免疫組化技術(shù)課件

1、免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)四大常用基本技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）免疫組織化學(xué)技術(shù)（免疫組化）免疫印跡技術(shù)（Western blot）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)局限性 聯(lián)合應(yīng)用免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)四大常用基本技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄-四大常用基本技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）免疫組織化學(xué)技術(shù)（免疫組化）免疫印跡技術(shù)（Western blot）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)局限性 聯(lián)合應(yīng)用四大常用基本技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）局限性 免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組化 免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織

2、細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)?？乖╝ntigen）：蛋白質(zhì)具有抗原性?？贵w（antibody） ：能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白Immunoglobin（Ig）。 免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組化 免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)免疫組化技術(shù)的分類 按標(biāo)記物質(zhì)的種類 如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。按染色步驟 可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。免疫組化技術(shù)的分類 按標(biāo)記物質(zhì)的種類基本

3、原理抗原一抗+二抗標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物一抗基本原理抗原一抗+二抗標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物一抗 免疫組化的全過程抗原的提取 與純化免疫動物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體及純化標(biāo)記物與抗體集合形成標(biāo)記抗體 標(biāo)本的 處理抗原抗體反應(yīng)和呈色反應(yīng)顯微鏡下 觀察結(jié)果 免疫組化的全過程抗原的提取 與純化免疫動物或細(xì)胞融合，常用標(biāo)本的獲得組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片常用標(biāo)本的獲得組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類免疫組化對組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求 ：保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)； 在原位最大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。 各種抗原由于

4、其含量及特性的差異對標(biāo)本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用于本實驗的最佳方法。 標(biāo)本的處理免疫組化對組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求 ： 標(biāo)本的處理 標(biāo)本的獲得標(biāo)本新鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴(yán)重彌散。 取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成自身對照。 避開壞死區(qū)：細(xì)胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。 標(biāo)本的獲得標(biāo)本新鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行，超過2h，組織將有標(biāo)本的固定與保存目的：使組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性

5、酶反應(yīng)，防止組織自溶或異溶，以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)； 對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免在染色和反復(fù)清洗的過程中抗原失活或彌散。好的固定劑：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物質(zhì)擴(kuò)散（3）固定后的抗原能被抗體識別，不影響抗原抗體反應(yīng)標(biāo)本的固定與保存目的：好的固定劑：常用固定劑常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點。 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） 醇類（常用乙醇） 其它 （丙酮） 常用固定劑常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。常用固定劑甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣 原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。 優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，

6、且穿透性強(qiáng)，組織收縮少。 缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙；分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘娜旧Y(jié)果。 常用固定劑甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣 原理：形成分子間的交聯(lián)常用固定劑組織塊不宜過厚?？s短固定時間。降低固定溫度。 改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10甲醛固定液，減少固定液pH的變化。 固定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。 切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預(yù)處理使抗原再現(xiàn)(抗原修復(fù))。常用固定劑常用

7、固定劑多聚甲醛(常用4%)： 用于免疫熒光染色。 主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。 常用固定劑多聚甲醛(常用4%)： 戊二醛： 穿透性強(qiáng)，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。常用固定劑戊二醛： 穿透性強(qiáng)，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，但對抗原有一定影響，常常用固定劑乙醇（最常用）原理：使細(xì)胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。 優(yōu)點：穿透性強(qiáng)、抗原性保存好。 缺點： 脫水性強(qiáng)，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))。 乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時

8、間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度。常用固定劑乙醇（最常用）原理：使細(xì)胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。常用固定劑丙酮： 對抗原性的保存好，但脫水性更強(qiáng)，較少 用于組織標(biāo)本。常用固定劑丙酮： 對抗原性的保存好，但脫水性更強(qiáng)，較少 用 冰凍切片和石蠟切片是免疫組化中最常用的制片方法。冰凍切片制片方法簡單較好的保存組織的抗原免疫活性，避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟造成的抗原損失。細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗原彌散切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮組織學(xué)切片制作 冰凍切片和石蠟切片是免疫組化中最常用的制片方法。組織學(xué)切片石蠟切片：觀察組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理想方法較好的保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)切片

9、有連續(xù)性長期存檔，供回顧性研究由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好?？乖谋４媪坎蝗绫鶅銮衅?。組織學(xué)切片制作石蠟切片：觀察組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理想方法組織學(xué)切片制作抗原修復(fù)化學(xué)方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶加熱方法 水浴加熱法 微波照射法 高壓加熱法 抗原修復(fù)化學(xué)方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶抗原修復(fù)化學(xué)方法 :主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。 胰蛋白酶：主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示；-：一般使用濃度為0.050.1，消化時間為37 度1040min， 胃蛋白酶：主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。一

10、般使用濃度為0.1%0.4，消化時間為37 度30180min， 例如：Laminin、CollagenIV 抗原修復(fù)化學(xué)方法 :主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露抗原修復(fù)水浴加熱法 ：將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)1015分鐘。 優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟(jì)，適用于所有的實驗室， 缺點：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。 抗原修復(fù)水浴加熱法 ：將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱抗原修復(fù)微波照射法 ：將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱至95以上，持續(xù)l015分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進(jìn)行。 優(yōu)點：此方法由于微波場內(nèi)極性分子、離子高速運(yùn)動，撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈，

11、使抗原異常的構(gòu)想恢復(fù)正常，且因分子運(yùn)動產(chǎn)熱、效率高、時間短，對抗原再現(xiàn)效果好。 抗原修復(fù)微波照射法 ：將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，置微抗原修復(fù) 高壓加熱法暴露抗原 ：將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi)，置高壓鍋中高壓 23min，可取得極好的效果。 優(yōu)點：由于高壓下受熱均勻，特別適用于大批量標(biāo)本的染色。 應(yīng)用于一些較難修復(fù)的抗原。 Mart-1抗原修復(fù)前 抗原修復(fù)后抗原修復(fù) 高壓加熱法暴露抗原 ：將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi)，置高抗原修復(fù)加熱法的注意事項 ：達(dá)到規(guī)定的溫度(9295 C以上) 維持一定的時間； 避免切片干涸 (抗原可能完全丟失)； 加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻2030分鐘，使未折疊的蛋白分子

12、鏈恢復(fù)天然構(gòu)型； 修復(fù)液：最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液； 抗原修復(fù)加熱法的注意事項 ： 抗體的結(jié)構(gòu)：每個抗體都含有兩個較小的 蛋白質(zhì) （輕鏈）和兩個較大的蛋白質(zhì)（重鏈）。組成 抗體 的這四個蛋白質(zhì)通過二硫鍵（ S-S ）結(jié)合在一起。 Fab（fragment antigen binding）：該端是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位 Fc（fragment crystalline）：是免疫球蛋白的羧基端，因其純化時呈結(jié)晶狀態(tài)而得名，該片斷與特異性的識別抗原有關(guān)。TissueAgAgFabFc抗體 抗體的結(jié)構(gòu)：TissueAgAgFabFc抗體抗體的分類多克隆抗體：多克隆抗體

13、是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。常用的多克隆抗體一般在兔身上產(chǎn)生，國外產(chǎn)品目錄上常以RaH（rabbit against human）表示。單克隆抗體：單克隆抗體是一個B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備。小鼠抗人的抗體常以MaH（mouse against human）表示?？贵w的分類多克隆抗體：多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物抗體的選擇（一抗）單克隆抗體：針對某一抗原決定簇，由單一淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。多克隆抗體：多株B細(xì)胞針對多個抗原決定簇產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體的特異性更強(qiáng)，多克隆抗體的敏感性

14、更高。如何使用二者完全取決于使用者的目的。弄清一抗的動物來源對后續(xù)二抗的選擇至關(guān)重要?？贵w的選擇（一抗）單克隆抗體：針對某一抗原決定簇，由單一淋巴一抗的獲得商品化一抗：Millipore、Cell Signaling、 Abcam、Santa Cruz 等。自己制備或定制 一抗的獲得商品化一抗：Millipore、Cell Sign抗體的標(biāo)記（二抗）在抗體上用化學(xué)方法連接某種標(biāo)記物，目的是使抗原抗體的結(jié)合能用肉眼觀察到。熒光素異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（TRITC）酶辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（ALP）重金屬膠體金抗體的標(biāo)記（二抗）在抗體上用化學(xué)方法連接某種標(biāo)記物，目的是使常

15、用的染色方法根據(jù)標(biāo)記物的不同：免疫熒光法免疫酶標(biāo)法親和組織化學(xué)法以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用（ABC法）?？乖豢苟钩Ｓ玫娜旧椒ǜ鶕?jù)標(biāo)記物的不同：抗原一抗二抗常用的染色方法 免疫熒光法:最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。 基本原理：它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。 優(yōu)點：

16、由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應(yīng)用較廣。常用的染色方法 免疫熒光法:最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。 熒光素 作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物FluorochromeExcitation (nm)Emission (nm)ColorDAPI365420BlueFluorescein495525GreenHoechts 33258360470BlueR-phycocyanin555, 618634RedB-phycoerythrin545, 565575Orange, redR-phycoerythrin480, 545, 565578Orang

17、e, redRhodamine552570RedTexas red596620Red 熒光素 FluorochromeExcitation 熒光顯微鏡短波長的激發(fā)光激發(fā)出長波長的熒光。紫外線 藍(lán)光藍(lán)光 綠光綠光 紅光熒光顯微鏡短波長的激發(fā)光激發(fā)出長波長的熒光。免疫熒光染色免疫熒光染色免疫熒光雙標(biāo)染色免疫熒光雙標(biāo)染色熒光顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡熒光顯微鏡：X光片效果激光共聚焦顯微鏡：CT效果 用于目的蛋白的精確細(xì)胞內(nèi)定位分析熒光顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡熒光顯微鏡：X光片效果常用的染色方法免疫酶標(biāo)方法：繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術(shù)。 基本原理：先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶

18、的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。 優(yōu)點：定位準(zhǔn)確，對比度好，染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。 目前在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測系統(tǒng)等。常用的染色方法免疫酶標(biāo)方法：繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來常用的標(biāo)記酶及其顯色底物 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)： DAB或AEC顯色系統(tǒng) （結(jié)果染為棕黃色）堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)： NBT/BCIP（結(jié)果染為藍(lán)黑色） 常用的標(biāo)記酶及其顯色底物 DAB

19、顯色辣根過氧化物酶（HRP）+DAB溶液=棕黃色產(chǎn)物DAB顯色辣根過氧化物酶（HRP）+DAB溶液=棕黃色產(chǎn)物ABC法（avidin-biotin complex親和素-生物素法）： 組成： 一抗、生物素化的二抗、ABC復(fù)合物（親和素+酶標(biāo)生物素）生物素(biotin)又稱維生素H，是一種小分子維生素，分子量為244，是轉(zhuǎn)氨甲?；^程中的輔酶。 抗生物素(avidin)，又稱卵白素或親和素，是一種分子量為67000的堿性蛋白，對生物素具有很強(qiáng)的親和力，比抗原抗體間的親和力要高出100萬倍。它由4個亞基組成，每個亞基都有生物素的結(jié)合位點。 兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等

20、多種示蹤物所標(biāo)記，形成生物素-抗生物素系統(tǒng)。 ABC復(fù)合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將其與過量的抗生物素反應(yīng)而制備的。ABC法（avidin-biotin complex親和素- 優(yōu)點： 親和素-生物素復(fù)合物是一個三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體連接一抗，一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級放大，從而提高生物反應(yīng)的敏感性和特異性。生物素和親和素有很強(qiáng)的親和力，比抗原-抗體的親和力要高一萬倍以上。 優(yōu)點：免疫膠體金技術(shù)：以特殊的金屬顆粒膠體金作為標(biāo)記物?；驹恚耗z體金是金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體

21、金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。優(yōu)點：由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。常用的染色方法免疫膠體金技術(shù)：以特殊的金屬顆粒膠體金作為標(biāo)記物。常用的染色背景染色免疫組化中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性染色。常出現(xiàn)在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處，壞死組織及固定不良的組織中心處。表現(xiàn)為彌漫性，均勻性的背景染色。也可以是隨機(jī)分布的陽性反應(yīng)產(chǎn)物點、團(tuán)或塊狀。背景染色免疫組化中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性染

22、Cub ilin分布于近端小管的刷狀緣和近官腔面, 而在遠(yuǎn)端小管和細(xì)段及集合管上無分布。遠(yuǎn)端小管有背景, 淡棕黃色( 圖1、2)。組織上無背景, 遠(yuǎn)端小管胞質(zhì)為淡藍(lán)色（圖3、4）Cub ilin分布于近端小管的刷狀緣和近官腔面, 而在遠(yuǎn)端Ig與Fc受體結(jié)合 ：多見于冰凍切片（特別是淋巴造血組織，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，組織細(xì)胞表面多），主要是和二抗反應(yīng)，因為一抗一般稀釋度均較大，因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體，所以石蠟切片不多見。二抗與組織中的Ig結(jié)合：如羊抗兔的二抗，二抗可以標(biāo)本中（人）Ig發(fā)生交叉反應(yīng)，科學(xué)上越接近的動物，交叉反應(yīng)越明顯，如人與猴，兔與豚鼠

23、。背景染色的原因Ig與Fc受體結(jié)合 ：多見于冰凍切片（特別是淋巴造血組織，淋靜電吸附 抗體是一種帶負(fù)電荷的球蛋白，容易和帶正電荷的組織相結(jié)合，如膠原纖維。組織中殘存醛基與Ig的結(jié)合內(nèi)源性過氧化物酶背景染色的原因內(nèi)源性HRP:3% H2O2 /甲醇室溫20分鐘內(nèi)源性ALP:左旋米唑靜電吸附 抗體是一種帶負(fù)電荷的球蛋白，容易和帶正電荷的組織縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。非特異性組分與抗體結(jié)合，延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果。必要時也可采用2-5%的BSA封閉，減少非特異性染色。適當(dāng)增加PBS沖洗次數(shù)

24、和浸洗時間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要阻斷背景染色縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制阻斷背景染色內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 縮短DAB孵育時間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等； 防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。阻斷背景染色內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞設(shè)立對照組對照的設(shè)置： 免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對照，判斷染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測抗體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，沒有對照的免疫組化結(jié)果是毫無意義的。 陽性對照：應(yīng)呈陽性結(jié)果，說

25、明本次實驗操作無問題。陰性對照：常用PBS代替一抗，實驗結(jié)果為陰性，用以排除假陽性結(jié)果。設(shè)立對照組對照的設(shè)置：空白對照/陰性對照：第一抗體由PBS取代。 替代對照：與第一抗體同種動物的非免疫性的正常血清代替第一抗體結(jié)果為 陰性。如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對照中用非 免疫性的正常IgG血清來替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行對照 。 陽性對照：用已知含有要檢測抗原的切片作陽性對照。 自身對照：在同一切片上，將不同組織成分中的陽性或陰性結(jié)果與檢測的目的物對照比較。如果應(yīng)為陽性的組織是陽性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問題或免疫試劑質(zhì)量有問題。 設(shè)立對照組空白對照/陰

26、性對照：第一抗體由PBS取代。 設(shè)立對照組免疫組化技術(shù)課件免疫組化結(jié)果分析 陽性著色細(xì)胞計數(shù)法：在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個視野，人工或機(jī)器計數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組36張不同動物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。免疫組化結(jié)果分析 陽性著色細(xì)胞計數(shù)法：在40*光鏡下，免疫組化技術(shù)課件灰密度分析法：通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用Image pro plus進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計分析即可。注意：所有的照片必須以同樣的顯微鏡環(huán)境與拍攝條件來拍攝。在更換視野或切片時，除了對焦距這個操作外，其他所有的操作都不能有變化。強(qiáng)陽性的樣品就是暗的黃的，弱陽性的樣品則亮一些

27、，陰性樣品就是一片白。免疫組化結(jié)果分析灰密度分析法：通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域曝光的選擇：試拍攝一張空照片，看一下白色背景的亮度，應(yīng)該在附近。過低過高都不好。注意相機(jī)白平衡：如果使用的是專業(yè)CCD相機(jī)，會有校正白平衡的功能，此時應(yīng)對空視野進(jìn)行白平衡校正。很多顯微鏡都是同時有熒光附件的，在拍攝熒光照片時要加上濾光片，注意有時候這些濾光片會忘了移開，結(jié)果拍攝的照片就會嚴(yán)重偏色。曝光的選擇：試拍攝一張空照片，看一下白色背景的亮度，應(yīng)該在評分法：通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進(jìn)行評分（14分為025%、2650%、5

28、175%、76100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。免疫組化結(jié)果分析評分法：通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（03分相對定量分析相同曝光時間、相同顯色時間大體分為陰性、弱陽性、陽性BDCAEFGHNormal相對定量分析相同曝光時間、相同顯色時間BDCAEFGH原因解決辦法抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵育時間：室溫1小時或4過夜 孵育溫度過高，孵育溫度超過37一般室溫20-28 DAB顯色時間過長或DAB濃度過高顯色時間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)染色過強(qiáng)免疫組化常見問題原因解決辦法抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長降低抗體滴度（

29、染色弱原因解決辦法抗體濃度過低，孵育時間過短提高抗體濃度，孵育時間不能少于60分鐘試劑超過有效使用期及時更換試劑操作中，滴加試劑時緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）室溫太低，低于15若室溫低于15度，要改放在37孵育箱孵育30-60分鐘（或4冰箱過夜）蛋白封閉過度封閉時間不要超過10分鐘免疫組化常見問題染色弱原因解決辦法抗體濃度過低，孵育時間過短提高抗體濃度，孵免疫組化常見問題染色陰性原因解決辦法 操作步驟錯誤重新試驗，設(shè)立陽性對照 組織中無抗原設(shè)立陽性對照片，以驗證實驗結(jié)果 一抗與二抗種屬連接錯誤仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無誤 免疫組化常見問題染色陰

30、性原因解決辦法 操作步驟錯誤重新試驗，非特異性背景染色原因解決辦法操作過程中沖洗不充分每步?jīng)_洗35 組織中含過氧化物酶未阻斷可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時間延長 組織中含內(nèi)源性生物素正常非免疫動物血清再封閉 血清蛋白封閉不充分延長血清蛋白封閉時間 免疫組化常見問題非特異性背景染色原因解決辦法操作過程中沖洗不充分每步?jīng)_洗3特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性敏感性高定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合。免疫組化特點特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特免疫組化應(yīng)用用途: 對目的蛋白進(jìn)行定性、定位和定量分析。優(yōu)點：能夠明確目的蛋白的細(xì)胞定位、亞細(xì)胞定

31、位及多種蛋白之間的相互位置關(guān)系局限性：敏感性差，蛋白定量效果差。 免疫組化應(yīng)用用途:1975 年，Southern 建立了將DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC 膜）上，并利用DNARNA 雜交檢測特定的DNA 片段的方法，稱為Southern 印跡法。人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。免疫印跡技術(shù)（Western blot）1975 年，Southern 建立了將DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖免疫印跡技術(shù)（Western blot

32、） 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryamide gel electrophoresis，簡稱PAGE）分離樣品中不同的蛋白質(zhì)組分，利用電轉(zhuǎn)移法將電泳分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物，然后用免疫學(xué)原理來檢測目的蛋白質(zhì)。免疫印跡技術(shù)（Western blot） 通過聚丙烯酰胺工作流程制備蛋白樣品SDS轉(zhuǎn)膜：NC,PVDF免疫學(xué)檢測封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色/發(fā)光工作流程制備蛋白樣品封閉蛋白樣品的獲得來源：組織、細(xì)胞注意事項：避免蛋白降解 a. 新鮮組織 b. 低溫下操作 c. 蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制劑（cocktail) d. -70保存，盡量短期內(nèi)使用蛋白樣品的獲得來源：組織

33、、細(xì)胞蛋白樣品處理測定樣品濃度蛋白變性：電泳樣品要經(jīng)過高溫處理，其目的將SDS 與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。加入溴酚藍(lán)染料，溴酚藍(lán)指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時，即可停止電泳。蛋白樣品處理SDS聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。PAGE電泳體系中加入SDS-SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr）丙烯酰胺(簡稱Acr）N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱

34、Bis）TEMED過硫酸胺（AP）SDSTris-甘氨酸電泳緩沖液SDS丙烯酰胺(簡稱Acr）SDSAcr和Bis單獨(dú)存在或混合在一起時是穩(wěn)定的，但在自由基存在時就會發(fā)生聚合反應(yīng)形成凝膠。引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有化學(xué)和光聚合兩種方法。 1）化學(xué)聚合 常用的催化劑系統(tǒng)有： （1）過硫酸胺（AP）TEMED(四甲基乙二胺)； （2）過硫酸胺DMPN(二甲基氨基丙腈)； （3）過硫酸胺三乙醇胺。 2）光聚合 由光敏物質(zhì)核黃素代替過硫酸銨作催化劑。 Acr和Bis單獨(dú)存在或混合在一起時是穩(wěn)定的，但在自由基存在SDS陰離子表面活性劑，能夠使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)上，使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)

35、合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。此時蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其分子量大小。因此可以利用SDS測定蛋白質(zhì)分子量。SDSSDS電泳體系電泳體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠組成。 濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為 pH6.8的Tris-HCl。 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為 pH8.8 Tris-HCl。 電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。 SDS電泳體系電泳體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠不連續(xù)電泳： 作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-

36、Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：pH8.3 Tris-甘氨酸系統(tǒng)。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值形成了凝 膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性 樣品濃縮的主要因素。 不連續(xù)電泳： 作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃濃縮膠：大孔膠在濃縮膠中 HCl幾乎全部解離為Cl-，但只有極少部分甘氨酸解離為H2NCH2COO-。效泳動率依次為Cl-蛋白質(zhì)H2NCH2COO-由于蛋白質(zhì)的有效移動率恰好介于快慢離子之間，因此蛋白質(zhì)離子就集聚在快慢離子之間被濃縮成條狹窄帶。這種濃縮效應(yīng)可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。濃縮膠：大孔膠分離膠：小孔膠由于

37、聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會根據(jù)其各自分子量的大小而被分離分離膠：小孔膠凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)15Staking gelSeparating gelStaking gelSeparating gel濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。轉(zhuǎn)膜濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是半干轉(zhuǎn)移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。因為電極板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場強(qiáng)度盡可能大以快速高效轉(zhuǎn)移。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法又快（15-45 分鐘）又好。半干轉(zhuǎn)移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。因為電極板直接與兩種轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中都必須注意防止在濾紙、凝膠和膜之間的任何地方存在氣泡小分子量的蛋白半干轉(zhuǎn)效果比較好，大分子量（100KD以上）建議濕轉(zhuǎn)。 根據(jù)目的蛋白的分子量決定轉(zhuǎn)膜時間。半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，濾紙和膜切成與凝膠相同大小很重要，這樣電流必須通過凝膠。否則，在凝膠邊緣處濾紙重疊將導(dǎo)致電流短路。注意兩種轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中都必須注意