細(xì)胞因子、抗體檢測技術(shù)

1、背景知識研究細(xì)胞因子對闡明機(jī)體免疫應(yīng)答及其調(diào)節(jié)機(jī)制、免疫相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和指導(dǎo)臨床治療均具有重要意義?？贵w具有高特異性、高親和力等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、微生物學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。細(xì)胞因子的檢測方法： 1) 生物學(xué)方法 依賴性細(xì)胞株 ：生物分析法 功能檢測 ：生物分析法 2) 分子生物學(xué)方法 分子雜交技術(shù) ：mRNA的測定 多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）：mRNA的測定 3）免疫學(xué)方法 免疫測定 ：免疫酶技術(shù) 功能測定與抗體抑制 抗體檢測技術(shù) 1）免疫酶技術(shù) 2）免疫熒光技術(shù) 3）間接血凝試驗(yàn) 4）放射免疫測定 5）蛋白印跡 6）免疫共沉淀 酶聯(lián)免疫吸附測定(

2、ELISA)Enzyme linked immunosorbent assay 該試劑盒是基于NP30抗獨(dú)特型抗體可替代蟲源性抗原的特性研制而成的。在國內(nèi)、外均屬率先應(yīng)用生物技術(shù)制備抗原代替?zhèn)鹘y(tǒng)蟲源抗原。已證實(shí)NP30檢測的血吸蟲抗體屬短程抗體，治療后陰轉(zhuǎn)較快，具有療效考核價(jià)值。 該試劑盒的診斷效能多項(xiàng)指標(biāo)均已達(dá)到或超過經(jīng)典抗體檢測法，較以前病原學(xué)檢查和免疫學(xué)檢測方法更為簡便快速。僅用一滴血，20分鐘即可判讀結(jié)果，不需其他儀器設(shè)備，便于在基層、現(xiàn)場使用。本試劑盒已在血吸蟲流行區(qū)已應(yīng)用近120萬人次。 實(shí)驗(yàn)原理 酶聯(lián)免疫吸附測定是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)自70

3、年代初問世以來,發(fā)展十分迅速，因其具有微量、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、方便和安全等特點(diǎn)，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)原理 ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性檢測抗原或抗體。1、使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。2、使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。3、按一定步驟進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。4、加底物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。方法類型 ELISA既可測抗原又可測抗體，根據(jù)試劑來源、標(biāo)本性狀以及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出不同類型的檢測方法。 1.直接法 2.間接法 3.雙抗體夾

4、心法 4.雙夾心間接法一、試劑及儀器準(zhǔn)備 免疫吸附劑固相載體 要求： 吸附力強(qiáng) 能保持Ag或Ab活性 不參與化學(xué)反應(yīng) 載體性能比較 載體材料：+、- 結(jié)果差別大 ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV10%。 常用載體： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板2. Ag或Ab：純度高、效價(jià)高、結(jié)合力高3. 免疫吸附劑(固相Ag或Ab)： 包被：將Ag或Ab固相化的過程包被緩沖液、包被方法 封閉：包被后在用15%小牛血清白蛋 白再包被，以消除非特異吸附的干擾。 酶結(jié)合物：1. 酶的要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、

5、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定。2. ELISA常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等 3. 酶的底物： HRP可溶性底物及呈色： 鄰苯二胺(OPD)：橙紅(429nm) 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍(lán)色(450nm) 5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm) 魯咪諾+H2O2：熒光 HRP不可溶性底物及呈色： DAB(棕黃色) -萘酚(紅色)， 3-氧基-9-乙基卡唑(紅色) 4-氯-1-萘酚(灰藍(lán)色) AP可溶性底物及呈色： 對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm) 4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光 AP不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 堅(jiān)固紅和萘酚ASM

6、X混合液：紅色 -半乳糖苷酶： 4-甲基傘基-半乳糖苷：熒光4. 酶結(jié)合物的制備： 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法（三）設(shè)備： 酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指測讀ELISA光度計(jì)。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。 操作時(shí)室溫宜在15-30，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀。二、操作步驟（間接ELISA法）1.樣

7、本的收集；2.包被抗原；3.封閉；4.加稀釋的待檢樣品；5.加酶標(biāo)抗抗體； 6.加底物顯色；7.終止反應(yīng)。（一）樣品的收集和保存： 1. 溶血標(biāo)本可增加非特異性顯色(Hb作用 于HRP的輔基)； 2. 細(xì)菌污染標(biāo)本因菌體內(nèi)源性酶而假“-” (破壞Ag或Ab)或假“+”(非特異蛋白)； 3. 反復(fù)凍融可使抗體效價(jià)下降而假“-”； 4. 陳舊標(biāo)本可使IgG聚集，引起間接法本 底增加； 5. 標(biāo)本中含NaN3，可出現(xiàn)假“-”。（二）包被 將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。

8、這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。包被的條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液 pH7.2的磷酸鹽緩沖液 pH7-8的Tris-HCl緩沖液。 加入包被液后，在4-8冰箱中放置過夜或37中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。最適工作濃度的選擇 可用棋盤滴定法在夾心ELISA法中選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度，即利用棋盤滴定，將包被抗體和酶標(biāo)抗體稀釋成一系列濃度，反應(yīng)后顯色。陽性值在

9、0.8左右，陰性值小于0.1為最適，可據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度 方陣(棋盤)滴定法選擇包被抗原的工作濃度 用包被液將抗原作一系列稀釋(1:50l:800)后，按行進(jìn)行包被、洗滌。按列分別加入用稀釋液1:100稀釋的強(qiáng)陽性、弱陽性、陰性參考血清及稀釋液(作空白對照)，保溫，洗滌。加工作濃度酶標(biāo)抗體，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。選擇強(qiáng)陽性參考血清A值；為08左右，陰性參考血清A值01的包被抗原稀釋度為工作濃度。（三）封閉 封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)

10、的再吸附。 常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。（四）加樣抗原或抗體：純化抗原/抗體(天然但干擾多)、合成抗原/抗體(多肽分子較小，常有空間位阻)、基因抗原(與片段的選擇和制備水平有關(guān))對照設(shè)定 陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對照。 陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。

11、 陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。（五）加酶標(biāo)抗體即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。（六）顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)

12、果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無色。（七）結(jié)果判定 拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。 以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。 結(jié)果以光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD

13、的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。 1. 定性測定 定性測定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。 在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔 2.定量測定 ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)

14、準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。三、基本操作注意事項(xiàng)（一）加樣: 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。（二）孵育 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的孵育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。（三）洗滌 洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。 ELISA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。 可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。四、實(shí)驗(yàn)中常出現(xiàn)的問題1. ELISA出現(xiàn)“一片黃”的原因： 酶結(jié)合物濃度過高 底物不新鮮 洗滌不干凈2.ELISA出現(xiàn)“一片白”的原因： 載體吸附性