植酸酶的測定

1、植酸酶活性的測定一、測定原理銅黃法（偏帆酸鉉法）原理:植酸酶在一定溫度和pH值條件下，水解底物植酸鈉，生成正磷 酸和肌醇衍生物，在酸性環(huán)境中,用帆鑰酸鉉處理生成黃色復(fù)合物，在415nm波長下進行比色 分析。二、反應(yīng)條件的探討1、反應(yīng)體系的溫度及加熱時間的探討圖1酶活性隨溫度的變化T由上圖可.知，在溫度為45攝氏度左右時，植酸酶的活性達到最大，所以在酶促反應(yīng)時應(yīng)使 溫度穩(wěn)定在45C左右，植酸酶的作用效率才最大。2、反應(yīng)溶液pH的探討圖圖2酶活性隨pH變化200180200180160140120A 1008060402000 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6

2、 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10pH由上圖可知，在PH為5左右時，植酸酶的活性達到最大，所以植酸酶緩沖液提供的的PH 環(huán)境應(yīng)在5左右由上圖可知，Ca離子和Na離子對酶的活性影響最小，Zn離子和Cu離子對酶的活性抑制影 響較大。圖4離子濃度對酶的影響9080709080706050403020101009080706050 S403020100.841.061.682.122.523.184.25.38.410.6Con圓點系列表示+濃度對酶的活性的影響，隨 Cu2+濃度增加，酶的活性增加： 三角形系列表示Zr?濃度對酶活性的影響，隨著Zr?,濃度增加，酶的活性增加。4、不同反

3、應(yīng)體系條件對植酸酶活性測定影響不同溫度和pH下的酶比活性變化酶比活性酶比活性圖5所示為正交實驗時，不同溫度和pH的組合的條件下測得的植酸酶的比活性，在pH為 5,溫度在45C左右時植酸酶活性這到最大。5、酶促反應(yīng)時間的確定37Phr由上圖可知，在0.5h以前，酶作用底物的速度呈直線關(guān)系,所以測定時反應(yīng)的時間應(yīng)該在5、酶促反應(yīng)時間的確定37Phr由上圖可知，在0.5h以前，酶作用底物的速度呈直線關(guān)系,所以測定時反應(yīng)的時間應(yīng)該在30min左右。斜率=0.854523227相關(guān)性=0.997923599截距=3.383740831根據(jù)上圖可求得Sm=2.53mmol/L7、酶的穩(wěn)定性圖8酶的穩(wěn)定性2

4、50200空 150房遂 100500020406080100120140time由圖可得，酶活性隨時間而降低，故酶樣品溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用三、實驗步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取0.680g在105C烘至恒重的基準(zhǔn)磷酸二氫鉀（）于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖 液溶解，并定容至刻度，濃度為50.0mmol/L按下表的比例用乙酸緩沖液稀釋成不同的濃度， 與待測樣一起反應(yīng)測定。以無機磷酸的量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，列出回歸線方程（y=a+bx）o標(biāo)準(zhǔn)稀釋比例標(biāo)準(zhǔn)溶液序號稀釋量濃度/(|J mol/ml)10. 5-161. 562520. 5-83. 125030. 5-46. 250040. 5-

5、212. 500050. 5-125. 00002、取10ml試管按卜面的反應(yīng)順序進行操作，標(biāo)準(zhǔn)空白加Ao 2ml乙酸緩沖液。在反應(yīng)過程 中，從加入底物溶液開始，向每只試管中加入試劑的時間間隔要一致，在恒溫水浴45C水 解 SOmino3、反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見表。反應(yīng)順序樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品空白1、加入乙酸緩沖液1.9ml1.9ml2、加入酶液0.1ml0.1ml3、混合VV4、恒溫水浴45笆預(yù)熱5|7!泊V5、依次加入植酸溶液4ml4ml （第二步）6、混合VV7、恒溫水浴45C水解30minV8、依次加入終止及顯色液4ml4ml （第一步）9、混合V總體積10ml10ml注：終止及顯色液：

6、移取兩份硝酸溶液（1+2水溶液），一份偏鞏酸氨溶液混合后使用， 現(xiàn)用現(xiàn)配。乙酸緩沖液,c=0.25mol/L:稱取20.52g無水乙酸鈉于1000ml燒杯中,加入900ml水?dāng)?拌溶解至刻度。4、樣品測定反應(yīng)后的溶液在室溫下靜置lOmin,如出現(xiàn)渾濁需在離心機上離心去沉淀，上 清以磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線空白調(diào)零，在分光光度計415波長處測定試樣空白（A。）和是試樣溶液（A） 吸光值，A-AO為實測吸光度值。用直線回歸方程計算植酸酶的活性。四、結(jié)果計算和表示1、植酸酶活性單位的定義由己知的條件:植酸酶樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol/L、溫度45C、pH值5的條件下, 每Imin從2.5mmol/L植酸鈉中釋放Ip mol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以“U”表示。(1)式中：X一一試樣中植酸酶的活性，單位為酶活性單位每克（U/g）或酶活性單位每亳升（U/ml）; y一一根據(jù)實際試樣的吸光值由直線回歸方程計算出無機磷