生物科學(xué)網(wǎng)-基因表達(dá)芯片分析乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組

生物科學(xué)網(wǎng)—基因表達(dá)芯片分析乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組生物科學(xué)網(wǎng)—基因表達(dá)芯片分析乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組生物科學(xué)網(wǎng)—基因表達(dá)芯片分析乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組V:1.0精細(xì)整理，僅供參考生物科學(xué)網(wǎng)—基因表達(dá)芯片分析乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組日期：20xx年X月生物科學(xué)網(wǎng)（）個(gè)人論文設(shè)計(jì)題目：基因表達(dá)芯片分析乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)生姓名：孫明輝學(xué)號(hào)：20100*****51專業(yè)：生物技術(shù)指導(dǎo)教師：張*學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)學(xué)院論文（設(shè)計(jì)）內(nèi)容介紹論文（設(shè)計(jì)）題目基因表達(dá)芯片分析乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組選題時(shí)間完成時(shí)間論文（設(shè)計(jì)）字?jǐn)?shù)7000關(guān)鍵詞唾液、生物標(biāo)志物、RNA、基因表達(dá)芯片、乳腺癌論文（設(shè)計(jì)）題目的來(lái)源、理論和實(shí)踐意義：隨著社會(huì)的進(jìn)步，文化生活水平的不斷提高，人們對(duì)醫(yī)學(xué)檢查的要求也越來(lái)越高，要求無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、快速的檢查診斷方法?？茖W(xué)技術(shù)的發(fā)展，為建立無(wú)創(chuàng)檢查的方法提供了可能。而唾液是一種復(fù)雜的混合物，不僅含有各種蛋白質(zhì)，還含有DNA、RNA、脂肪酸以及各種微生物等。研究發(fā)現(xiàn)，血液中的各種DNA成分同樣存在于唾液中，唾液能反映出血液中各種DNA水平的變化。因此，就有可能通過(guò)唾液的檢測(cè)來(lái)進(jìn)行疾病的診斷。近期，唾液標(biāo)本受到廣大研究者的普遍關(guān)注。與血清標(biāo)本相比，唾液采集安全方便，無(wú)創(chuàng)傷，無(wú)血源性疾病傳播的危險(xiǎn)，患者無(wú)痛苦，易于接受。與尿液標(biāo)本相比，唾液具有可實(shí)時(shí)采樣的優(yōu)點(diǎn)。唾液檢測(cè)研究已經(jīng)引起了人們極大的興趣，并取得了一些初步成果，唾液檢測(cè)得到廣泛應(yīng)用。論文（設(shè)計(jì)）的主要內(nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)：1）本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)乳腺癌患者唾液提取的RNA基因表達(dá)芯片并用先進(jìn)的生物信息分析技術(shù)進(jìn)行分析得出結(jié)論；2）依據(jù)患者唾液中具有共性的基因變異對(duì)乳腺癌進(jìn)行早期診斷和分期分型的整合分析，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道；3）本實(shí)驗(yàn)的實(shí)施和完成將為唾液中RNA中的基因表達(dá)圖譜進(jìn)行乳腺癌早期診斷提供直接的理論和實(shí)驗(yàn)根據(jù)，為深入探討其作用機(jī)制和臨床廣泛應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。附：論文（設(shè)計(jì)）本人簽名：年月日目錄TOC\o"1-3"\h\u19257摘要： 329973Abstract 4104701.引言 5117651.1背景 5243771.2AffymetrixGeneChipHumanGene1.0STArray簡(jiǎn)介 6256741.3唾液檢測(cè)的意義及優(yōu)勢(shì)： 8153411.4唾液組學(xué) 10113121.4.1唾液基因組學(xué) 10130151.4.2唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué) 1086401.5市場(chǎng)需求及產(chǎn)業(yè)化前景： 11288891.6主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)、先進(jìn)性： 117032.實(shí)驗(yàn)原理 1259953.實(shí)驗(yàn)步驟 12252183.1唾液收集的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 12279953.2D-chip軟件的使用 13128364.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 13303974.1D-chip結(jié)果： 13264394.2討論及分析： 1413596參考文獻(xiàn)： 14

基因表達(dá)芯片分析乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組摘要：前期動(dòng)物模型和臨床研究均顯示了乳腺癌與唾液基因表達(dá)圖譜的相關(guān)性。本研究利用試劑盒提取唾液樣品中的總RNA，通過(guò)全外顯子表達(dá)芯片（AffymetrixGeneChip?Human

Exon

1.0ST

Array）首次對(duì)我國(guó)乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，并與健康對(duì)照樣本進(jìn)行比較，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析（dChip），篩選乳腺癌患者特異的基因表達(dá)圖譜，為進(jìn)一步的臨床獨(dú)立樣本驗(yàn)證提供候選基因。關(guān)鍵詞：唾液、生物標(biāo)志物、RNA、基因表達(dá)芯片、乳腺癌

AbstractPreviousmousemodelstudiesandclinicalstudieshaveshownthecorrelationsbetweenbreastcanceronsetandsalivarygeneexpressionprofiles.Inthecurrentstudy,weextractedwholeRNAfromsalivaandanalyzedthetranscriptomicvariationsinbreastcancerpatientsandhealthycontrolsusingAffymetrixGeneChip?HumanExon1.0STArray.WeanalyzedthearraydatausingdChipsoftwareanddiscoveredapanelofgeneswithsignificantlyalteredexpressionlevel.Theresultsofourstudyprovidedcandidategenebiomarkersandpavesthewayforlargecohortclinicalvalidations.

1.引言1.1背景 乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命和健康。《中國(guó)2013年腫瘤登記年報(bào)》顯示我國(guó)女性惡性腫瘤發(fā)病前十位中乳腺癌（16.97%）高居榜首，而女性惡性腫瘤致死前十位中乳腺癌（8.35%）則列第五位，遠(yuǎn)低于肺癌（23.89%）。乳腺癌的高發(fā)凸顯目前早期診斷生物標(biāo)志物的潛力尚未完全發(fā)揮。乳腺癌發(fā)現(xiàn)得越早，治療得越早，其治愈率就越高。研究乳腺癌及其相關(guān)因素，目的是尋找發(fā)病原因，提示高危因素，監(jiān)護(hù)高危人群，以期作到三早(早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療)和干預(yù)控制，為乳腺癌的預(yù)防和治療開(kāi)辟新的途徑?，F(xiàn)階段，乳腺癌的檢測(cè)、診斷和分期分型主要依賴臨床和病理組織學(xué)評(píng)價(jià)。臨床評(píng)價(jià)包括臨床觸診和影像學(xué)測(cè)量。臨床觸診受施診醫(yī)師臨床經(jīng)驗(yàn)等主觀因素影響，評(píng)估容易出現(xiàn)偏差，且對(duì)較深病灶不易估計(jì)。乳腺X線鉬靶（mammography，MG）是乳腺疾病篩查和乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)和診斷的首選檢查方法，但檢查過(guò)程中難以避免導(dǎo)致部分患者產(chǎn)生疼痛，增加受試者的輻射，對(duì)腺體致密型患者敏感性較低；乳腺超聲對(duì)大于7mm的殘余癌檢測(cè)的靈敏度達(dá)100%[6]，與MG聯(lián)合檢查更提高了準(zhǔn)確性，但一定程度上增加了假陽(yáng)性率。病理學(xué)檢查是臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但術(shù)前無(wú)法準(zhǔn)確判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況,粗針穿刺結(jié)果可能沒(méi)有代表性,也無(wú)法判斷脈管瘤栓情況，同時(shí)難以對(duì)疾病的變化過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。因此，尋找一種有效的生物標(biāo)志物作為早期診斷、分期分型、藥物靶點(diǎn)篩查及腫瘤預(yù)后的指標(biāo)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。乳腺癌是應(yīng)用高通量基因表達(dá)分析和蛋白質(zhì)組分析最深入的腫瘤之一。這些研究所確定的分子圖譜已逐步揭示了乳腺癌的分子特征，并提供了可用于疾病預(yù)測(cè)和診斷預(yù)后的基因標(biāo)志物。前期動(dòng)物模型和臨床研究均顯示了乳腺癌與唾液基因表達(dá)圖譜的相關(guān)性。這些研究不僅探討了唾液分子標(biāo)志物與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系和潛在機(jī)理，還通過(guò)歐美臨床樣本尋找和驗(yàn)證了早期乳腺癌檢測(cè)的基因表達(dá)圖譜。然而應(yīng)用基因表達(dá)芯片對(duì)中國(guó)人乳腺癌患者來(lái)源的唾液樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究選取了12對(duì)乳腺癌和健康對(duì)照唾液樣本，利用試劑盒提取出樣品唾液中的RNA，利用基因表達(dá)芯片技術(shù)對(duì)樣本轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析（其中有一個(gè)乳腺癌患者的基因芯片由于操作原因未出結(jié)果），并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行比較，分析乳腺癌患者唾液樣本的基因表達(dá)圖譜與正常對(duì)照的異同，進(jìn)而篩選可用于早期檢測(cè)的生物標(biāo)志物。1.2AffymetrixGeneChipHumanGene1.0STArray簡(jiǎn)介本次試驗(yàn)是國(guó)內(nèi)首次運(yùn)用Affymetrix公司的GeneChipHumanGene1.0STArray基因表達(dá)芯片技術(shù)，GeneChipHumanGene1.0ST是最精簡(jiǎn)、同時(shí)也是最強(qiáng)有力的全轉(zhuǎn)錄組研究工具，其具備常規(guī)基因表達(dá)譜芯片無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，其優(yōu)勢(shì)在于：真正的基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定，而非常規(guī)基因表達(dá)譜芯片僅以3’端序列表達(dá)量為基因表達(dá)量，檢測(cè)的準(zhǔn)確性非常高；不會(huì)遺漏3’端外顯子丟失的轉(zhuǎn)錄本，若基因產(chǎn)物的3’端被剪切(這樣的轉(zhuǎn)錄本在身體內(nèi)達(dá)到了30%)，則用常規(guī)基因表達(dá)譜芯片無(wú)法檢測(cè)，而本芯片將全面的展示該部分內(nèi)容。不會(huì)遺漏新增加的3’端外顯子，有些基因在特定疾病狀態(tài)或生理狀態(tài)下，會(huì)在原有轉(zhuǎn)錄本的3’端出現(xiàn)新的外顯子，這預(yù)示新的基因產(chǎn)物產(chǎn)生；可以測(cè)定無(wú)poly-A尾的轉(zhuǎn)錄本，無(wú)poly-A尾的的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將在常規(guī)基因表達(dá)譜芯片的檢測(cè)策略下會(huì)丟失；可檢測(cè)RNA降解樣本中的基因轉(zhuǎn)錄水平，這是任何一種常規(guī)基因表達(dá)譜芯片的無(wú)法檢測(cè)的；哺乳動(dòng)物中數(shù)萬(wàn)個(gè)基因可以表達(dá)出上千萬(wàn)的不同形式的蛋白，基因與其產(chǎn)物數(shù)量的嚴(yán)重偏差主要來(lái)源于基因轉(zhuǎn)錄時(shí)的可變剪切。相同的基因，在不同組織中經(jīng)過(guò)可變剪切將產(chǎn)生完全不同結(jié)構(gòu)的蛋白，這些蛋白發(fā)揮完全不同的功能，有完全不同的活性，從而決定組織和器官的功能；相同的基因，在同一組織中的不同時(shí)期，也會(huì)經(jīng)過(guò)可變剪切，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不同的蛋白，影響不同的生物進(jìn)程；相同的基因，在不同的疾病狀態(tài)下，可通過(guò)可變剪切，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能差別很大的蛋白，導(dǎo)致信號(hào)通路的激活狀態(tài)差異，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生；相同的基因，被不同類型的環(huán)境因素作用，或者被同種環(huán)境因素的不同劑量作用，同樣可以通過(guò)可變剪切，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)差異很大蛋白，從而導(dǎo)致個(gè)體對(duì)環(huán)境的易感性不同；為此，利用GeneChipHumanGene1.0ST才可以真正研究基因在所有狀態(tài)下不同產(chǎn)物的真正性質(zhì)和數(shù)量，從而為深入研究疾病形成機(jī)制、個(gè)體與環(huán)境交互作用、疾病診斷、以及治療靶點(diǎn)提供全面的轉(zhuǎn)錄水平景象。設(shè)計(jì)思想：該款芯片中覆蓋了76萬(wàn)個(gè)探針，其中包括當(dāng)前所有已研究透徹的2.9萬(wàn)已知基因，平均每個(gè)基因被26個(gè)探針覆蓋，芯片探針序列覆蓋99%的NCBI基因標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Refseq)。所有探針的信息來(lái)源為：基因組信息來(lái)源：UCSChg18,NCBIBuild36轉(zhuǎn)錄本信息來(lái)源：RefSeq,EnsemblandputativecompleteCDSGenBanktranscriptsGeneChipHumanGene1.0ST的探針包含在GeneChipHumanExon1.0ST探針集中，主要為其中的已知基因部分。該芯片不但可以進(jìn)行全基因表達(dá)分析，還可以最大化地分析出樣本的基因剪切形式，以及基因的新剪切變異體。GeneChipHumanGene1.0ST可對(duì)全轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行如下兩個(gè)水平分析：基因水平：定量基因表達(dá)程度。芯片上每個(gè)基因從5’至3’端平均覆蓋26個(gè)探針，與全球任何一種基于常規(guī)基因。表達(dá)譜芯片相比，基因全長(zhǎng)覆蓋探針的芯片策略，可以為基因表達(dá)水平提供更加靈敏的檢測(cè)能力和統(tǒng)計(jì)學(xué)上更加穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。基因表達(dá)水平定量根據(jù)基因多個(gè)轉(zhuǎn)錄本累計(jì)表達(dá)量確定。1.3唾液檢測(cè)的意義及優(yōu)勢(shì)： 隨著社會(huì)的進(jìn)步，文化生活水平的不斷提高，人們對(duì)醫(yī)學(xué)檢查的要求也越來(lái)越高，要求無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、快速的檢查診斷方法?？茖W(xué)技術(shù)的發(fā)展，為建立無(wú)創(chuàng)檢查的方法提供了可能。而唾液是一種復(fù)雜的混合物，不僅含有各種蛋白質(zhì)，還含有DNA、RNA、脂肪酸以及各種微生物等。研究發(fā)現(xiàn)，血液中的各種DNA成分同樣存在于唾液中，唾液能反映出血液中各種DNA水平的變化。因此，就有可能通過(guò)唾液的檢測(cè)來(lái)進(jìn)行疾病的診斷。近期，唾液標(biāo)本受到廣大研究者的普遍關(guān)注。與血清標(biāo)本相比，唾液采集安全方便，無(wú)創(chuàng)傷，無(wú)血源性疾病傳播的危險(xiǎn)，患者無(wú)痛苦，易于接受。與尿液標(biāo)本相比，唾液具有可實(shí)時(shí)采樣的優(yōu)點(diǎn)。唾液檢測(cè)研究已經(jīng)引起了人們極大的興趣，并取得了一些初步成果，唾液檢測(cè)得到廣泛應(yīng)用。唾液是齦溝液、黏膜滲出液、唾液腺腺泡超滲液的混合體，儲(chǔ)存了大量的人類和口腔微生物的基因信息，是系統(tǒng)性檢測(cè)mRNA和蛋白質(zhì)變化的重要物質(zhì)。唾液中還含有口腔局部組織和身體其他部位感染微生物和病毒的RNA和DNA。唾液來(lái)源的DNA質(zhì)量中等，大部分樣本可檢測(cè)到基因型，可被擴(kuò)增和測(cè)序。唾液成分較血液相對(duì)簡(jiǎn)單，且唾液在口腔中經(jīng)唾液腺不斷分泌、更新，口腔黏膜細(xì)胞、唾液腺和口微生物的變化都可通過(guò)唾液mRNA和蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)到，從而反映某一階段口腔或身體其他部位的相關(guān)變化。通過(guò)非侵襲性的方式來(lái)評(píng)估健康狀況以及早期診斷口腔和系統(tǒng)性疾病一直是國(guó)家健康促進(jìn)組織和醫(yī)療機(jī)構(gòu)追求的目標(biāo)。唾液作為監(jiān)測(cè)健康和疾病的新興遞質(zhì)，近年來(lái)得到了越來(lái)越多的關(guān)注，在疾病早期診斷中具有明顯的作用。唾液較易操控，不易凝結(jié)，消除了抗凝處理對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響。同時(shí)，唾液采集具有非侵襲性，受試者基本無(wú)痛苦和不適，具有較高的可重復(fù)性，安全而廉價(jià)。唾液可以作為人體健康狀況的一面鏡子，目前以唾液作為診斷用介質(zhì)正引起越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。唾液檢測(cè)可以在多種環(huán)境下包括在路邊進(jìn)行并提供有價(jià)值的診斷信息。唾液已經(jīng)用于HIV、HBV病毒，以及各種藥物如可卡因、酒精的檢測(cè)。唾液檢測(cè)的研究剛剛起步，有關(guān)檢測(cè)的靈敏性、特異性、重復(fù)性以及與現(xiàn)有診斷標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)性還有待進(jìn)一步完善。盡管如此，唾液仍是具有極大科研和臨床潛力的生物液。隨著唾液檢測(cè)的研究工作的不斷深入，其應(yīng)用將會(huì)實(shí)現(xiàn)由疾病診斷到健康監(jiān)控的轉(zhuǎn)變。1.4唾液組學(xué)1.4.1唾液基因組學(xué)人類的唾液DNA總質(zhì)量為1.8~128.4mg·L－1，平均為21.6mg·L－1[3]。唾液DNA約有68%來(lái)自于宿主細(xì)胞，32%來(lái)自于口腔微生物或者病毒?？谇恢忻撀涞酿つど掀ぜ?xì)胞是唾液中人類DNA的主要來(lái)源。唾液DNA的質(zhì)量較高，研究發(fā)現(xiàn)，72%~96%的唾液樣本可進(jìn)行基因分型，84%的基因可被擴(kuò)增，67%的基因可被測(cè)序。有人利用TaqMan探針技術(shù)測(cè)定出唾液中人類DNA的質(zhì)量約為11.4mg·L-1，并于37℃溫度下保存了30多天的唾液樣本中將線粒體DNA、Y-染色體單核苷酸多態(tài)性和染色體微衛(wèi)星灶三種不同的基因標(biāo)志物準(zhǔn)確歸類。這就說(shuō)明，唾液DNA具有一定的穩(wěn)定性，儲(chǔ)存性能好，適于遠(yuǎn)程運(yùn)輸。有研究者發(fā)現(xiàn)，以適當(dāng)?shù)木彌_液保存唾液樣本，即使在室溫條件下保存1年以上，其DNA提取量也不會(huì)受到明顯影響。這就說(shuō)明，唾液可為基因組學(xué)研究提供良好的DNA來(lái)源。1.4.2唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)唾液RNA的總質(zhì)量為（0.108±0.023）mg·L-1~（6.6±3.6）mg·L-1范圍內(nèi)，其中大部分是人類mRNA[4]。目前，在健康人群的唾液中可以檢出3000~6400種mRNA，約占人類蛋白編碼基因的28%。其中，約200種mRNA由不同個(gè)體所共有，構(gòu)成了人類唾液轉(zhuǎn)錄組的核心；個(gè)體mRNA存在較多的重疊部分，約419和570個(gè)相同的轉(zhuǎn)錄本分別出現(xiàn)在90%和80%的個(gè)體中。單純的腮腺唾液中也存在較高質(zhì)量的RNA[（3.6±1.5）mg·L-1]，但僅僅含有4778個(gè)轉(zhuǎn)錄本，較全唾液少；在舌下腺、頜下腺、齦溝液和口腔脫落上皮細(xì)胞中也有一定質(zhì)量的mRNA，轉(zhuǎn)錄本分別為1831、1543、2689和3142個(gè)，即mRNA存在于各種來(lái)源的唾液中。唾液微生物DNA約占唾液總DNA質(zhì)量的32%，即在未經(jīng)離心的唾液中存在著一定質(zhì)量的非人類基因。目前已知唾液RNA主要來(lái)源于微生物，但關(guān)于非人類RNA總質(zhì)量的信息還有待研究。最近一項(xiàng)利用大規(guī)模平行測(cè)序的研究[5]，獲取了人非刺激性唾液所有的基因序列信息。其中，20%~25%的序列片段與人類的基因一致，約30%的序列片段與人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(kù)一致。研究還發(fā)現(xiàn)了4000多個(gè)基因的表達(dá)，不同位點(diǎn)的基因表達(dá)揭示了唾液中轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)上的完整性。該研究說(shuō)明，唾液轉(zhuǎn)錄組是一個(gè)很復(fù)雜的RNA網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。核糖體RNA（rRNA）和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）雖然在細(xì)胞中相當(dāng)穩(wěn)定，但mRNA卻可能在數(shù)分鐘內(nèi)迅速降解。唾液中的mRNA主要來(lái)源于唾液腺、口腔黏膜上皮細(xì)胞和齦溝液等。唾液RNA通過(guò)與某些未知的大分子相互作用，可在室溫下保持穩(wěn)定；但當(dāng)加入TritonX表面活性劑后，其RNA會(huì)迅速降解。這些發(fā)現(xiàn)與當(dāng)前的一些假說(shuō)吻合，即由脂質(zhì)包被的微囊為唾液mRNA從疾病位點(diǎn)到達(dá)口腔提供了重要保護(hù)。唾液中的脂質(zhì)微囊包含了諸多未受侵襲的功能性mRNA，后者甚至可改變口腔細(xì)胞角質(zhì)蛋白的表達(dá)模式，且扮演了物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾巧?。上述研究揭示了功能性唾液組學(xué)研究的全新方向。1.5市場(chǎng)需求及產(chǎn)業(yè)化前景：早期診斷對(duì)乳腺癌的積極有效治療和長(zhǎng)效預(yù)后至關(guān)重要，可以減少病人的痛苦和疾病相關(guān)的社會(huì)成本。中國(guó)人群在遺傳、環(huán)境和生活方式等方面與歐美乳腺癌高發(fā)地區(qū)有顯著的差異，發(fā)展以中國(guó)女性為研究對(duì)象的乳腺癌病因研究和生物標(biāo)志物研究，不僅能為中國(guó)女性乳腺癌危險(xiǎn)因素的明確和預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)，而且也能為解釋乳腺癌人種分布的差異、更深入揭示乳腺癌的病因提供證據(jù)。1.6主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)、先進(jìn)性：1）本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)乳腺癌患者唾液提取的RNA基因表達(dá)芯片并用先進(jìn)的生物信息分析技術(shù)進(jìn)行分析得出結(jié)論；2）依據(jù)患者唾液中具有共性的基因變異對(duì)乳腺癌進(jìn)行早期診斷和分期分型的整合分析，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道；3）本實(shí)驗(yàn)的實(shí)施和完成將為唾液中RNA中的基因表達(dá)圖譜進(jìn)行乳腺癌早期診斷提供直接的理論和實(shí)驗(yàn)根據(jù)，為深入探討其作用機(jī)制和臨床廣泛應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。2.實(shí)驗(yàn)原理我們用Affymetrix公司的HGU133加2.0陣列分析12例乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄和12組對(duì)照樣本的比較。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在年齡、吸煙史、絕經(jīng)期狀態(tài)及激素的分泌情況都盡量保持一致。對(duì)唾液轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，看相對(duì)于健康對(duì)照組（n=12，P<0.05）乳腺癌患者的多少個(gè)基因表現(xiàn)為>2倍上調(diào)，多少個(gè)基因表現(xiàn)>2倍下調(diào).。因?yàn)榧訇?yáng)性率P<0.05，所以這些轉(zhuǎn)錄鑒定不太可能歸因于巧合（2檢驗(yàn)，P<0.0001）。我們?cè)俑鶕?jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)的科學(xué)數(shù)據(jù)，基因表現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的變化>2倍，P值<0.01的轉(zhuǎn)錄組符合標(biāo)準(zhǔn)。然后再利用top228的無(wú)監(jiān)督聚類功能將轉(zhuǎn)錄組按照基因上調(diào)和下調(diào)進(jìn)行重新分類，檢驗(yàn)乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組（n=12）和對(duì)照組（n=12）是否被劃分為不同的組，若乳腺癌患者唾液轉(zhuǎn)錄組（n=12）和對(duì)照組（n=12）明顯被劃分為不同的組，說(shuō)明了我們所篩選的唾液mRNA生物標(biāo)記物具有比較高的的辨別能力（此結(jié)果可用d-chip軟件作點(diǎn)陣圖進(jìn)行比較）。若不能，則說(shuō)明我們所篩選的唾液mRNA生物標(biāo)記物不準(zhǔn)確，應(yīng)另進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟3.1唾液收集的標(biāo)準(zhǔn)操作程序1）選取新診病例，無(wú)腫瘤病史，無(wú)先前治療。2）病人預(yù)約，上午9-11點(diǎn)。唾液樣本收集前一個(gè)小時(shí)受試者不進(jìn)食、不喝水及使用任何口腔衛(wèi)生用品。3）收集唾液前囑受試者以水漱口，漱口后五分鐘將唾液吐在-4℃預(yù)冷的Oragene收集管中，同時(shí)提醒患者不要咳出粘液。盡快在30min內(nèi)收集5mL的唾液，收集過(guò)程中收集管需盡量置于冰上。收集完成后，按照收集管的步驟，旋轉(zhuǎn)管蓋，此時(shí)收集管即可以置于室溫。4）我們可以先期收集12對(duì)樣本。12個(gè)腫瘤，12個(gè)對(duì)照。年齡、吸煙史等盡量一致。3.2D-chip軟件的使用1）D-chip軟件使用的文件必須是文本文件，若文件是Excel文件則必須先改成txt文本文件。2）打開(kāi)d-chip軟件，點(diǎn)擊Analisys，選擇getexternaldata在datafile一欄選擇要分析的文本文件，點(diǎn)擊“確定”。3）點(diǎn)擊cluster在出現(xiàn)的對(duì)話框中的genelistortree一欄中再次選擇要分析的文本文件，選擇clustersamples和clustergene點(diǎn)擊“OK”確認(rèn)。即可出現(xiàn)樣本點(diǎn)陣圖。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1D-chip結(jié)果：4.2討論及分析：1)根據(jù)d-chip做出的點(diǎn)陣圖可以明顯的發(fā)現(xiàn)，與健康樣本相比，乳腺癌患者有的基因表現(xiàn)為上調(diào)，有的基因表現(xiàn)為下調(diào)，說(shuō)明乳腺癌患者唾液中的基因表達(dá)量確實(shí)有異于常人。2）再找到基因表現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的變化>2倍，P值<0.01的轉(zhuǎn)錄組，這些轉(zhuǎn)錄組就是我們要找的與乳腺癌相關(guān)的候選基因。參考文獻(xiàn)：1.Hinestrosa,M.C.,Dickersin,K.,Klein,P.,Mayer,M.,Noss,K.,Slamon,D.,Sledge,G.andVisco,F.M.(2007)Shapingthefutureofbiomarkerresearchinbreastcancertoensureclinicalrelevance.NatRevCancer,7,309-315.2.Marchionni,L.,Wilson,R.F.,Wolff,A.C.,Marinopoulos,S.,Parmigiani,G.,Bass,E.B.andGoodman,S.N.(2008)Systematicreview:geneexpressionprofilingassaysinearly-stagebreastcancer.AnnInternMed,148,358-369.3.Zhang,L.,Farrell,J.J.,Zhou,H.,Elashoff,D.,Akin,D.,Park,N.H.,Chia,D.andWong,D.T.(2009)SalivaryTranscriptomicBiomarkersforDetectionofResectablePancreaticCancer.Gastroenterology,2009Nov17.,[Epubaheadofprint,PMID:19931263].4.Pepe,M.S.,Feng,Z.,Janes,H.,Bossuyt,P.M.andPotter,J.D.(2008)Pivotalevaluationoftheaccuracyofabiomarkerusedforclassificationorprediction:standardsforstudydesign.JNatlCancerInst,100,1432-1438.5.Levenson,V.V.(2007)Biomarkersforearlydetectionofbreastcancer:what,when,andwhereBiochimBiophysActa,1770,847-856.6.Berg,W.A.,Gutierrez,L.,NessAiver,M.S.,Carter,W.B.,Bhargavan,M.,Lewis,R.S.andIoffe,O.B.(2004)Diagnosticaccuracyofmammography,clinicalexamination,US,andMRimaginginpreoperativeassessmentofbreastcancer.Radiology,233,830-849.7.Buehring,G.C.,Letscher,A.,McGirr,K.M.,Khandhar,S.,Che,L.H.,Nguyen,C.T.andHackett,A.J.(2006)Presenceofepithelialcellsinnippleaspiratefluidisassociatedwithsubsequentbreastcancer:a25-yearprospectivestudy.BreastCancerResTreat,98,63-70.8.Pawlik,T.M.,Hawke,D.H.,Liu,Y.,Krishnamurthy,S.,Fritsche,H.,Hunt,K.K.andKuerer,H.M.(2006)Proteomicanalysisofnippleaspiratefluidfromwomenwithearly-stagebreastcancerusingisotopecodedaffinitytagsandtandemmassspectrometryrevealsdifferentialexpressionofvitaminDbindingprotein.BMCCancer,6,68.9.Sauter,E.R.(2005)Analysisofnippleaspiratefluidfordiagnosisofbreastcancer:analternativetoinvasivebiopsy.ExpertRevMolDiagn,5,873-881.10.Li,J.,Zhao,J.,Yu,X.,Lange,J.,Kuerer,H.,Krishnamurthy,S.,Schilling,E.,Khan,S.A.,Sukumar,S.andChan,D.W.(2005)Identificationofbiomarkersforbreastcancerinnippleaspirationandductallavagefluid.ClinCancerRes,11,8312-8320.11.Gast,M.C.,vanDulken,E.J.,vanLoenen,T.K.,Kingma-Vegter,F.,Westerga,J.,Flohil,C.C.,Knol,J.C.,Jimenez,C.R.,vanGils,C.H.,Wessels,L.F.etal.(2009)Detectionofbreastcancerbysurfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometrytissueandserumproteinprofiling.IntJBiolMarkers,24,130-141.12.Gast,M.C.,Schellens,J.H.andBeijnen,J.H.(2009)Clinicalproteomicsinbreastcancer:areview.BreastCancerResTreat,116,17-29.13.Davis,M.A.andHanash,S.(2006)High-throughputgenomictechnologyinresearchandclinical.managementofbreastcancer.Plasma-basedproteomicsinearlydetectionandtherapy.BreastCancerRes,8,217.14.Drukier,A.K.,Ossetrova,N.,Schors,E.,Krasik,G.,Grigoriev,I.,Koenig,C.,Sulkowski,M.,Holcman,J.,Brown,L.R.,Tomaszewski,J.E.etal.(2006)High-sensitivityblood-baseddetectionofbreastcancerbymultiphotondetectiondiagnosticproteomics.JProteomeRes,5,1906-1915.15.Vlahou,A.,Laronga,C.,Wilson,L.,Gregory,B.,Fournier,K.,McGaughey,D.,Perry,R.R.,Wright,G.L.,Jr.andSemmes,O.J.(2003)Anovelapproachtowarddevelopmentofarapidbloodtestforbreastcancer.ClinBreastCancer,4,203-209.16.Anderson,K.S.,Ramachandran,N.,Wong,J.,Raphael,J.V.,Hainsworth,E.,Demirkan,G.,Cramer,D.,Aronzon,D.,Hodi,F.S.,Harris,L.etal.(2008)Applicationofproteinmicroarraysformultiplexeddetectionofantibodiestotumorantigensinbreastcancer.JProteomeRes,7,1490-1499.17.Lonneborg,A.,Aaroe,J.,Dumeaux,V.andBorresen-Dale,A.L.(2009)Foundintranscription:geneexpressionandothernovelbloodbiomarkersfortheearlydetectionofbreastcancer.ExpertRevAnticancerTher,9,1115-1123.18.Brown,N.M.,Stenzel,T.T.,Friedman,P.N.,Henslee,J.,Huper,G.andMarks,J.R.(2006)Evaluationofexpressionbasedmarkersforthedetectionofbreastcancercells.BreastCancerResTreat,97,41-47.19.Mikhitarian,K.,Gillanders,W.E.,Almeida,J.S.,HebertMartin,R.,Varela,J.C.,Metcalf,J.S.,Cole,D.J.andMitas,M.(2005)Aninnovativemicroarraystrategyidentitiesinformativemolecularmarkersforthedetectionofmicrometastaticbreastcancer.ClinCancerRes,11,3697-3704.20.Guffanti,A.,Iacono,M.,Pelucchi,P.,Kim,N.,Solda,G.,Croft,L.J.,Taft,R.J.,Rizzi,E.,Askarian-Amiri,M.,Bonnal,R.J.etal.(2009)Atranscriptionalsketchofaprimaryhumanbreastcancerby454deepsequencing.BMCGenomics,10,163.21.Melnikov,A.A.,Scholtens,D.M.,Wiley,E.L.,Khan,S.A.andLevenson,V.V.(2008)Array-basedmultiplexanalysisofDNAmethylationinbreastcancertissues.J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