檢測10微微安（10-11A）的光電流，管內(nèi)抽真空充入惰性氣體，常用國產(chǎn)真空光電管有GD-5蘭敏光電管（適用波長為210625nm）；GD-6紅敏光電