梯度透析法及稀釋法蛋白的復(fù)性

1、蛋白的復(fù)性重組基因在表達宿主中表達量過高或合成速度過快，以至于沒有足夠的時間 進行折疊，二硫鍵不能正確配對，導(dǎo)致蛋白以包涵體的形式存在。導(dǎo)致包涵體形 成的主要原因有以下幾點： 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。 重組蛋白所處的環(huán)境：誘導(dǎo)溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點時容易形成 包涵體。 重組蛋白是大腸桿菌(Escherichia coli)的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯 后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。有報道認為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達，當培養(yǎng)條件不佳時， 容易形成包涵體。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學(xué)活性

2、，因此要獲得具 有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質(zhì)，并進行蛋白質(zhì) 的復(fù)性。包涵體復(fù)性在世界范圍內(nèi)都是個難題，最好的復(fù)性方法也不會超過 20%。目前大家在這方面研究也比較多，有研究證明一些分子伴侶有助于蛋白的 復(fù)性；同時稀釋、透析、滲透是最經(jīng)典的蛋白復(fù)性的方法；另外氨基酸如精氨酸、 糖類、醇類、表面活性劑對蛋白的復(fù)性都有輔助作用，還有很多的表達系統(tǒng)可以 助復(fù)性。本公司主要通過梯度透析和稀釋的方法對變性蛋白進行復(fù)性。梯度透析法梯度透析緩沖液配方：PBS (IL)： 8.0NaCl、28.65gNa2HPO4 12H2O、0.234gNaH2PO4 - 2H2O緩沖液 A： 5

3、0mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100 緩沖液 B： 50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton X-100、2M脲素緩沖液 C： 50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100、2M鹽酸胍溶解緩沖液 D： 50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、10mM。- 巰基/乙醇/DTT、2mM脫氧膽酸鈉、8M脲素復(fù)性緩沖液I： 50mM Tris-HCl (pH8

4、.5)、100mM NaCl、6M/4M/2M 脲素、1% 甘 氨酸、5%甘油、0.2%PEG、1mM氧化型谷胱甘肽、1mM還原型 谷胱甘肽包涵體純化及復(fù)性操作步驟：若蛋白以包涵體的形式純在，則需要從包涵體中純化出目的蛋白：1、大量誘導(dǎo)表達菌液，5000g離心10min，棄上清，用緩沖液A重懸，超聲 波破碎，功率45%，工作2s，暫停2s，破碎10min，10,000g離心10min。將離心收集的包涵體用PBS緩沖液洗滌一次。離心，收集沉淀。2、將沉淀用緩沖液B重懸，同樣的條件超聲破碎5min； 10,000g離心10min， 棄上清，收集包涵體沉淀。3、再用緩沖液C超聲3min，清洗包涵體沉

5、淀。10,000g離心10min收集沉 淀。4、用緩沖液D溶解包涵體，緩慢搖動使其緩慢溶解，室溫放置30min，然 后10,000g離心10min，取上清。5、將上清稀釋至0.1-1.0mg/ml，裝入透析袋中，放置于6M尿素的復(fù)性緩沖 液中，4C緩慢透析6h。6、再將透析袋置于4 M尿素的復(fù)性緩沖液中，4C緩慢透析14h。7、再將透析袋置于2 M尿素的復(fù)性緩沖液中，4C緩慢透析14h。8、最后將透析袋置于透析液(PBS)中透析過夜。9、將透析后的重組蛋白進行SDS檢測，看純度是否達標，若含有雜 蛋白則根據(jù)重組蛋白所帶標簽的不同對進行對應(yīng)的掛柱純化，后期純化過程 同可溶性蛋白的純化。稀釋法復(fù)性

6、蛋白稀釋法蛋白復(fù)性緩沖液配方：PBS (IL)： 8.0NaCl、28.65gNa2HPO4 12H2O、0.234gNaH2PO4 - 2H2O緩沖液 A： 50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100 緩沖液 B： 50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton X-100、2M脲素緩沖液 C： 50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100、 2M鹽酸胍溶解緩沖液 E： 50mM Tris-HCl (p

7、H8.5)、15mM DTT、8M 脲素復(fù)性緩沖液 II： 50mM Tris-HCl (pH8.5)、1M NaCl、2M 脲素、0.5mM L-Arg、0.5mMZnCl2、1mM還原型谷胱甘肽包涵體純化及復(fù)性操作步驟：若蛋白以包涵體的形式純在，則需要從包涵體中純化出目的蛋白：1、大量誘導(dǎo)表達菌液，5000g離心10min，棄上清，用緩沖液A重懸，超聲 波破碎，功率45%，工作2s，暫停2s，破碎10min，10,000g離心10min。將離心收集的包涵體用PBS緩沖液洗滌一次。離心，收集沉淀。2、將沉淀用緩沖液B重懸，同樣的條件超聲破碎5min； 10,000g離心10min， 棄上清，收集包涵體沉淀。3、再用緩沖液C超聲3min，清洗包涵體沉淀。10,000g離心10min收集沉 淀。4、用緩沖液D溶解包涵體，緩慢搖動使其緩慢溶解，室溫放置30min，然 后10,000g離心10min，取上清。5、使用BAC試劑盒測出溶解的包涵體蛋白濃度，蛋白濃度較高則用溶解緩 沖液將其濃度稀釋至0.5mg/ml左右。6、將稀釋后的蛋白溶液緩慢的加入到復(fù)性緩沖液中，加入過快會導(dǎo)致蛋白 凝聚，因此盡量慢慢滴加。7、將混合液的pH值調(diào)至8.5, 4C條件下放置24h稀釋復(fù)性，復(fù)性率可達至 25%。8、將復(fù)性的蛋白10,000g離心10min，上清轉(zhuǎn)入