DNA甲基化和臨床應(yīng)用培訓(xùn)課件

1、目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)33目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)為什么熊貓是黑白的？ 基因決定命運(yùn)為什么熊貓是黑白的？ 基因決定命運(yùn) 同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但他們長(zhǎng)大成人后在性格、健康方面往往存在很大差異。 同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但先從表觀遺傳學(xué)談起相同的基因型 不同的表型 ? 基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)先從表觀遺傳學(xué)談起相同的基因型 不同的表型 ? 基因環(huán)境現(xiàn)代表觀遺傳學(xué)概念： 基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型。表觀遺傳學(xué)的現(xiàn)象（基因表達(dá)的調(diào)控方式）

2、：DNA甲基化-表觀遺傳學(xué)的核心（最初始的調(diào)控方式）組蛋白修飾MicroRNAGenomic imprinting現(xiàn)代表觀遺傳學(xué)概念：不同層次表達(dá)調(diào)控不同層次表達(dá)調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAH DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5碳位以共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。DNA甲基化的概念DNA甲基轉(zhuǎn)移酶： DNMT DNA甲基化是指DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)哺乳動(dòng)物體內(nèi)有三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶： DNMT1、 DNMT3A和D

3、NMT3B。DNMT1- 持續(xù)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；與甲基化相關(guān)，缺乏引起基因組低甲基化，染色體缺失、重排、突變畸形。DNMT3A、DNMT3B- 從頭甲基轉(zhuǎn)移酶；與去甲基化相關(guān)，在胚胎干細(xì)胞和早期胚胎中高度表達(dá)，缺乏引起胚胎死亡，在腫瘤組織中廣泛高表達(dá)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)哺乳動(dòng)物體內(nèi)有三種DNA甲基化轉(zhuǎn)通常啟動(dòng)子和第一個(gè)外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過(guò)均值5倍以上，成為鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)。結(jié)構(gòu)基因組中70% 90% 的獨(dú)立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 島約有60以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。 是結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。CpG島（C

4、pG island）預(yù)測(cè)軟件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/通常啟動(dòng)子和第一個(gè)外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過(guò)均值5目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)33目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)DNA甲基化的生物學(xué)作用在發(fā)育和分化中調(diào)控基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制特征性表型基因的表達(dá)（膚色、毛發(fā)） X染色體的失活（X-inactivation ）基因印記堿基突變腫瘤代謝DNA甲基化的生物學(xué)作用在

5、發(fā)育和分化中調(diào)控基因的表達(dá) DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾，在體細(xì)胞增殖過(guò)程中通過(guò)依賴于DNA復(fù)制的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1穩(wěn)定地傳遞給子細(xì)胞。但在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期，基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平會(huì)發(fā)生劇烈的改變，改變最劇烈的階段為配子形成期與早期胚胎發(fā)育階段，甲基化模式在配子形成時(shí)已經(jīng)建立。DNA甲基化與胚胎發(fā)育 DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾，DNA甲基化在動(dòng)物胚胎和生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的重編程DNA甲基化在動(dòng)物胚胎和生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的重編程CPG island的功能：通過(guò)甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基因的表達(dá) 基因表達(dá)的調(diào)控開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)錄抑制CPG island的功能：通

6、過(guò)甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基影響基因表達(dá) 直接抑制基因表達(dá)或甲基化的 CpG雙核苷酸序列可被甲基結(jié)合蛋白家族 識(shí)別，而后者可通過(guò)吸引補(bǔ)充組蛋白去乙酞化酶和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶等組蛋白修飾蛋白質(zhì)來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)的活性 ，以間接方式影響基因表達(dá)。影響基因表達(dá) 直接抑制基因表達(dá)或甲基化的 Cp IAP: intracisternal A particle去甲基化：灰鼠基因（agouti）僅微量表達(dá)甲基化：基因超量表達(dá)特征性表型基因的表達(dá) IAP: intracisternal A partX染色體的失活X染色體的失活（X-inactivation ）：生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，雌性哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞中的兩條X染色體其

7、中一條失去活性的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)失活的染色體上DNA序列都呈高度甲基化，導(dǎo)致絕大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄處于關(guān)閉狀態(tài)。避免因擁有兩條X染色體而產(chǎn)生雙倍 基因產(chǎn)物，保持和雄性動(dòng)物X染色體 數(shù)量及功能上的一致性。X染色體的失活X染色體的失活（X-inactivation 基因組印記？組織或細(xì)胞中，基因的表達(dá)具有親本選擇性，即只有一個(gè)親本的等位基因表達(dá)，而另一親本的等位基因不表達(dá)或很少表達(dá)的現(xiàn)象，相應(yīng)的基因則稱為印記基因。父系不表達(dá)稱父系印記母系不表達(dá)稱母系印記基因印記基因組印記？組織或細(xì)胞中，基因的表達(dá)具有親本選擇性，即只有一差異甲基化區(qū)域 差異甲基化區(qū)域(differentially methylated r

8、egion，DMR)，是指染色體上甲基化狀態(tài)具有親本特異性的區(qū)域，即來(lái)源于不同親本的DNA序列甲基化狀態(tài)不同的區(qū)域 差異甲基化主要發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū)，少數(shù)在外顯子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的印記基因大多數(shù)具有DMR或受DMR調(diào)控。差異甲基化區(qū)域 差異甲基化區(qū)域(differentially堿基C T突變堿基突變 甲基化 突變堿基C T突變堿基突變 腫瘤細(xì)胞發(fā)生時(shí)常出現(xiàn)DNA甲基化模式的變化，主要包括甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的提高、基因組整體甲基化水平的降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，如染色質(zhì)構(gòu)象異常、轉(zhuǎn)座子激活、原癌基因激活表達(dá)以及抑癌基因被抑制表達(dá)等。DNA甲基化與腫瘤 腫瘤細(xì)胞

9、發(fā)生時(shí)常出現(xiàn)DNA甲基化模式的變化，目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)33目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)A基因組甲基化水平(Methylation Content)的分析高效液相色譜高效毛細(xì)管電泳法B候選基因(Candidate Gene)甲基化分析 甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法重亞硫酸鹽測(cè)序法甲基化特異性的PCR甲基化熒光法(MethyLight)焦磷酸測(cè)序 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)A基因組甲基化水平(Methylation ContentC. 基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜分

10、析 限制性標(biāo)記基因組掃描 甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增 甲基化CpG島擴(kuò)增 差異甲基化雜交 由連接子介導(dǎo)PCR出的HpaII小片斷富集分析 甲基化DNA免疫沉淀法 C. 基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜分析 高效液相色譜法高效液相色譜法直接測(cè)序法直接測(cè)序法焦磷酸測(cè)序法 通過(guò)檢測(cè)CpG對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上C/T滲入的比例對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化程度進(jìn)行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。焦磷酸測(cè)序法 通過(guò)檢測(cè)CpG對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上C全基因組甲基化圖譜全基因組甲基化測(cè)序（WGBS）全基因組甲基化圖譜全基因組甲基化測(cè)序（WGBS）芯片平臺(tái) Illumina 850K芯片可檢測(cè)人全基因組約853,307個(gè)CpG位點(diǎn)的甲

11、基化狀態(tài)。850K芯片不但保持了對(duì)CpG島，基因啟動(dòng)子區(qū)的全面覆蓋，還特別加強(qiáng)了增強(qiáng)子區(qū)以及基因編碼區(qū)的探針覆蓋。廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞研究、腫瘤和其他復(fù)雜疾病研究，是目前最適合表觀基因組全關(guān)聯(lián)分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。 Illumina 850K芯片技術(shù)流程芯片平臺(tái) Illumina 850K芯片可檢測(cè)DNA甲基化和臨床應(yīng)用培訓(xùn)課件目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)33目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)正常生物DNA甲基化DNA甲基化始發(fā)于胚胎早期，隨著組織細(xì)胞分化發(fā)育，基因組DNA經(jīng)歷了去甲基化、區(qū)域性的重新甲基化以及組織特異基因

12、選擇性的去甲基化的過(guò)程。最后，這種DNA甲基化模式就相對(duì)穩(wěn)定下來(lái)。正常生物DNA甲基化DNA甲基化始發(fā)于胚胎早期，隨著組織細(xì)胞腫瘤組織的DNA甲基化腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變，其特點(diǎn)是總體的甲基化水平降低與局部的甲基化水平升高。腫瘤細(xì)胞的特征：癌基因 低甲基化 被激活抑癌基因 高甲基化 被沉默腫瘤組織的DNA甲基化腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變，DNA甲基化和臨床應(yīng)用培訓(xùn)課件應(yīng)用前景1-腫瘤的早期診斷抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早期就發(fā)生而且一直進(jìn)行的，導(dǎo)致惡性腫瘤表型的表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：DNA甲基化檢測(cè)具有早期、無(wú)創(chuàng)、快捷、靈敏度高等特點(diǎn)。（血液、粘膜上皮標(biāo)本）缺點(diǎn)：特異性不足應(yīng)用

13、前景1-腫瘤的早期診斷抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記開(kāi)發(fā) 2017年3月，張鹍教授團(tuán)隊(duì)在Nature Genetics（NG）雜志發(fā)布了令人振奮的研究成果，利用更靈敏的算法配合組織甲基化模式開(kāi)發(fā)的無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)，可以檢測(cè)并定位腫瘤。通過(guò)比較腫瘤和正常細(xì)胞的DNA甲基化數(shù)據(jù)找到腫瘤特異的甲基化Marker。表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記開(kāi)發(fā) 2017年3月，張鹍 燃石醫(yī)學(xué)自主研發(fā)了無(wú)創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)(MERMAID)，運(yùn)用多層級(jí)甲基化探針設(shè)計(jì)策略，可實(shí)現(xiàn)在檢測(cè)成本可控的情況下同時(shí)檢測(cè)超過(guò)10萬(wàn)個(gè)臨床診斷相關(guān)的甲基化CpG位點(diǎn)，并通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法建立分類(lèi)模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)樣本自動(dòng)分型。 cfD

14、NA無(wú)創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)(MERMAID) 用于肺部占位病變（含肺癌）的早篩可實(shí)現(xiàn)99.6%的敏感性和100%的特異性，用于肺部結(jié)節(jié)良惡性判定可實(shí)84.8%的敏感性和87.5%的特異性。cfDNA甲基化液體活檢技術(shù) 燃石醫(yī)學(xué)自主研發(fā)了無(wú)創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)(ME應(yīng)用前景2-腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子口腔鱗狀細(xì)胞癌時(shí)存在RECK基因甲基化的患者復(fù)發(fā)率明顯增高甲基化影響生存期膀胱癌中APC、GSTP1和TIG1基因發(fā)生異常甲基化時(shí)，患者存活時(shí)間明顯縮短LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene predicts poor prognosis in o

15、ral squamous cell carcinomas J . Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058.ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cell - Free Serum DNA Indicates Worse Outcome in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.應(yīng)用前景2-腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子口腔鱗狀細(xì)胞癌時(shí)存在RE應(yīng)用前景3-腫瘤的去甲基化治療 DNA甲基化程度依賴于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3啟動(dòng)CpG核苷酸從頭甲基化的保證，而DNMT3則使甲基化水平穩(wěn)定在正常需要水平（去甲基化） 抑制DNMT活性藥物是治療腫瘤的新希望應(yīng)用前景3-腫瘤的去甲基化治療 DNA甲基化程度依賴于DN優(yōu)點(diǎn)：新型抗腫瘤藥物缺點(diǎn)：無(wú)基因特異性,不能選擇性地活化沉默的目的基因，從而會(huì)引起整體的低甲基化; 藥物的活化作用可逆，療效依賴于藥物的持續(xù)存在;大劑量應(yīng)用時(shí)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞有毒副作用 是否會(huì)誘發(fā)第二腫瘤？應(yīng)用前景3-腫瘤的去甲基化治療優(yōu)點(diǎn)：新型抗腫瘤藥物 是否會(huì)誘發(fā)第二腫瘤？應(yīng)用前景3-腫