指紋圖譜課件

1、中藥指紋圖譜構(gòu)建及質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù) 姓名：曹瑞致 學(xué)號(hào)：2015051655專(zhuān)業(yè)：中藥學(xué)制定特征中藥指紋是質(zhì)量控制的有效途徑，是保證中藥安全有效的中藥環(huán)節(jié) 中藥指紋圖譜制定的兩個(gè)步驟1.中藥指紋圖譜的構(gòu)建初級(jí)中藥指紋圖譜即常見(jiàn)的中藥質(zhì)量控制方法，是以保證中藥的品質(zhì)為目的。重點(diǎn)是測(cè)定方法的建立、有效成分和控制指標(biāo)的確定高級(jí)階段的指紋圖譜研究多采用多儀器連用，如GC-MS（氣象色譜-質(zhì)譜連用）、LC-MS（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）等方式，獲取多維信息數(shù)據(jù)，尋找最佳藥效相關(guān)指紋圖譜，指導(dǎo)實(shí)踐，從而保證藥品最終品質(zhì)中藥起藥效的是有效物質(zhì)群在發(fā)揮作用，不同的配伍將引起有效物質(zhì)群的該變。這種群體的變化可通過(guò)指紋圖

2、譜這種形式反映或表現(xiàn)出來(lái)?？刂坪弥讣y圖譜就可以獲得良好的藥效、穩(wěn)定的質(zhì)量和最佳的生物利用度。 中藥指紋圖譜的構(gòu)建原則：構(gòu)建指紋圖譜的主要步驟指紋圖譜構(gòu)效質(zhì)量穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果方法學(xué)考察：重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、精密度質(zhì)量穩(wěn)定性評(píng)價(jià)對(duì)應(yīng)關(guān)系預(yù)處理（提取分離）色譜分析計(jì)算機(jī)圖譜解析、處理指紋圖譜構(gòu)建程序紫外光譜法（UV） 紫外光譜法，是測(cè)定物質(zhì)分子在紫外光區(qū)吸收光譜的分析方法。紫外吸收光譜是物質(zhì)吸收紫外光后，其價(jià)電子從低能級(jí)向高能級(jí)躍遷，產(chǎn)生吸收峰形成的。并非所有的有機(jī)物質(zhì)在紫外光區(qū)都有吸收，只有那些具有共軛雙鍵（鍵）的化合物，其電子易于被激發(fā)發(fā)生躍遷，在紫外光區(qū)形成特征性的吸收峰。 主要用于化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

3、和含量的測(cè)定。由于中藥所含成分的不飽和度是有區(qū)別的，其紫外吸收曲線(xiàn)形狀、峰位、峰強(qiáng)均有所不同，因此可以用來(lái)鑒別藥材。但紫外光譜是電子光譜，形狀變化不大，有時(shí)不同的化合物有相似的圖譜，專(zhuān)屬性差。故紫外光譜較少的應(yīng)用于指紋圖譜。苯的紫外光譜紅外光譜法（IR） 在有機(jī)物分子中，組成化學(xué)鍵或官能團(tuán)的原子處于不斷振動(dòng)的狀態(tài)，其振動(dòng)頻率與紅外光的振動(dòng)頻率相當(dāng)。所以，用紅外光照射有機(jī)物分子時(shí)，分子中的化學(xué)鍵或官能團(tuán)可發(fā)生振動(dòng)吸收，不同的化學(xué)鍵或官能團(tuán)吸收頻率不同，在紅外光譜上將處于不同位置，從而可獲得分子中含有何種化學(xué)鍵或官能團(tuán)的信息。 對(duì)單一組分或混合物中各組分也可以進(jìn)行定量分析，尤其是對(duì)一些較難分離并在

4、紫外區(qū)、可見(jiàn)區(qū)找不到明顯特征峰的樣品，可以方便、迅速的完成定量分析。 紅外光譜的優(yōu)點(diǎn)：1.指紋性 2.對(duì)樣品的要求較低 3.可操作性較強(qiáng) 紅外光譜在中藥質(zhì)量控制方面的應(yīng)用：1.中藥材質(zhì)量的監(jiān)控2.中藥材生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量的監(jiān)控3.中成藥質(zhì)量的監(jiān)控 熒光光譜分析法 （AFS） AFS的基本原理是蒸汽狀態(tài)的原子因吸收能量而躍遷至高能態(tài)，并在這個(gè)過(guò)程中發(fā)射出具有固定波長(zhǎng)的熒光。 中草藥因大多含有發(fā)光性組分而具有特征的熒光光譜。因此可利用發(fā)光標(biāo)記、被測(cè)物本身發(fā)光性質(zhì)、分子組裝、能量轉(zhuǎn)移原理等分離鑒定藥物有效成分。如中藥材的熒光鑒定、中藥注射液等的藥物鑒別、以及熒光分析及其連用技術(shù)用于測(cè)定中藥有效成分。薄層色

5、譜法(TLC) TLC是利用中藥成分性質(zhì)上的差異經(jīng)過(guò)薄層分離后相對(duì)位移值的不同進(jìn)行鑒別的一種方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單，分析速度快，成本低等優(yōu)點(diǎn)，適用于不同種類(lèi)藥材指紋圖譜的構(gòu)建。使用該方法只需要選取好薄層色譜展開(kāi)劑，分離樣品后即可獲得直觀的圖譜圖像。但是由于薄層板質(zhì)量的差異和色譜系統(tǒng)的開(kāi)放性等外界因素的影響，導(dǎo)致薄層色譜法的精確性和重現(xiàn)性比較差所以現(xiàn)在薄層色譜法的應(yīng)用較少。 高效薄層色譜法是指利用特殊材質(zhì)的薄層板和展開(kāi)技術(shù)來(lái)提高薄層色譜的靈敏度和準(zhǔn)確度，從而有效提高構(gòu)建指紋圖譜的效率。 HPLC高效液相色譜法 HPLC高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展而成的。HPLC利用了氣相色譜的理

6、論和方法。其工作原理是依據(jù)中藥中各成分在展開(kāi)劑和固定相之間分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離。HPLC受樣品本身和外界干擾的影響較小，非常適合用于中藥指紋圖譜的構(gòu)建。HPLC具有儀器化程度高、分析速度快、色譜柱可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為指紋圖譜研究的主要方法，應(yīng)用十分廣泛。高效液相色譜法有“三高一廣一快”的特點(diǎn)：1高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。2高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。3高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在L數(shù)量級(jí)。4應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可

7、用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。5分析速度快、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成，一般小于1h。 核磁共振（NMR）指紋圖譜 氫原子具有磁性，如電磁波照射氫原子核，它能通過(guò)共振吸收電磁波能量，發(fā)生躍遷。用核磁共振儀可以記錄到有關(guān)信號(hào)，處在不同環(huán)境中的氫原子因產(chǎn)生共振時(shí)吸收電磁波的頻率不同，在圖譜上出現(xiàn)的位置也不同，各種氫原子的這種差異被稱(chēng)為化學(xué)位移。利用化學(xué)位移，峰面積和積分值以及耦合常數(shù)等信息，進(jìn)而推測(cè)其在碳骨架上的位置。在核磁共振氫譜圖中，特征峰的數(shù)目反映了

8、有機(jī)分子中氫原子化學(xué)環(huán)境的種類(lèi)；不同特征峰的強(qiáng)度比（及特征峰的高度比）反映了不同化學(xué)環(huán)境氫原子的數(shù)目比。 核磁共振氫譜（HNMR）指紋圖譜鑒定中藥有其獨(dú)特的特點(diǎn)，它可以同時(shí)獲得各類(lèi)質(zhì)子化學(xué)的位移、數(shù)量、耦合關(guān)系等多個(gè)結(jié)構(gòu)信息。 據(jù)此原理進(jìn)行NMHR指紋圖譜研究時(shí)首先要選擇適當(dāng)?shù)奶崛》蛛x工藝，制備其特征總提取物，在NMHR波譜儀上測(cè)定中藥的NMHR指紋圖；對(duì)特征總提取物進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到單體化合物后，通過(guò)鑒定和NMHR研究，對(duì)指紋圖譜圖中的各個(gè)特征譜線(xiàn)進(jìn)行歸屬。從而實(shí)現(xiàn)核磁共振指紋圖譜進(jìn)行中藥質(zhì)量控制。 X射線(xiàn)衍射指紋圖譜 x射線(xiàn)的波長(zhǎng)和晶體內(nèi)部原子面之間的間距相近，晶體可以作為X射線(xiàn)的空間衍

9、射光柵，即一束X射線(xiàn)照射到物體上時(shí)，受到物體中原子的散射，每個(gè)原子都產(chǎn)生散射波，這些波互相干涉，結(jié)果就產(chǎn)生衍射。物質(zhì)組成，晶型、分子內(nèi)成鍵方式、分子的構(gòu)型等決定該物質(zhì)特有的衍生圖譜。 對(duì)中藥而言，其組成成分是固定的某些化合物，當(dāng)收到X射線(xiàn)照射后產(chǎn)生的圖譜是各混合物各組分衍射效應(yīng)的疊加。藥材質(zhì)量的穩(wěn)定，其衍射圖譜可以作為該混合物的特征圖譜。 質(zhì) 譜 法（MS） 質(zhì)譜分析是一種測(cè)量離子質(zhì)荷比（質(zhì)量-電荷比）的分析方法，其基本原理是使試樣各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分

10、別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。 中藥各成分分子在質(zhì)譜儀中被裂解為不同的碎片，其成分不同則其圖譜顯示的碎片峰也不同，因而可以鑒別化學(xué)成分。MS一般都和色譜儀連用，常見(jiàn)的有GC-MS、HPLC-MS、HPLC-UV-MS、LC-MS、HPLC-MS。5.測(cè)定方法精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)6指紋圖譜及各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)6.1共有指紋峰的標(biāo)定6.2共有指紋峰面積的比值6.3相似度計(jì)算3.中藥指紋圖譜評(píng)價(jià)技術(shù) 常見(jiàn)的中藥指紋圖譜的指標(biāo)參數(shù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)有直觀標(biāo)準(zhǔn)法、量化數(shù)據(jù)對(duì)比法、計(jì)算機(jī)圖譜解析技術(shù)等，其中計(jì)算機(jī)圖譜解析技術(shù)發(fā)展較為技術(shù)，解析的方法也比較多，如模糊信息分析法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法、聚類(lèi)分析法

11、及化學(xué)計(jì)量學(xué)等。用待測(cè)樣品與標(biāo)注圖譜的特征直接比較，但這種方法不僅要求有標(biāo)準(zhǔn)圖譜，而且標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)還要有足夠的容量，要能涵蓋大多的中藥標(biāo)準(zhǔn)圖譜。即引入指數(shù)、重疊率、八強(qiáng)峰、表觀豐度等量化數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。與直觀對(duì)比法進(jìn)行相比，此法更客觀、準(zhǔn)確。但是，面臨的問(wèn)題就是如何建立大量的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)。直觀對(duì)比量化數(shù)據(jù)對(duì)比計(jì)算機(jī)圖譜解析技術(shù)模糊信息分析法特征提取依照某種方式確定該中藥指紋特征對(duì)“真模式、假模式”的隸屬度用最大從屬原則或閥值原則確定中藥的真?zhèn)稳斯ど窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)法模擬人腦功能的全新信息處理方法，其理論是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的數(shù)學(xué)模型聚類(lèi)分析法是利用在多維空間的相對(duì)位置，將樣本分為兩個(gè)或多個(gè)集團(tuán)的算法，屬于無(wú)人管理分類(lèi)4

12、.中藥指紋圖譜研究中的關(guān)鍵問(wèn)題1.研究對(duì)象的確定在研究一個(gè)藥物的指紋圖譜時(shí)，應(yīng)該充分查閱相關(guān)文獻(xiàn)，盡可能了解藥材，中間體及其成品的組分和組分相關(guān)理化性質(zhì)，綜合分析，確定產(chǎn)品中的有效組分，并以該組份作為指紋圖譜的研究對(duì)象和監(jiān)測(cè)指標(biāo)。對(duì)于復(fù)方制劑，研究指紋圖譜時(shí)要注意按照中醫(yī)的指導(dǎo)思想，運(yùn)用辯證思維，根據(jù)“君、臣、佐、使”原則。2.研究方法的選擇 實(shí)際運(yùn)用中要按照不同藥物的特點(diǎn)選擇，最終目的就是要保 證方法的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性以及可操作性。3.研究?jī)?nèi)容 藥材、中間體、注射劑的指紋圖譜、涉及樣品的名稱(chēng)、來(lái)源、 制備、測(cè)定方法，指紋圖譜及其技術(shù)參數(shù)等研究項(xiàng)。方案設(shè)計(jì)與思路原藥材、中間體及注射劑樣品的選擇與

13、收集在做指紋圖譜研究時(shí)，原材料收集應(yīng)注意以下幾個(gè)原則原藥材、中間體及注射劑樣品的預(yù)處理原材料在預(yù)處理時(shí)要根據(jù)藥材的具體性質(zhì)和研究為目的，選擇合適的分離、純化、富集方法。中間物在進(jìn)樣時(shí)需要經(jīng)過(guò)過(guò)氧化氯柱、C18柱、硅膠預(yù)祝柱、聚酰胺柱等，以除去色素等雜質(zhì)。注射劑不需要進(jìn)行預(yù)處理指紋圖譜及其中藥參數(shù)的建立2.強(qiáng)峰（N） N值是按照實(shí)際的出峰情況而定的。首先從眾多的峰中按照面積大小選擇前N個(gè)作為強(qiáng)峰，且強(qiáng)風(fēng)總面積占整個(gè)面積的70以上；二是要根據(jù)N個(gè)強(qiáng)峰的面積大小而定，小于70應(yīng)適當(dāng)增加，大于70應(yīng)適當(dāng)減少3.特征指紋 是一系列色譜峰所組成的峰群，是生物體所特有的指紋，它反映了一種藥材與其他藥材的不同之處。特征指紋的最大用途就是鑒別品種，還能夠?yàn)橹兴幩幬兜蔫b定提供依據(jù)。但特征指紋要隨著時(shí)間的推移而同步更新。中藥標(biāo)準(zhǔn)特征指紋圖譜的建立標(biāo)準(zhǔn)藥材的選用標(biāo)準(zhǔn)藥材要經(jīng)過(guò)權(quán)威機(jī)構(gòu)或?qū)I(yè)的學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)進(jìn)行鑒定標(biāo)準(zhǔn)特征指紋圖譜的建立首先藥材收集，最低不得少于10個(gè)批號(hào)其次進(jìn)行藥材前處理、進(jìn)樣、分析、直至獲得指紋圖譜，再?gòu)臉悠返膱D譜中選取特征指紋峰，形成特征指紋峰群最后以特征指紋為依據(jù)