藥分第四章課件

1、藥物分析第五章 體內(nèi)藥物分析Company Logo第五章 體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析定義體內(nèi)藥物分析是指體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定量分析。Company Logo第五章 體內(nèi)藥物分析分析意義與體內(nèi)藥代動力學研究和臨床治療藥物監(jiān)測密切相關(guān)，直接關(guān)系到藥物的體內(nèi)作用機制探討與質(zhì)量評價和藥物臨床使用的安全、有效與合理。Company Logo第五章 體內(nèi)藥物分析分析樣品種類血液尿液唾液頭發(fā)臟器組織其它特殊樣品?Company Logo第五章 體內(nèi)藥物分析分析目標藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性,它們在體內(nèi)的變化規(guī)律對母體藥物的藥理學與毒理學評價

2、特別重要.機體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)往往參與機體重要的生理過程,其變化規(guī)律的異常改變也與某些疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)母藥藥物特有代謝產(chǎn)物體內(nèi)內(nèi)源性生物活性物質(zhì)Company Logo分析對象Company Logo第五章 體內(nèi)藥物分析藥物在體內(nèi)的形態(tài)游離型代謝產(chǎn)物游離型原藥結(jié)合型原藥結(jié)合型代謝產(chǎn)物情形極為復雜綴合物分子間力結(jié)合化學共價結(jié)合稱為兩類Company Logo五、體內(nèi)藥物分析方法體內(nèi)樣品分析方法色譜及其聯(lián)用方法免疫學方法生物學微生物學方法HPLC, GC, HPLC-MS, HPLC-MS/MS, GC-MS, GC-MS/MS放射（RIA）熒光（FIA）酶（EIA）適合小分子及代謝物，蛋

3、白質(zhì)大分子藥物等生物大分子藥物分析抗生素分析Company Logo第一節(jié) 常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏常用樣品的種類(一)血樣:藥物在體內(nèi)主要依靠血液運輸,血藥濃度可作為藥物在作用部位濃度的指標. 血漿 (plasma) 血清 (serum) 全血(二)唾液:很少采用(三)尿液:用于藥物劑量回收、尿清除率、生物利用度，藥物代謝物及其代謝途徑、類型、速率等的研究；臨床上用于判斷患者是否違反醫(yī)囑用藥。其它：頭發(fā)、肝器組織、乳汁、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便。常用樣品的種類Company Logo2尿樣 目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度 特點：濃度高，易于收集，體內(nèi)代

4、謝研究，應水解分 離 采集方法：隨時尿、晨尿、白天尿、夜間尿等，定時采集。 貯藏:健康人排出的尿液顏色淡黃至黃褐色,pH在4.88.0之間。3唾液 唾液中藥濃與血濃相關(guān)性密切 收集方法 瀨口15min鐘后采集，離心 收集采集方法Company Logo組織采集：先取各種組織，應用勻漿器均勻化制成水性基質(zhì)勻漿液，再以適當方法萃取。組織樣品要經(jīng)過蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸沉淀。酸、堿水解：將組織水解掉酶水解：用酶將組織水解掉其它：頭發(fā)等組織樣品藥物在組織中的分布提供重要的體內(nèi)動力學過程Company Logo1血樣（血漿、血清）及時分離冷藏， -70加入穩(wěn)定 劑NaF2尿樣 尿中水、無

5、機鹽、尿素等細菌的生長， 4保存 加入防腐劑 a1%甲苯 b飽和氯仿 cpH改變3唾液：同血樣冷凍與冷藏Company Logo去活性去活性：為防止酶進一步分解體內(nèi)待測組分，采樣后必須終止酶的活性。常用方法有“液氮快速冷凍法、微波照射法、勻漿及溶淀，加酶活性阻斷劑、抗氧化劑、樣品煮沸等。Company Logo第二節(jié)、體內(nèi)樣品的前處理體內(nèi)樣品的前處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié),也是分析中最困難、最繁復的工作。請先看如下處理步驟與方法Company Logo第二節(jié) 體內(nèi)樣品分析的前處理全血/血漿，組織(1)蛋白沉淀(2)調(diào)節(jié)pH選擇性溶劑提取RIA殘渣化學衍生化(提取烴基化)堿回提酸回提HP

6、LCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS處理步驟與方法Company Logo預處理的目的使待測藥物游離滿足測定方法要求改善分析環(huán)境藥物進入體內(nèi)后有多種存在形式，進行預處理使之游離出來，便于測定藥物或代謝藥物的總濃度體內(nèi)樣品介質(zhì)組成復雜，干擾很多，而待測藥物組分濃度很低，進行預處理可以分離濃集樣品。防止儀器的污染、劣化，提高測定的靈敏度和選擇性。不同的儀器及分析方法對樣品有不同的要求，須處理。Company Logo常用體內(nèi)樣品預處理方法去除蛋白質(zhì)方法分離與富集方法微透析技術(shù)綴合物水解化學衍生化萃取如何進行？Company Logo去除蛋白質(zhì)

7、方法加入與水混融（親水性）的有機溶劑（乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃）。溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間靜電力增加而聚集；親水性溶劑使蛋白質(zhì)水化膜脫落而析出沉降，并使與蛋白質(zhì)以氫鍵及其它分子間作用力結(jié)合的藥物析釋放出來。溶劑沉淀法混比1：23，冷凍離心Company Logo去除蛋白質(zhì)方法混比1：2，冷凍離心加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)，使溶液的離子強度發(fā)生變化，部分蛋白質(zhì)的電性被中和，蛋白質(zhì)的分子間排斥力減弱而凝聚；同時中性鹽使蛋白質(zhì)水化膜脫落而析出沉降。中性鹽析法Company Logo去除蛋白質(zhì)方法熱變性蛋白質(zhì)離心煮雞蛋？熱凝固法Company Logo（1）優(yōu)點：與雜質(zhì)分離

8、簡便 濃集提取率高（2）提取率：在有機相與水相中的溶解度的比值分配系數(shù)，一般少量多次，對生物樣品一般一次萃取， 70%重現(xiàn)性分離與濃集液液萃取LLE利用藥物在有機溶劑中的溶解度大于在水中的溶解度而提取Company Logo（3）影響提取率的因素 pH 堿性藥物在堿性pH 酸性 酸性pH 提取溶劑 相似相溶原理 沸點低，不影響檢測,性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學反應(化學惰性） 離子強度 加入中性鹽 增加離子強度，與水結(jié)合強，便于有機溶劑提取 分離與濃集Company Logo對于離子性特強，水溶性極大的藥物，可采用離子對提取原理應用陰離子：COOH+ SO3H- 反離子 四丁基銨陽離子：NH2+ 反離子

9、烷基或芳基磺酸鹽提取溶劑用量:一般在試管中進行 有機相與水相比1:1到5:1分離與濃集Company Logo分離與濃集固相萃取SPE是目前使用相當廣泛的一種萃取方法，惜乎價格較貴將不同填料作為固定相裝入小柱，藥物溶液通過小柱時，藥物被吸附、分配、離子交換，或其它親和力作用，使藥物及內(nèi)源性物質(zhì)同時被保留在固定相上，再選用適當溶劑洗脫藥物的方法這方面，美國是老大Company Logo用有機溶劑(甲醇)沖洗洗凈用水沖洗活化上樣用水或緩沖液沖洗，洗去內(nèi)源性物質(zhì)有機溶劑洗脫藥物收集洗脫液固相萃取步驟Company Logo方法好價格貴Company Logo固相選擇 樣品1ml 1ml規(guī)格固相 12

10、5ml 3ml規(guī)格固相固相處理 反相C18 固定相的610倍體積甲醇洗柱，使溶劑化 610倍水緩沖服液沖洗達分離狀態(tài)上樣分離 用適當?shù)娜跞軇┫礈?洗去雜質(zhì)，通N2干燥固相洗脫待測物 改變pH或極性 固相萃取具體步驟Company Logo（1）流速 流速快，按觸不充分，樣品流失 回收率低 柱處理 510mlmin-1 洗脫 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg）（2）裝樣 過載 突破性試驗 已知濃度樣品液 小體積上柱洗脫回收百分率 加大體積洗脫回收百分率 繪圖 當回收率下降時為過載 固相萃取具體步驟Company Logo超濾分離法是以多孔半透膜（超濾膜）作為分離

11、介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)，選用不同的孔徑的不對稱膜，即可按照分子量大小進行分離適合TDM血樣分析Therapeutic drug monitoringCompany Logo綴合物的水解酶水解法酸水解法溶劑解法bookCompany Logo化學衍生法why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測的需要，因此進行衍生How for GC?硅烷化?；榛粚ΨQ化Company Logo化學衍生法why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測的需要，因此進行衍生How for LC?UVFL非對映

12、衍生化?Company Logo化學衍生法非對映衍生化?對映體：一個化合物的兩個光學異構(gòu)體，其分子在整體上互為不能重疊的鏡像。 分子量、分子式完全相同。應用普通色譜方法難以分離。通過衍生可以使之非對映化。根據(jù)構(gòu)象等理化性質(zhì)差異進行分離。Company Logo分析方法的建立方法的選擇Chromatography？immunoassay ？biology？Company Logo分析方法的建立方法建立的程序條件篩選？條件優(yōu)化？實際樣品測試？Company Logo分析方法的建立方法的驗證特異性標準曲線與定量范圍定量下限準確度與精密度穩(wěn)定性回收率分析過程的質(zhì)量控制未知樣品濃度超出范圍的處理相關(guān)物質(zhì)

13、測定其它方法驗證Company Logo第四節(jié) 體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證(一)、特異性 所測的物質(zhì)是原型藥物或特定的活性代謝物，內(nèi)源性物質(zhì)和響應的其他代謝物及其他藥物不影響樣品的測定?？瞻籽獫{空白血漿標準物質(zhì)受試血漿Company Logo第四節(jié) 體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證(二)、標準曲線與線性范圍6.412.819.225.6 3232.41.81.20.60茶堿(g/ml)Y=9.56610-2X+6.15310-3 r=0.9995至少6個濃度點建立標準曲線線性范圍必須覆蓋全部待測濃度，不得外推最低濃度點偏差在20%其余濃度點的偏差在 15%。Company Logo(三)精密度與準確

14、度(四)定量下限(五)穩(wěn)定性(六)提取回收率(七)質(zhì)控樣品(八)質(zhì)量控制(九)測定結(jié)果第四節(jié) 體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證看書了解Company Logo色譜條件優(yōu)化試劑與溶劑實驗經(jīng)化學衍生化處理時要進行此步試驗取待測藥物的非生物介質(zhì)溶液（通常為水溶液），按擬定的分析方法進行衍生化反應，萃取，分離等樣品預處理后，進樣分析以考察反應試劑對測定的干擾，通過條件優(yōu)化，使空白試劑色譜峰不干擾藥物的測定Company Logo相關(guān)術(shù)語生物介質(zhì)來源于生物的介質(zhì)，如全血，血漿，血清，尿，糞，各種組織等取空白生物介質(zhì)按照擬定的體內(nèi)樣品預處理與分析方法進行操作。生物介質(zhì)實驗色譜條件優(yōu)化Company Logo相關(guān)

15、術(shù)語取空白生物介質(zhì)按照擬定的體內(nèi)樣品預處理與分析方法進行操作。生物介質(zhì)實驗目的：用于考察生物介質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)對測定的的干擾情況。要求：在待測藥物，特定的活性代謝產(chǎn)物，內(nèi)標物質(zhì)等的信號窗口不應出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號色譜條件優(yōu)化Company Logo色譜條件優(yōu)化標準物品？在空白生物介質(zhì)中加入已知量的待測物標準物質(zhì)制成的樣品主要用于建立標準曲線，計算質(zhì)控樣品和未知樣品的濃度Company Logo色譜條件優(yōu)化質(zhì)控樣品試驗取空白生物介質(zhì)，按實際體內(nèi)樣品中藥物的預期濃度范圍，加入待測藥物的標準物質(zhì)制成標準樣品和質(zhì)控樣品，照生物介質(zhì)試驗項下的方法進行實驗，建立分析方法的定量范圍與標準曲線并進行方法學考察標

16、準物品？質(zhì)控樣品？Company Logo色譜條件優(yōu)化即QC樣品，系指在空白生物介質(zhì)中加入已知量待測藥物標準物質(zhì)制成的樣品質(zhì)控樣品？主要用于監(jiān)測生物分析方法的效能和評價每一分析批結(jié)果的完整性和正確性Company Logo色譜條件優(yōu)化標準物品？質(zhì)控樣品？相同點制備方法完全一樣Company Logo色譜條件優(yōu)化標準物品？質(zhì)控樣品？不同點應用目的不一樣Company Logo色譜條件優(yōu)化標準物品？質(zhì)控樣品？具體操作做標準曲線，及相關(guān)指標考察在分析樣品時，每分析多少個樣品進行一次質(zhì)控樣品分析，看分析方法的可靠性：控制分析質(zhì)量Company Logo色譜條件優(yōu)化具體操作實際樣品測試就是實際樣品測試，

17、類似于供試品測試；考察方法是否適合于實際樣品的測試Company Logo色譜條件優(yōu)化介質(zhì)效應樣品存在除待測物質(zhì)以外的所有其它干擾物質(zhì)對響應造成的直接或者間接影響質(zhì)控樣品池所有的質(zhì)控樣品，同未知樣品在相同條件下保存測試Company Logo色譜條件優(yōu)化未知樣品研究樣品，作為分析對象的體內(nèi)樣品制備樣品待測樣品經(jīng)過各步驟（如提取、純化、濃縮等）處理制成的、直接用于儀器分析的試樣Company Logo色譜條件優(yōu)化分析批包括未知樣品、適當數(shù)量的標準樣品和QC樣品的完整系列Company Logo液相色譜技術(shù)簡介講述原因同學們對液相色譜的相關(guān)理論認知不深，感覺抽象，給本課程學習帶來嚴重影響在本書中有

18、大量的含量測定及雜質(zhì)限量方法會用到液相色譜方法希望給同學們今后從事藥物分析工作，讀研、讀博從事藥學研究提供一定的幫助Company Logo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜定義Company Logo液相色譜技術(shù)簡介氣、液相色譜區(qū)別Company Logo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜的結(jié)構(gòu)與原理Company Logo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜的結(jié)構(gòu)高壓輸液系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)進樣系統(tǒng)Company Logo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜的分離系統(tǒng)Company Logo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜的基本概念固定相：固定相是色譜的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在色譜過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱色譜中一般稱為洗脫劑，薄層色譜時稱為展層劑。 Company Logo分配系數(shù) 可由Langmuir方程得出 Kd-分配系數(shù) q、c-溶質(zhì)在固相和液相中的濃度Company Logo保留時間（tR）和保留體積（VR） 反應樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜