何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件

第四章基因工程的主要技術與原理周毅峰2013.03第四章基因工程的主要技術與原理周毅峰核酸的提取與純化核酸電泳分子雜交PCR技術DNA序列分析大分子相互作用核酸的提取與純化核酸電泳分子雜交PCR技術DNA序列分析大分1、核酸的提取與純化破碎細胞或包膜－內容物釋放材料準備核酸分離、純化沉淀或吸附核酸，并去除雜質核酸溶解在適量緩沖液或水中1、核酸的提取與純化破碎細胞或包膜－內容物釋放材料準備核酸分20－60bp1.1、基因組DNA的提取與純化DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑DNA鈉鹽比游離態(tài)更易溶于水DNP在0.14mol/LNaCl中的溶解度是水中的1%DNP在1mol/LNaCl中的溶解度是水中的2倍20－60bp1.1、基因組DNA的提取與純化DNA溶于水，生物材料的準備新鮮，或者凍存的樣品液氮中研磨加緩沖液EDTA螯合Mg2+、Ca2+SDS變性蛋白質β-巰基乙醇、DTT打開二硫鍵和抗氧化PVP與酚和多糖結合及抗氧化裂解細胞除雜加CTAB或SDS結合多糖和蛋白加酚仿去蛋白純化與保存加乙醇或異丙醇沉淀加乙醇反洗滌吹干水或TE溶解－20℃保存生物材料的準備新鮮，或者凍存的樣品液氮中研磨加緩沖液EDTA基因組DNA的提取酚抽提法樣品的準備細胞的裂解蛋白質變性DNA的抽提DNA的沉淀基因組DNA的提取酚抽提法樣品的準備細胞的裂解蛋白血基因組DNA試劑盒酵母基因組DNA試劑盒細菌基因組DNA試劑盒細胞基因組DNA試劑盒血基因組DNA試劑盒酵母基因組DNA試劑盒細菌基因組DNA試

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解SDS法流程圖

（以動物組織為例）

動物組織細胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液SDS法流程圖（以動物組織為例）動物組織細胞裂解上層溶

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內容物密度不同的原理分離各種內容物濃鹽法：有機溶劑抽提法：密度梯度離心法：利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分核酸分離、純化蛋白質的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離、純化蛋白質的去除：多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化多糖的去除：核酸分離、純化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌多酚的去除：核酸分離、純化鹽離子的去除：CTAB溶液配制好備用，65℃水浴預熱。獼猴桃葉片或果實采取后最好立即放到液氮中,避免酚類物質氧化65℃水浴一個小時氯仿：乙醇：異戊醇=80:16:4的抽提液兩次。10000轉/分離心20分鐘，盡量把絲狀物壓緊，避免吸取上清時有絲狀物牽拉等體積預冷的異丙醇，75%乙醇洗去其他雜質。洗兩次。用無水乙醇5毫升洗一次。晾干5分鐘揮發(fā)掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存獼猴桃DNA提取實例

CTAB提取緩沖液的改進配方組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入CTAB溶液配制好備用，65℃水浴預熱。獼猴桃葉片或果實采取獼猴桃基因組DNA獼猴桃基因組DNA閉合環(huán)狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快；原理1.2、堿裂解法提取質粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復性強堿中性閉合環(huán)狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快；原理1.2、染色體線性DNA和或有缺口的質粒DNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結構，與蛋白質—SDS復合物結合在一起；當K+取代Na+時,生成不溶的PDS，這些復合物從溶液中沉淀下來。變性染色體線性DNA和或有缺口的質粒DNA變性后雙鏈分離，難以復利用宿主菌線狀染色體DNA與閉環(huán)雙鏈質粒DNA的結構狀態(tài)的差異來提取質粒DNA。當同時堿變性時，線狀基因組DNA變性充分而質粒DNA處于拓撲纏繞的自然狀態(tài)而不能彼此分開。當條件恢復時（酸中和），質粒DNA迅速準確配置重新形成完全天然超螺旋分子，而線狀DNA則與破裂的細胞壁，細菌蛋白相互纏繞成大型復合物，被SDS包蓋。當K+取代Na+時,這些復合物會從溶液中沉淀下來，附在細胞碎片上一起被離心除去。堿裂解法利用宿主菌線狀染色體DNA與閉環(huán)雙鏈質粒DNA的結構狀態(tài)的差所用的試劑作用①葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。②EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。③NaOH-SDSNaOH：強堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:溶解細胞膜蛋白和細胞內蛋白，并結合成“蛋白—SDS”復合物，使蛋白質（包括DNA酶）變性沉淀。所用的試劑作用①葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DN冰醋酸把醋酸鉀溶液的pH調到4.8。用來中和NaOH變性液，使DNA復性。高濃度的K+置換Na+，生成不溶的PDS用于沉淀DNA。⑤乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。④KAc-HAc緩沖液⑥RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。冰醋酸把醋酸鉀溶液的pH調到4.8。高濃度的K+置換Na+，⑦TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl維持溶液中pH值相對穩(wěn)定；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白質，使蛋白質沉淀。但苯酚會殘留在DNA溶液中。（現多用各種商品化的層析柱純化DNA)。⑧酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。⑦TE緩沖液DNA保存液。Tris-HCl維持溶液中pH值堿抽提法提取質粒DNA的步驟SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”懸浮菌體。第一步：懸浮菌體25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA溶液II破壞細胞膜，蛋白質和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質和DNA變性SolutionII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS第三步：中和溶液III使DNA復性、并促使蛋白質-SDS復合物和染色體DNA沉淀。SolutionIII的配制：5M乙酸鉀（用冰醋酸調pH至4.8）堿抽提法提取質粒DNA的步驟SolutionI的配制：上清液中含有閉合質粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。第五步：純化DNA上清液過柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA上清液中含有閉合質粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質粒DNA的提取使用處于對數期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質粒增加）培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則菌體易污染，質粒易丟失盡量選擇高拷貝的質粒，如為低拷貝或大質粒，則應加大菌體用量菌株不要頻繁轉接（質粒丟失）材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融基因細胞裂解材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當的裂解預處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶K細菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取質粒DNA的提取菌體量適當培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質粒易被打斷復性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質粒的提取，應先用酶法或機械法處理，以破壁細胞裂解材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低基核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間（獼猴桃大提，10000轉20min）針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法基因組DNA的提取質粒DNA的提取核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質粒DNA的提取核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數（2-3次）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應。

原因對策DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質重新純化DNA，去除蛋白、材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解。對策

原因材料不新鮮或反復凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。對策

原因實驗材料不佳或量少盡量選用新鮮（幼嫩）的材料DNA提取常見問1.2、RNA的提取與純化細胞RNA的含量 每個細胞的RNA量約為10-5μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…1.2、RNA的提取與純化細胞RNA的含量 每個細胞的RNA液氮中研磨加蛋白變性劑去除DNA和蛋白提供超低溫抵制酶活性異硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸鈉使蛋白和核酸分離異硫氰酸胍、β-巰基乙醇抑制RNase活性LiCl2沉淀RNA酚仿或水飽和酚抽提DNA和蛋白，將RNA留水相中乙醇洗滌雜質，乙醇或異丙醇沉淀RNA純化和沉淀RNA液氮中研磨加蛋白變性劑去除DNA和蛋白提供超低溫抵制酶活性異異硫氰酸胍/苯酚法原理：細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。異硫氰酸胍/苯酚法原理：步驟:材料準備：盡量新鮮。器具準備：0.1%DEPC處理24小時，滅菌；裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使細胞及核蛋白復合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70％乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。步驟:影響RNA提取的因素材料：新鮮，切忌使用反復凍融的材料如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。可以先將材料貯存在TRIzol或樣品貯存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，請分成多份保存液氮長期保存，－70℃短期保存影響RNA提取的因素材料：樣品破碎及裂解：根據不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图毦阂话鉚RIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁動植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍樣品量適當，保證充分裂解為減少DNA污染，可適當加大裂解液的用量樣品破碎及裂解：純化：在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；經典的純化方法，如LiCl沉淀等，雖然經濟，但操作時間長，易造成RNA降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應的雜質，是目前較為理想的選擇。影響RNA提取的因素純化：影響RNA提取的因素1.3核酸的純度與濃度鑒定紫外分光光度法核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結構因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm。各種堿基的紫外吸收光譜可通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質的污染，比值升高與降低均提示不純

判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染1.3核酸的純度與濃度鑒定紫外分光光度法核酸分子中的堿基具DNA或RNA的定量，OD260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。直接測定核酸濃度DNA或RNA的定量，OD260=1.0相當于50μg/ml熒光光度法核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，且熒光強度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）熒光光度法核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的DNA的完整性測定：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳結果可判定核酸制品的完整性?；蚪MDNA片段的分子量很大，在電場中泳動很慢，如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀。RNA的完整性測定：完整或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強度積分應呈特定的比值，沉降系數大的核酸區(qū)帶，電泳遷移低，熒光強度積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強度積分低。28S（23S）RNA的熒光強度約為18S（16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解。若在點樣孔附近有著色條帶，則說明存在DNA的污染。DNA的完整性測定：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳結果可判定核1、短期貯存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。TE緩沖液的PH與DNA貯存有關，PH為8時，可減少DNA脫氨反應，PH低于7.0時DNA容易變性。2、長期貯存：TE緩沖液中-70℃保存數年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。1.4、核酸的保存①DNA的儲存1、短期貯存：1.4、核酸的保存①DNA的儲存RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃保存。注意避免Rnase的污染；分裝，避免反復凍融；如用DEPC處理過的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin，保存時間可延長。②RNA的儲存RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃2、核酸電泳DNA電泳是基因工程中最基本的技術，DNA制備及濃度測定、目的DNA片段的分離，重組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。根據分離的DNA大小及類型的不同，DNA電泳主要分兩類：瓊脂糖凝膠電泳可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，膠濃度為0.5～0.6%的凝膠可以分離的DNA片段范圍為20bp～50kb。電泳結果用溴化乙錠（EB）染色后可直接在紫外下觀察，并且可觀察的DNA條帶濃度為納克級，而且整個過程一般1小時即可完成。由于該方法操作的簡便和快速，在基因工程中較常用。聚丙烯酰胺凝膠電泳適合分離1kb以下的片段，最高分辨率可達1bp，也用于分離寡核苷酸，在引物的純化中也常用此中凝膠進行純化，也稱PAGE純化。2、核酸電泳DNA電泳是基因工程中最基本的技術，DNA制備及2.1、瓊脂糖凝膠

瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1，3連接的吡喃型β-D-半乳糖和1，4連接的3，6脫水吡喃型阿α-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104～105的長鏈。瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機線團狀分布，當溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結構，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。針對不同用途開發(fā)了各種類型的瓊脂糖凝膠低熔點瓊脂糖凝膠，用于DNA片段的回收，且由于該種凝膠中無抑制酶，可在膠中進行酶切、連接等高熔點凝膠，可分離小于1kb的DNA片段，專用于PCR產物的分析快速凝膠，電泳速度比普通凝膠中快一倍，可節(jié)省實驗時間適用于DNA大片段的分離。2.1、瓊脂糖凝膠瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1，3連接的2.2、DNA電泳影響因素DNA為堿性物質，在電泳（緩沖液pH=8）時帶負電荷，在一定的電場力作用下向正極泳動。而DNA鏈上的負電荷伴隨著DNA分子量的增加而增加，荷質比是一常數，故電泳中DNA的分離類似分子篩效應。電泳中影響DNA分子泳動的因素很多，主要分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。DNA分子大小DNA分子越大在膠中的摩擦阻力就越大，泳動也越慢，遷移速率與線狀DNA分子質量的對數值成反比。DNA分子構型對于質粒DNA分子即使具有相同分子質量，因構型不同也會造成電泳時受到的阻力不同，最終造成泳動速率的不同2.2、DNA電泳影響因素DNA為堿性物質，在電泳（緩沖液瓊脂糖/％標準高強度低熔點低粘度低熔點0.30.5700bp～25kb0.8500bp～15kb800bp～10kb800bp～10kb1.0250bp～12kb400bp～8kb400bp～8kb1.2150bp～6kb300bp～7kb300bp~7kb1.580bp~4kb200bp~4kb200bp~4kb2.0100bp~3kb100bp~3kb3.0500bp~1kb500bp~1kb4.0100bp~500bp6.010bp～100bp不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小范圍不同的膠濃度對于同種DNA分子膠濃度越高，電泳速率越慢。常規(guī)實驗中對于小片段DNA分子的分離采用高濃度的膠分離（有時甚至用2％的凝膠）瓊脂糖/％標準高強度低熔點低粘度低熔點0.30.5700bp電場強度電泳時為了盡快得到實驗結果，所用的電場強度約為5V/cm，這樣的場強下雖能得到結果，但分辨率不高。在精確測定DNA分子大小時，應降低電壓至1V/cm。電場強度偏高時電泳分離的線性范圍會變窄，電壓過高時也會由于電泳中產生的大量熱量導致DNA片段的降解。溴化乙錠（EB）電泳中的染色劑，具有扁平結構，能嵌入到DNA堿基對間，對線狀分子與開環(huán)分子影響較小而對超螺旋態(tài)的分子影響較大。電泳時所加的濃度：臨界點的游離EB質量濃度為0.1mg/ml~0.5mg/ml電場強度溴化乙錠（EB）EB代替品EB代替品何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件電泳緩沖液目前有3種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳：TAE、TBE和TPE電泳緩沖液2.3、DNA電泳上樣緩沖液（loadingbuffer）指示劑監(jiān)測電泳的行進過程，指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。10mmol/l的EDTA螯合Mg2＋，防止電泳過程中DNA被降解一定濃度的甘油或蔗糖增加樣品的比重和密度以保證DNA沉入加樣孔內，而在大片段電泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可減少DNA條帶的彎曲和托尾現象。溴酚藍指示劑目前廠商提供的限制性內切酶中都有贈送的上樣緩沖液，一般為10×上樣緩沖液，DNA樣品中僅需加入1/10的量即可，加入過多的上樣緩沖液會造成電泳輕微的托尾現象。2.3、DNA電泳上樣緩沖液（loadingbuffer倒膠點樣倒膠點樣2.4、DNA電泳上樣量的控制

在分析性電泳中，一般樣品投入量達50～100ng/帶即可觀察到清晰結果。對于珍貴DNA樣品則上樣量達電泳的最低分辨率5～10ng/帶也可對于一定量的DNA，當電泳時采用較薄的梳子制膠，則電泳時DNA條帶相對較窄，觀察較清晰；隨著電泳時間的延長，由于DNA分子本身有一定的擴散，電泳條帶也會變淺。2.4、DNA電泳上樣量的控制在分析性電泳中，一般樣品投入2.5、脈沖場凝膠電泳

pulsed-fieldgelelectrophoresis這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間取決于它的大小。該法可分離長至5Mb的DNA分子。嚴格說來，應叫交替電場凝膠電泳。脈沖電場電泳示意圖2.5、脈沖場凝膠電泳

pulsed-fieldgele3、分子雜交分子雜交(molecularhybridization)：利用帶有標記（放射性同位素(32P或125I)、生物素或熒光酶等）探針（DNA、RNA或蛋白質）進行相同或不同種類分子間相互特異識別而發(fā)生結合的過程。3、分子雜交分子雜交(molecularhybridiza3.1核酸探針一小段用放射性同位素、生物素或熒光染料進行標記的已知序列的核酸片段，即為探針（probe）。探針可用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術，使雜交區(qū)帶顯現出來。根據標記物不同可分為放射性探針和非放射性探針兩大類；放射性標記物（[α-*N]-dNTP）32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)和125I(60d)非放射性標記物半抗原：生物素、地高辛熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）根據探針的來源及核酸性質不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。3.1核酸探針一小段用放射性同位素、生物素或熒光染料進行標記寡核苷酸探針（oligonucleotidprobe）：是人工合成且被適當標記的由短鏈核苷酸組成的大分子（即一段比較短的DNA或RNA），能與被檢測長鏈DNA或RNA進行分子雜交，且雜交后可由該分了上的標記顯示目的長鏈DNA或RNA分子的存在。常用寡核苷酸探針的標記物放射性同位素標記：32P、33P、35S非放射性標記：生物素、地高辛生物素－dUTP、生物素－dATP、地高辛－dUTP等寡核苷酸探針（oligonucleotidprobe）：是雜交探針的標記：ABC熒光標記雜交探針的標記：ABC熒光標記雜交探針的標記：ABC顯色酶標記雜交探針的標記：ABC顯色酶標記地高辛－dUTP雜交探針的標記：地高辛系統(tǒng)標記地高辛－dUTP雜交探針的標記：地高辛系統(tǒng)標記兩種地高辛－dUTP顯色系統(tǒng)兩種地高辛－dUTP顯色系統(tǒng)DIG探針雜交過程DIG探針雜交過程雜交探針的制備：用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件：單鏈結構（雙鏈DNA可用堿變性）足夠長度（至少12個堿基）內部不含互補區(qū)探針的制備方法或來源包括：人工合成cDNA合成同源序列mRNAGACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGCAGACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGCA雜交探針的制備：用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條T4-PNP介導的末端標記探針的標記方法切口移位(平移)法引物延伸法末端標記法體外轉錄或反錄法①末端標記TdT介導的末端標記T4-Pol介導的末端標記T4-PNP介導的末端標記探針的標記方法切口移位(平移)法引②DNA聚合酶介導的切口平移標記②DNA聚合酶介導的切口平移標記③DNA聚合酶介導的隨機引物法③DNA聚合酶介導的隨機引物法④逆轉錄酶介導的反轉錄標記3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT5’mRNA反轉錄酶Mg2+dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）5’TTTTTTTTTTT5’mRNA3’cDNA3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG···CTTGACTAAATCCGA④逆轉錄酶介導的反轉錄標記3’AAAAAAAAAAACCA轉錄酶介導的轉錄標記轉錄酶介導的轉錄標記3.2Southern雜交(Southernblotting)目標DNA經過限制性酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳①0.4NNaOH變性②1.5MNaCl/1MTris（pH7.4）中和③使DNA仍保持單鏈狀態(tài)①將凝膠上的DNA轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上②通過80℃處理或紫外線照射將DNA固定在濾膜上將結合了DNA分子的濾膜先與特定的預雜液進行預雜交，將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附雜交：在一定的溶液條件和溫度下，將標記的核酸探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上

洗膜：經過一定的洗滌程序將游離的探針分子除去檢測：放射性標記、檢測非放射性標記、檢測3.2Southern雜交(Southernblot分子雜交爐紫外交聯儀分子雜交爐紫外交聯儀M，地高辛（DIG）標記的分子量標準（λDNA/HindⅢ）1-3，蘇云金芽胞桿菌YBT-1520菌株的總DNA分別經KpnⅠ-PstⅠ、PstⅠ和KpnⅠ酶切以cry1Aa殺蟲晶體蛋白基因中的728bp片段作探針，通過隨機引物標記的方式，用DIG標記探針M，地高辛（DIG）標記的分子量標準（λDNA/HindⅢ3.3Northern雜交(Northernblotting)(A)RNAisisolatedfromvarioustissuesandisseparatedbysizeusinggelelectrophoresis.(B)Thegelisthenplacedonapaperwick,whichabsorbsanionicsolutionfromatrough(C)AfilterthattrapsRNAisplacedabovethegel,andblottingpaperisplacedabovethefilter.Capillaryactiondrawsthesolutionthroughthegel,trappingtheRNAonthefilter(D)Thefilterisincubatedwithradioactivesingle-strandedDNAcomplementarytothemRNAofinterest(E)AfteranyunboundDNAiswashedoff,autoradiographylocalizesthemRNAinthesamplesthatcontainit.(F)DrawingofadevelopmentalNorthernblotshowingthepresenceofPax6mRNAintheeye,brain,andpancreasofamammalianembryo3.3Northern雜交(NorthernblotSBEIIIWTSBEIIIOXWTSBEIIIOX檢測基因的表達水平Northern的應用實例SBEIIIWTSBEIIIOXWTSBEIIIOX3.4、Western印跡法(Westernblotting)檢測蛋白質，即將電泳分離的非標記蛋白質轉移到固相載體上，用特異的抗體對蛋白質進行鑒定及定量的方法主要步驟：蛋白質樣品的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳蛋白質的電轉移：NC膜靶蛋白的免疫學檢測靶蛋白于第一抗體（一抗）反應與標記的第二抗體（酶標，二抗）反應顯色反應：酶促反應3.4、Western印跡法(Westernblotti何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件三種分子雜交技術的比較SouthernNorthernWestern三種分子雜交技術的比較SouthernNorthernWes3.5、原位雜交(insituhybridization)將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。特點能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究不需從組織或細胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)細胞或組織的原位雜交檢測特異mRNA是否存在。步驟：細胞或組織的固定后置于載玻片上組織細胞雜交前的預處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質探針的選擇和標記雜交雜交結果檢測基本步驟3.5、原位雜交(insituhybridization硫轉蛋白在擬南芥根部的原位雜交硫轉蛋白在擬南芥根部的原位雜交FluorescentinsituhybridizationchromosomesMulticolorfluorescenceinsituhybridizationofZeamaysL.chromosomes.Studyofmaizechromosomeshasbeenhamperedbyalackofchromosomefeatures.Fluorescentinsituhybridizat菌落或噬菌斑雜交，將生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位置不變地轉移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用基本程序是：將被篩選的大腸桿菌菌落或噬菌斑，從其生長的瓊脂平板中轉移到硝酸纖維素濾膜上，進行適當的溫育，保藏原來的菌落平板作為參照，以便從中挑取陽性克隆。菌落或噬菌斑雜交，將生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原復制平板和膜轉印時應在平板和膜上的一側做三個對應的標簽①0.5MNaOH裂解細菌②酸中和③蛋白酶處理④漂洗細胞碎片⑤80℃烘烤與32P-標記的探針雜交放射性自顯影在參照平板上挑取目標陽性克隆（陽性菌落）擴大培養(yǎng)菌落原位雜交復制平板和膜轉印時應在平板和膜上的一側做三個對應的標簽①0.噬菌斑原位雜交噬菌斑原位雜交4、PCR技術4.1PCR技術發(fā)展簡史聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術，利用單鏈寡核苷酸引物對特異DNA片段進行體外擴增的一種方法AppliedBiosystemsGeneAmpPCR9700Thermocycler4、PCR技術4.1PCR技術發(fā)展簡史聚合酶鏈反應(PoDr.HargobindKhorana（1922－）Khorana(1971)等提出“在體外經DNA變性，與適當引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可合成tRNA基因”。序列分析方法未成熟寡核苷酸引物合成還處于手工及半自動合成階段熱穩(wěn)定的DNA聚合酶未見報道因此這個想法沒有實際意義！！但是：TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1968"fortheirinterpretationofthegeneticcodeanditsfunctioninproteinsynthesis"Dr.HargobindKhoranaKhorana(1加速分子生物學發(fā)展進程的一項“簡單而晚熟”技術TheNobelPrizeinChemistry1993"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"KaryB.Mullis1944－Dr.MullisjoinedtheCetusCorp.inEmeryville,California,asaDNAchemistin19791983年，Mullis發(fā)明了PCR技術，使Khorana的設想得到實現。加速分子生物學發(fā)展進程的一項“簡單而晚熟”技術TheNoMullis最初使用的DNA聚合酶是Klenow片段Klenow片段不耐熱，每個循環(huán)加一次酶是一個笨拙的中看不中用的實驗室方法擴增的DNA片段很均一，真實性較高，只有所期望的一種DNA片段1988年Keohanog改用T4DNAPol但仍是每個循環(huán)加一次酶Mullis最初使用的DNA聚合酶是Klenow片段Klen1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfSJ,HiguchiR,HornGT,MullisKB,ErlichHA.(1988)Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science.239:487-491.

SaikiRK,ScharfS,FaloonaF,MullisKB,HornGT,ErlichHA,ArnheimN.(1985)Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysesfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.230:1350-1354.1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PC4.2PCR技術基本原理和操作類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物基本反應步驟變性退火延伸變性4.2.1PCR技術基本原理4.2PCR技術基本原理和操作類似于DNA的天然復制①模板DNA的變性模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備②模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈①模板DNA的變性②模板DNA與引物的退火(復性)③預變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5min模板DNAdNTP引物Buffer預變性模板DNATaqDNA聚合酶94oC5min模板DNTaq酶模板DNAdNTP引物Buffer94℃

30s55℃1min72℃2.5minTaq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃7～10min循環(huán)25～35次Taq酶94℃30sTaq酶72℃7～10mi第二輪擴增第三輪擴增第一輪擴增產物目的基因目的基因第二輪擴增第三輪擴增第一輪擴增產物目的基因目的基因瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA擴增量可用下面的公式計算。PCR反應動力學Y＝(1＋X)nY：代表DNA片段擴增后的拷貝數X：表示平均每次的擴增效率n：代表循環(huán)次數平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，這種效應稱平臺效應每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件4.2.2PCR技術反應體系、條件和過程引物、酶(熱穩(wěn)定性DNA聚合酶)、dNTP、模板和二價陽離子（Mg2+）、一價陽離子（K+）、緩沖液①PCR反應的基本成分

10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul標準的PCR反應體系：4.2.2PCR技術反應體系、條件和過程引物、酶(熱穩(wěn)定性ddH2O11μLcDNA第一鏈模板1μL2×GCbuffer25μLdNTP(25mmol/L)8μLP7(10μmol/L)2μLP8(10μmol/L)2μLLATaqDNApolymease1μL在0.1mL離心管中加入下列溶液:總體積50μL

RT-PCR

ddH2O②10×擴增緩沖液KCl500mmol.L-1Tris-HCl100mmol.L-1(pH8.3-8.8)MgCl15mmol.L-1明膠0.1%在延伸溫度（72℃）下，pH值接近7.2，二價陽離子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用1.5mMMg2+，有時使用Mn2+。dNTP都能結合Mg2+，因此Mg2+的濃度要大于dNTP，KCl對擴增大于500bp長度和改善DNA片段產物是有益的②10×擴增緩沖液KCl500標準的PCR反應體系中含有等摩爾濃度的4種dNTP，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP（終濃度：250μmol/L）③dNTP④酶及其濃度SelectionforDNApolymeraseKlenow酶，早期采用，該酶不耐熱，缺點有①溫度要求低(37℃)，受熱即失活；②產物特異性不高；③積累大量的失活殘酶，使反應產物純度大大降低；④擴增的最長序列約400bp（Taq酶則能擴增10kb）標準的PCR反應體系中含有等摩爾濃度的4種dNTPthermostableDNApolymerases①TaqDNApolymerase②TthDNApolymerase—fromT.thermophilus③VENTDNApolymerase—fromT.litoralis④Sacpolymerase⑤pfupolymeraseTaqDNA聚合酶分離:1969年，美國黃石國家公園溫泉分子量:94KDa活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，200000U/mgthermostableDNApolymerasesTa離子需要：對Mg2+、單價離子性質和濃度較敏感，最適濃度為50mmol/L。忠實性：沒有校正單核苷酸錯配功能--致命弱點。一般出錯率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)，利用PCR克隆、測序時尤應注意抑制劑：尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及許多其他化學藥劑內源DNA：不同來源的酶可能由于制備過程中殘留的原細菌DNA或PCR產物的污染而含有不明來源的DNA。在使用擴增保守序列的通用引物時，會在無模板對照管出現擴增帶。保存：在-20℃至少6個月。離子需要：對Mg2+、單價離子性質和濃度較敏感，最適濃度為5如何選擇最合適的DNA聚合酶

－－PCR實驗的不同需求特異性：基因組擴增、RT-PCR保真性：基因篩選、測序、TA克隆長片段擴增：構建基因圖譜、測序、分子遺傳學擴增效率：復雜模板擴增（GC含量高、二級結構）PCR試劑盒：復雜模板擴增、大規(guī)?；驒z測如何選擇最合適的DNA聚合酶

－－PCR實驗的產品類型產品名稱產品性能化學修飾天為時代:HotStartTaqRoche:FastStartTaqAbgene:THERMO-START?DNAPolymeraseStratagene:SureStart?Taq大大提高PCR反應的特異性化學修飾不影響后續(xù)實驗抗體抑制Invitrogen：AccuPrimeTMTaqPlatinum?

TaqTaKaRa：ExTaqTMHotStartVersion蠟封

Promega：TaqBeadTM

HotStart熱啟動Taq酶產品類型產品名稱產品性能化學修飾天為特點：3′→5′核酸外切酶活性，降低堿基錯配率用途：表達基因的克隆基因的定點突變細胞內基因點突變分析（SNP）高保真酶特點：3′→5′核酸外切酶活性，降低堿基錯配率用途：表達基因產品類型生物公司性能比較PfuDNAPolymerase

天為時代StratagenePromega在目前已發(fā)現的所有耐熱聚合酶中,Pfu保真度最高堿基錯配率最低

PyrobestTM

DNAPolymerase

TaKaRaTliDNAPolymerasePromega產品類型生物公司性能比較PfPromega中國公司普洛麥格（北京）生物技術有限公司產品Promega中國公司高保真＋高擴增效率混合酶－熱啟動耐熱聚合酶－3′→5′核酸外切酶用途超長片段擴增、測序構建基因圖譜復雜模板擴增：GC含量高、二級結構高保真＋高擴增效率混合酶－熱啟動耐熱聚合酶用途超長片段特點產品性能高擴增效率天為時代：TaqPlusTaKaRa：ExTaqTM

復雜模板擴增高保真天為時代：TaqPlatinumInvitrogen：PfxPlatinumTaqDNApolymeraseHighFidelity保真度低于Pfu聚合酶但擴增效率較高長片段擴增天為時代：LongTaq

TaKaRa：LATaq

Invitrogen：

ElongaseAmplificaitonSystem

特別適用于保真度較高的超長片段擴增特點產品性能高擴增-controlledtemperature

-controlledrateoftemperaturechangeThermocyclerThermocyclerGradient-Thermocycleranautomaticmachine,acomputer-controlledthermalblock,inwhichthetemperaturecanberapidlychangedandfinelycontrolledGradient-Thermocycleranaut引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。⑤引物Ⅰ設計引物的原則引物長度：15-30bp，常用為20mer左右引物的有效長度不能大于38mer，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴增產物的特異性引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決于引物引物擴增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴增長至10kb的片段引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列避免引物內部出現二級結構避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異性的擴增條帶引物擴增跨度：以500bp為宜引物堿基：G+C含量以40-6⑤引物3′端的堿基要求嚴格配對特別是最末及倒數第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性⑤引物3′端的堿基要求嚴格配對⑥引物中有或能加上合適的酶切引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會引物的解鏈溫度兩個引物之間的Tm值差異最好在

2-5℃引物量：引物的解鏈溫度Ⅱ簡并引物設計（degenerateprimers)如：AsnPheTyrAla對應的核苷酸序列(?)AAUUUUUAUGCUAACUUCUACGCC等N/ATCGⅡ簡并引物設計（degenerateprimers)如：AⅢ設計引物的方法設計引物的操作流程同源性比較序列下載引物設計篩選根據所需要檢測的基因在/pubmed查詢有關序列利用primerpremier5.0等軟件進行設計和篩選Ⅲ設計引物的方法設計引物的操作流程同源性比較序列下載引物設計何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件同源性比較/blast/blast.cgi中在線比較采用OMIGA，PGCENE進行兩兩比較或多序列比較同源性比較http://www.ncbi.nlm.nih.g何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件上游引物下游引物發(fā)莢結構，點擊顯示的△G的絕對值不應大于5，所形成的發(fā)莢結構3′端為突出端影響較小，5′端影響較大引物自身形成二聚體，點擊顯示的△G的絕對值不應大于5引物在目標基因序列中間形成錯配的情況，點擊顯示的△G的絕對值不應大于15上下游引物形成配對的情況，點擊顯示的△G的絕對值不應大于5這幾個參數對引物設計的影響順序：FalsePriming>HairpinandCrossDimer>Dimer得到產物的機率，應大于50%上游引物下游引物發(fā)莢結構，點擊顯示的△G的絕對值不應大于5，⑥PCR反應條件的選擇溫度與時間的設置三溫度點法雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸(標準反應)二溫度點法除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。較短靶基因(長度為100～300bp)時⑥PCR反應條件的選擇溫度與時間的設置三溫度點法雙鏈變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃1min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。變性溫度與時間變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

TaqDNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行。延伸溫度與時間：PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。TaqDNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃循環(huán)次數決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數選在30～40次之間，循環(huán)次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。循環(huán)次數循環(huán)次數決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數主要取決于模板⑦PCR實驗操作過程⑦PCR實驗操作過程PCR產物純化PCR產物純化PCR產物純化試劑盒PCR產物純化試劑盒PCR產物電泳⑧PCR常見問題正對照有條帶，而樣品則無原因：該Buffer對樣品不合適引物設計不當或者發(fā)生降解模板:含有抑制物，含量低反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短優(yōu)化純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA更換Buffer或調整濃度重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間PCR產物電泳⑧PCR常見問題正對照有條帶，而樣品則無原因非特異性擴增現象：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶原因：引物特異性差酶純度不高Mg2+濃度偏高退火溫度偏低Buffer不合適循環(huán)次數過多解決：重新設計引物或者使用巢式PCR換用高純度的酶降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法更換Buffer減少循環(huán)次數非特異性擴增現象：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，拖尾現象：產物在凝膠上呈Smear狀態(tài)原因：酶量過多模板不純循環(huán)次數過多dNTP、Mg2+濃度偏高退火溫度偏低Buffer不合適解決：適量用酶純化模板減少循環(huán)次數適當降低dNTP和鎂離子的濃度適當提高退火溫度更換Buffer拖尾現象：產物在凝膠上呈Smear狀態(tài)原因：假陽性現象：空白對照出現目的擴增產物原因：靶序列或擴增產物的交叉污染對策：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。假陽性現象：空白對照出現目的擴增產物雙脫氧法測序

(Sangerdideoxyprocedure

)5DNA序列的測定(Sangerdideoxyprocedure

)大規(guī)模測序的策略和測序技術的發(fā)展化學法測序(Maxam-Gilbertprocedure)

雙脫氧法測序(SangerdideoxyproceduFrederickSangerDNA的合成過程中，在合成的DNA鏈的3′末端，依據堿基配對的原則，通過生成新的3′，5′-磷酸二酯鍵，使DNA鏈合成終止，產生短的DNA鏈。產生相應的四組具有特定長度的、不同長短的DNA鏈。5.1雙脫氧法測序(Sangerdideoxyprocedure

)①雙脫氧法測序原理FrederickSangerDNA的合成過程中，在合成的何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理課件雙脫氧法測序基本過程雙脫氧法測序基本過程自動測序電泳裝置自動測序電泳裝置AnexampleofaportionofachromatogramfromautomatedsequencingAutomatedsequencingisbasedonthedideoxymethodology,butfourdifferentfluorescentdye-labelledddNTPsareused.Thuseachfluorescentlabelcanbedetectedbyitscharacteristicspectrum.Theproductsareseparatedbyautomatedelectrophoresisandthebandsdetectedbyfluorescencespectroscopy.Anexampleofaportionofac

Sanger測序儀采用96個毛細電泳管的陣列，可以同時進行96個這樣的測序反應，每個反應得到的Read長度可以達到1000bp以上

MEGABACE1000DNA測序儀Sanger測序儀采用96個毛細電泳管的陣列，可以同時進多道移液器96孔反應板多道移液器96孔反應板②雙脫氧法測序程序將待測基因序列打斷成較短重疊的DNA片段群DNA片段連入載體，在E.coli體內擴增，挑取單菌落，分離純化重組載體測序加入DNA聚合酶，dNTP以及帶有熒光標記的雙脫氧核苷酸ddNTP凝膠電泳，檢測標記過的核苷酸片段的熒光信號。根據重疊序列，通過軟件處理，DNA序列信息②雙脫氧法測序程序將待測基因序列打斷成較短重疊的DNA片測序載體pUC：雙鏈質粒載體，衍生的載體很多，不同商業(yè)公司有所不同，但基本均由pUC衍生而來，使用時需先變性M13系列和pUC系列的測序載體的使用避免了使用物理方法分離大量的DNAM13：單鏈噬菌體載體，目前很少采用測序載體pUC：雙鏈質粒載體，衍生的載體很多，不同商業(yè)公司有測序DNA聚合酶①DNA聚合酶ⅠKlenow片段5′→3′的聚合酶活性，3′→5′的外切酶活性持續(xù)合成能力不強，不能復制富含二級結構的模板區(qū)以ddNTP為底物的能力遠比在dNTP低易受DNA制備時經常產生的污染物的影響，且只對單鏈模板有效測序DNA聚合酶①DNA聚合酶ⅠKlenow片段5′→3′②T7噬菌體聚合酶(測序酶)是一種經過修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，缺乏3′→5′外切酶活性能產生出非常漂亮的DNA梯帶，每條帶都具有相似的強度，可讀的DNA序列可覆蓋凝膠的全長測序酶催化ddNTP結合的速率是dNTP的33%具有1.0和2.0兩個版本，2.0取代了1.0，能對折疊成二級結構的模板起作用測序酶526位氨基酸為Tyr，若換成Phe，結合ddNTP的能力下降2000倍，將E.coliDNAPolⅠ或TaqdnaPol類似氨基酸換面Tyr其結合ddNTP的能力提高8000倍②T7噬菌體聚合酶(測序酶)是一種經過修飾的T7噬菌體DN③TaqDNA聚合酶它在高溫下（70℃）進行終止鏈反應的能力可減少測序反應中由于模板DNA上引物假結合位點與引物退火錯配產生的相關問題在測序凝膠的放射自顯影片上條帶間的強度不同，從頂部到底部條帶逐漸減弱，出現陰影?？捎糜诟缓壗Y構的模板催化ddNTP結合的與該區(qū)模板DNA序列的影響TaqDNAPol和PfuPol催化ddNTP結合的速率比結合dNTP的速率低兩個數量級③TaqDNA聚合酶它在高溫下（70℃）進行終止鏈反應的能通用引物的使用避免了合成不同引物的麻煩（M13正反向，T7，SP6等）M13Primers（TaKaRa公司）M13Primer各引物位置圖通用引物的使用避免了合成不同引物的麻煩（M13正反向，T7，堿基序列：5′-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3′SP6PromoterPrimer形態(tài)凍結干燥品?？捎脺缇騎EBuffer(pH7.5～8.0)溶解后使用用途作為具有SP6Promoter載體的測序用引物或PCR用引物堿基序列：5′-CATACGATTTAGGTGACAC5.2化學法測序(Maxam-Gilbertprocedure)

經凝膠電泳按大小分離和放射自顯影后，根據X光片所顯現的相應條帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序是一個DNA化學降解的過程，而不是生物合成過程化學試劑處理具有末端標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應混合物注意：只能標記一個堿基，多堿基標記會產生錯誤。標記方式：羥基磷酸化反應、大腸桿菌聚合酶IKlenow片段及[α-32P]dNTP標記、用末端轉移酶標記DNA片段的3′端

5.2化學法測序(Maxam-GilbertprocedG系統(tǒng)；pH8.0硫酸二甲酯→G→m7G→C8~N9斷裂→脫G

A+G系統(tǒng)；pH2.0哌啶甲酸（pidine）→嘌呤環(huán)N質子化→脫嘌呤C系統(tǒng)；1.5mol/LNaCl（高鹽）C+肼（hydrazine）→脫C

T+C系統(tǒng)（非高鹽條件）肼(hydrazine)→打開嘧啶環(huán)→重新5C環(huán)化→脫嘧啶G系統(tǒng)；pH8.0A+G系統(tǒng)；pH2.0C系統(tǒng)；1.化學降解法測序基本過程化學降解法測序基本過程生物信息分析普通的序列分析軟件序列的拼裝：CAP（contigassemblingprogramme）同源性的比較：BLAST，ClustalW等。集成軟件：如BioEdit等。提供如少數序列的拼裝，同源性的比較，開放閱讀框的查找，酶切位點的查找等功能。學會利用豐富的網上資源。生物信息分析普通的序列分析軟件測序技術的發(fā)展雙脫氧末端終止法(Sanger測序法)1970s同位素標記，手工1980s熒光標記，自動1990s毛細管電泳合成測序法（第二代測序）焦磷酸測序（Pyrosequencing,Roche/454）合成測序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）連接測序（Sequencin