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免疫組化技術(shù)第一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
一、生物素-抗生物素免疫組織化學(xué)技術(shù)(一)基本原理雞蛋中含有一種堿性蛋白,屬于糖蛋白,也稱卵白素(avidin),分子量68000。卵白素具有4個(gè)與維生素H或稱生物素(biotin)親和力極高的結(jié)合位點(diǎn)。生物素是一種小分子維生素,分子量244,它與卵白素之間的親和力比抗原抗體之間的親和力高100萬(wàn)倍,因而能彼此牢固締結(jié)和而不影響各自的生物活性。同時(shí),生物素與卵白素都具有與其他標(biāo)記物如熒光素、鐵蛋白和過(guò)氧化酶等結(jié)合的能力。目前,已利用上述特性建立了卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng),為了便于理解,現(xiàn)在統(tǒng)稱卵白素為抗生物素或親和素,因此,卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為生物素-抗生物素免疫組織化學(xué)技術(shù)第二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(1)石蠟切片脫蠟至水,用0.01mol/LPBS(pH=7.4)漂洗5min×3次;(2)滴加0.3%H2O2,37℃孵育10min,阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;(3)用0.01mol/LPBS漂洗5min×3次;(4)滴加10%正常血清/0.3%TritonX-100/0.01mol/LPBS,37℃孵育10min;(5)滴加抗小鼠單克隆抗體(一抗)37℃1h或4℃過(guò)夜,PBS漂洗5min×3次;(6)加生物素標(biāo)記二抗(效價(jià)1:200),室溫孵育10min,PBS漂洗5min×3次;(7)滴加鏈霉素抗生物素蛋白-HRP液,室溫孵育10min;PBS洗5min×3次;(8)滴加DAB,顯微鏡下顯色5~10min第三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(二)ABC免疫組織化學(xué)技術(shù)
1981年,許世明等建立了抗生物素-生物素-過(guò)氧化物酶法(avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod,簡(jiǎn)稱ABC法)。ABC是卵白素-生物素結(jié)合的HRP復(fù)合物的簡(jiǎn)稱。ABC復(fù)合物是先將HRP與生物素結(jié)合,然后按一定比例將此復(fù)合物與卵白素反應(yīng),使每一個(gè)卵白素分子上結(jié)合3個(gè)帶HRP的生物素,留出一個(gè)能與其它生物素結(jié)合的空位。復(fù)合物上攜帶的HRP越多,則酶催化的組織化學(xué)反應(yīng)也越強(qiáng)烈,陽(yáng)性結(jié)果也越明顯第四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日第五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日第六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(三)SABC免疫組織化學(xué)技術(shù)鏈霉親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì),分子量60000,含糖鏈。鏈霉親和素也有四個(gè)生物素親合位點(diǎn),是一種更理想的抗生物素結(jié)合蛋白。SABC是鏈霉親和素-生物素-HRP復(fù)合物(strept-avidin-biotin-peroxidasecomplex)的簡(jiǎn)稱。SABC復(fù)合物先將HRP與生物素結(jié)合,然后按一定比例將此復(fù)合物與鏈霉親和素反應(yīng),使每一個(gè)鏈霉親和素分子上結(jié)合3個(gè)帶HRP的生物素,留出一個(gè)尚未被生物素結(jié)合的空位,可以與各種生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合。復(fù)合物上攜帶的HRP越多,則酶催化的組織化學(xué)反應(yīng)也越強(qiáng)烈,陽(yáng)性結(jié)果也越明顯第七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日第八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日第九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日SABC法是在一抗體反應(yīng)后,用已結(jié)合生物素的抗IgG抗體二抗橋接。然后用SABC孵育,使橋抗上的生物素與SABC中鏈霉親和素上的空位結(jié)合。最后仍用HRP的底物成色。在SABC法中,一抗是特異性的,二抗是生物素標(biāo)記的二抗,三抗是SABC復(fù)合物。SABC復(fù)合物與橋抗體之間是通過(guò)生物素結(jié)合的,因此SABC復(fù)合物沒(méi)有種屬特異性,可適用于任何種屬的一抗。當(dāng)然,生物素結(jié)合的二抗必須是針對(duì)一抗種屬的。因此,SABC法較PAP法操作更簡(jiǎn)單、更靈敏。目前,SABC試劑盒已經(jīng)商品化,可以根據(jù)需要購(gòu)買。第十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(四)PAP法與ABC法聯(lián)合(ABPAP)技術(shù)第十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日ABPAP使特異性一抗結(jié)合更多的酶分子,原始信號(hào)得
到更大的放大效應(yīng)。(1)石蠟切片脫蠟至水(2)滴加0.3%H2O2,80%甲醇抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(3)用0.1胰蛋白酶室溫消化10min
(4)滴加二抗的正常血清1:10;;(5)滴加適當(dāng)稀釋的一抗;(6)加適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二抗;第十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(7)滴加鼠PAP或兔PAP;(8)生物素化馬抗鼠或羊抗兔;(9)滴加ABC復(fù)合物;(10)滴加0.04%DAB+0.03%H2O2,(11)蒸餾水漂洗,蘇木精復(fù)染(必要時(shí)),脫水、透明、封片、觀察。評(píng)價(jià)
ABPAP法較單一PAP法和ABC法更為敏感,抗體稀釋度大大提高,尤其是對(duì)抗原性較弱、容易破壞或丟失的抗原,能得到較好的效果。但ABPAP法較單一PAP法和ABC法步驟增多、操作復(fù)雜,背景著色會(huì)相應(yīng)加深,而且容易脫片。第十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
二、葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫組織化學(xué)技術(shù)(一)SPA的生物學(xué)特性
1.生化特性
葡萄球菌蛋白A是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì),簡(jiǎn)稱蛋白A(SPA)。SPA存在于大部分(90%)金葡菌,并且主要存在于血漿凝固酶陽(yáng)性的菌株。內(nèi)含3個(gè)高度相似的Fc段結(jié)合區(qū),每區(qū)有50個(gè)以上的氨基酸組成,不含色氨酸和半胱氨酸。SPA的羧基末端是賴氨酸,氨基末端結(jié)構(gòu)尚未肯定,其黏度高于球蛋白,等電點(diǎn)PI=5.1,天然結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定,在應(yīng)用6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑條件下,尚能保存某些三級(jí)結(jié)構(gòu),除去變性劑后,能自然矯正恢復(fù)原有結(jié)構(gòu)。第十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
2.免疫學(xué)特性
SPA具有與人和許多動(dòng)物如豚鼠、豬、小鼠、猴等IgG結(jié)合的能力。SPA結(jié)合部位是Fc段而不是Fab段,結(jié)合后不影響抗體的活性。SPA具有雙價(jià)結(jié)合力,每分子SPA可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子,也可一方面與IgG結(jié)合,同時(shí)與標(biāo)記物(如熒光素)結(jié)合。另外,與SPA結(jié)合后的IgG可用4mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽使其解離。
3.其他特性
SPA能引起豚鼠離體回腸的收縮,在吞噬反應(yīng)中抑制IgG調(diào)理素的吞噬和殺菌作用,SPA-IgG能固定人的補(bǔ)體和人、狗、豬的新鮮補(bǔ)體等第十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(二)SPA在免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用目前,SPA已廣泛應(yīng)用于免疫球蛋白的制備和分析、免疫組織化學(xué)標(biāo)記、多種病原體(細(xì)菌、病毒和支原體等)快速診斷,作為研究免疫復(fù)合物、膜抗原、膜受體和膜IgG的固相吸附劑。本節(jié)主要介紹SPA在免疫組織化學(xué)標(biāo)記中的應(yīng)用。SPA可被多種標(biāo)記物如熒光素、過(guò)氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等所標(biāo)記,應(yīng)用較廣的為酶標(biāo)SPA和金標(biāo)記SPA技術(shù)。標(biāo)記SPA常用的酶為HRP,SPA在PAP法中可以代替橋抗。第十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
1.SPA-HRP間接法染色(1)石蠟切片脫蠟后用0.5%H2O2-純甲醇液處理20min,抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;(2)用Tris-HCl緩沖液洗滌3min×2次;(3)加一抗血清覆蓋切片,37℃孵育30min;(4)用Tris-HCl緩沖液洗滌5min×3次;(5)滴加適當(dāng)稀釋的SPA-HRP,室溫處理30min;(6)用Tris-HCl緩沖液洗滌5min×3次,DAB-H2O2室溫顯色,蒸餾水漂洗;(7)蘇木精復(fù)染,脫水、透明、封片,鏡下觀察反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色。第十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
2.SPA用于PAP法染色(1)石蠟切片脫蠟后用0.3%H2O2-80%純甲醇液抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20min;(2)加10%卵白蛋白Tris緩沖液,室溫作用20min;(3)加一抗血清覆蓋切片,37℃孵育45min
(4)用Tris-HCl緩沖液洗滌5min;(5)滴加SPA室溫處理30min,緩沖液洗滌5min;(6)加PAP復(fù)合物孵育30min,緩沖液洗滌5min;(7)加DAB(0.6mg/ml)和0.01%H2O2室溫顯色5min,蒸餾水漂洗;(8)蘇木精復(fù)染1min,脫水、透明、封片,鏡下觀察反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色第十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
三、凝集素免疫組織化學(xué)技術(shù)凝集素(lectin)是一種從植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白,因能凝集紅細(xì)胞(含血型物質(zhì))而得名。常用的有植物凝集素(phytoagglutin,PNA),通常以其來(lái)源植物命名,如刀豆素(conconvalina,ConA)、麥胚素(wheatgermagglutinin,WGA)、花生凝集素(peanutagglutinin,PNA)和大豆凝集素(soybeanagglutinin,SBA)等。凝集素不是來(lái)源或參與免疫反應(yīng)的產(chǎn)物,但具有某些“親合”特性,可被免疫組織化學(xué)所應(yīng)用,因此,凝集素免疫組織化學(xué)應(yīng)稱為凝集素組織化學(xué)第十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(一)凝集素的生物學(xué)特性生物膜中含有一定的糖類,主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素能識(shí)別糖蛋白和糖肽,特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化物結(jié)構(gòu),即細(xì)胞膜表面的碳水化物決定簇。一種凝集素具有對(duì)某種特異性糖基專一性結(jié)合的能力,如刀豆素與α-吡喃糖基甘露糖(α-D-mannopyranosyl)結(jié)合,麥胚素與N-乙酰糖胺(N-acetylglucosamine)結(jié)合。因此,凝集素可以作為探針,研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另外,凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力,能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合,從而在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位第二十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(二)凝集素在免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用由于凝集素的以上生物學(xué)特性,目前已廣泛應(yīng)用作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記、細(xì)胞特殊類型標(biāo)記和腫瘤細(xì)胞凝結(jié)素結(jié)合特性的研究。凝集素可以被多種標(biāo)記物如熒光素、過(guò)氧化物酶、生物素等所標(biāo)記,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。
1.直接法將標(biāo)記物質(zhì)直接標(biāo)記在凝集素上,使其直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂結(jié)合。本法簡(jiǎn)便、快速,但靈敏度不高。第二十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日將熒光、HRP或膠體金標(biāo)記的凝集素直接用于未處理組織,簡(jiǎn)單迅速但敏感性差。第二十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
2.間接法將生物素化的凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合,生物素同ABC復(fù)合物結(jié)合。本法簡(jiǎn)便、快速,而且靈敏度高。試劑盒已商品化,可以方便購(gòu)買。(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,加0.01%胰蛋白酶消化20min;(2)TBS洗滌5min×2次后,在10%BSA中浸育5min,以減少非特異性染色;(3)加與生物素結(jié)合的凝集素(10μg/ml),孵育60min,TBS洗滌5min×2次;(4)加ABC浸育60min,TBS洗滌5min×2次;(5)DAB顯色,流水洗滌,蘇木精復(fù)染,脫水、透明、封片。第二十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日將組織切片孵育于凝集素溶液,使之結(jié)合于切片上的糖鏈,清洗后加凝集素的特異性抗體。該抗體可用FITC、HRP或膠體金標(biāo)記;也可不標(biāo)記凝集素抗體,而將二抗標(biāo)記,或使用未標(biāo)記二抗,再用PAP復(fù)合物完成染色。第二十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日將凝集素用生物素標(biāo)記,然后加用標(biāo)記的抗生物素蛋白,或ABC復(fù)合物使之與生物素結(jié)合第二十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日3.糖-凝集素-糖法利用過(guò)量的凝集素與切片中特定的糖基結(jié)合,經(jīng)過(guò)沖洗后,凝集素上還存在未被占用的結(jié)合位點(diǎn),將這些未結(jié)合的部位與經(jīng)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基結(jié)合,形成一個(gè)三明治樣的糖-凝集素-糖復(fù)合物。本法特異性強(qiáng)、靈敏度高,既不像ABC法那樣要結(jié)合生物素,也不需要像PAP法那樣制備抗體。(1)石蠟切片脫蠟后用0.3%H2O2-純甲醇液處理20min,抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;(2)用凝集素室溫孵育30min,TBS洗滌3min×2次;(3)加10μg/mlHRP標(biāo)記的糖液,室溫孵育30min,TBS洗滌5min×2次;(4)DAB-H2O2顯色,蒸餾水漂洗,脫水、透明、封片。第二十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日將過(guò)量凝集素加于組織切片上(以保證凝集素的結(jié)合位點(diǎn)被組織上的糖基不完全占據(jù))再加糖基化的標(biāo)記物(如巖藻糖基Fuc-HRP),其中的糖基將結(jié)合于未被占據(jù)的凝集素結(jié)合位點(diǎn),然后顯示標(biāo)記物。由于目前發(fā)現(xiàn)的糖基化的標(biāo)記物種類不多,故夾層發(fā)的使用有限。第二十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
第五節(jié)免疫金銀及鐵標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用膠體金作為標(biāo)記物的免疫金染色和免疫金銀染色方法,在光鏡和電鏡下可以進(jìn)行單標(biāo)記、雙重標(biāo)記或多重標(biāo)記,觀察組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu),定性、定位和定量研究。第二十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
一、膠體金的基本概念
1.分散體系體系是一定空間范圍內(nèi)作為研究對(duì)象的物質(zhì),某一種或幾種物質(zhì)分散到另一種物質(zhì)中所組成的體系稱為分散體系。被分散的物質(zhì)稱為分散相或分散質(zhì),而另一種物質(zhì)稱為分散介質(zhì)。分散體系的某些性質(zhì)因分散相質(zhì)點(diǎn)的大小而改變,可分為三類:(1)離子分散體系:分散相以小分子或離子狀態(tài)分散,這種溶液具有高度穩(wěn)定性,無(wú)論放置多久,分散相顆粒都不會(huì)因重力而下沉,不會(huì)從容液中分散出來(lái)第二十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(2)膠體分散體系:分散相顆粒大小在1~10nm之間,膠體溶液外觀透明不渾濁,普通顯微鏡下看不見其分散相粒子,不易受重力影響與分散介質(zhì)分離而沉淀,但其中的溶膠粒子有聚結(jié)變大的傾向,即具有聚結(jié)不穩(wěn)定性。(3)粗分散體系:分散相顆粒由許多分子組成,因粒子較大,肉眼或顯微鏡即可看到,不穩(wěn)定,極易因重力作用而自動(dòng)沉降,外觀渾濁不透明。第三十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日2.膠體金的一般形狀膠體金也稱金溶膠,是指分散相粒子直徑在l~150nm之間的金溶膠,是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液,具有一般溶膠的特性。屬于多相不均勻體系,顏色呈桔紅色到紫紅色(顆粒越大,顏色越深)。膠體金可以作為標(biāo)記物用于免疫組織化學(xué),近10多年來(lái)膠體金標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展為一項(xiàng)重要的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金免疫分析在藥物檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域的研究已經(jīng)得到發(fā)展,并越來(lái)越受到相關(guān)研究領(lǐng)域的重視第三十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日3.膠體金標(biāo)記蛋白溶液的pH等于或稍高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)呈中性,此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒之間的靜電作用較小,但蛋白質(zhì)分子的表面張力最大,處于一種微弱的水化狀態(tài),易于吸附于金顆粒的表面。由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表面,形成一個(gè)蛋白層,阻止了膠體金顆粒間的相互接觸,使膠體金溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。為防止蛋白質(zhì)與膠體金的聚合與沉淀,常用牛血清白蛋白、卵蛋白、聚乙二醇或明膠做穩(wěn)定劑。第三十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
二、免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)(一)免疫金染色
1.免疫金法免疫金法(IGS)染色程序簡(jiǎn)單,無(wú)需顯色就能檢測(cè)細(xì)胞表面的抗原,又能檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原。陽(yáng)性部位顯紅色,一般要求膠體金顆粒直徑大于20nm,濃度較高。分為直接法(標(biāo)記一抗)和間接法。用IGS定位細(xì)胞抗原一般采用間接法。第三十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日第三十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(二)免疫金銀法免疫金銀法(IGSS)的基本原理是通過(guò)免疫反應(yīng)沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用,用對(duì)苯二酚還原劑將銀離子(Ag+)還原成銀原子(Ago)。被還原的銀原子圍繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”,“銀殼”一旦形成本身也具有催化作用,從而使更多銀離子還原,促使“銀殼”越來(lái)越大,最終抗原位置清楚放大。
IGSS優(yōu)點(diǎn):①用于光鏡和電鏡觀察;②敏感性高;③定位準(zhǔn)確;④方法簡(jiǎn)便、安全;⑤成本較低,標(biāo)本可長(zhǎng)期保存第三十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(三)彩色免疫金銀法(CIGSS)是在IGSS基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,基本原理與彩色顯影相似。IGSS方法在抗原位點(diǎn)處生成銀顆粒,經(jīng)鐵氰化鉀與溴化鉀的作用即被氧化成溴化銀,后者與彩色顯影劑接觸后即被還原成金屬銀,而彩色顯影劑本身則被氧化,其氧化產(chǎn)物使彩色呈色劑由無(wú)色變成有色染料,沉積在銀顆粒的部位,金屬銀變成了銀離子。由于染料只能通過(guò)彩色顯影劑沉積在有銀的部位,所以,不與組織發(fā)生非特異性吸附。第三十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(四)免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1.膠體金制備簡(jiǎn)單2.標(biāo)記簡(jiǎn)單,抗體生物活性不受影響3.特異性強(qiáng)4.敏感性高5.定位準(zhǔn)確6.適應(yīng)性廣7.易于多重雙重標(biāo)記第三十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
三、免疫膠體鐵組織化學(xué)技術(shù)膠體鐵(ferriccolloid)是一種陽(yáng)離子膠體,可以通過(guò)普魯士藍(lán)反應(yīng)呈色,其顆粒有一定的大小和電子密度,最初用于光鏡和電鏡下定位組織中的陰離子部位,后來(lái)用于標(biāo)記抗體分子,應(yīng)用于免疫組織化學(xué)技術(shù)。本法特異性強(qiáng)、敏感性高、背景清晰。目前常用水合聯(lián)胺-二甲砷酸-FeCl3煮沸法制備微細(xì)顆粒的膠體鐵,該方法制備的膠體鐵呈棕紅色,顆粒大小1nm左右。光鏡下,陽(yáng)性部位呈藍(lán)色,細(xì)胞核呈紅色第三十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
第六節(jié)免疫組化雙標(biāo)技術(shù)
應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法在同一張組織、細(xì)胞片上,同時(shí)或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分,稱為免疫雙重或多重標(biāo)記技術(shù)。光鏡下可通過(guò)標(biāo)記物或其反應(yīng)生成物的顏色來(lái)標(biāo)記不同的抗原成分,電鏡下則可通過(guò)標(biāo)記物顆粒的大小來(lái)表示不同的抗原成分。本章主要介紹光鏡免疫雙重或多重標(biāo)記技術(shù)。
一、基本原理和方法目前已建立了許多方法,根據(jù)其作用方式和原理的不同,可以分為洗脫法和非洗脫法兩大類。第三十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(一)洗脫法
一般用于光鏡下間接法所做的雙標(biāo)?;驹硎窃诘谝环N染色完成后,用酸性溶液洗脫這種染色在切片上形成的抗原抗體復(fù)合物,從而避免與下一種抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng)。按洗脫效果,可以分為以下兩種情況。
1.洗脫第一種染色中的抗原抗體復(fù)合物,但保留顯色反應(yīng)的生成物,然后做下一種染色,并采用不同顏色的反應(yīng)生成物來(lái)標(biāo)示第二種抗原。這樣,兩種顏色可同時(shí)并存于同一組織片上顯示兩種抗原。
第四十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
2.洗脫第一種染色中的抗原抗體復(fù)合物及顯色反應(yīng)生成物,再做下一種染色。這時(shí)第二種染色實(shí)際上是在回復(fù)為空白的組織片上重新進(jìn)行,并用不同顏色的反應(yīng)生成物與前一種結(jié)果相區(qū)別。這種方法得到的兩種染色陽(yáng)性結(jié)果是先后而不是同時(shí)并存在同一組織片上。要比較和了解它們之間的關(guān)系,必須在完成第一種染色后先拍照,然后在第二種染色后找到同一區(qū)域再次拍照,比較兩次照片的結(jié)果。
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(二)非洗脫法在染色過(guò)程中,不用洗脫第一種染色的抗原抗體復(fù)合物及顯色反應(yīng)產(chǎn)物,而用多種不同的技術(shù)方法來(lái)避免與第二種染色抗體系統(tǒng)的交叉反應(yīng),即非洗脫法。較常用的非洗脫法有以下幾種。
1.直接法
把不同顏色的標(biāo)記物分別標(biāo)記到各個(gè)特異性抗體(一抗)上,采用直接法染色,特異性抗體分別與相應(yīng)的抗原結(jié)合,使抗原由不同的標(biāo)記物顯示出來(lái),實(shí)現(xiàn)雙標(biāo)或多標(biāo)(圖6-1)。
第四十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日?qǐng)D6-1直接法免疫雙重染色原理X、Y為兩種抗原HRP為辣根過(guò)氧化物酶AP為堿性磷酸酶
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2.間接法--異種動(dòng)物抗體法
不同種動(dòng)物IgG的Fc段抗原有種屬特異性,因此相應(yīng)的抗體不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。用間接法染色時(shí),不同的一抗(如兔抗X抗原的抗體和豚鼠抗Y抗原的抗體)可混合在一起使用,不同的二抗(如羊抗兔IgG和豬抗豚鼠IgG)也可混合在一起應(yīng)用,不同種屬的一抗和二抗各自與相應(yīng)的抗原(X和Y)反應(yīng),從而將兩種抗原同時(shí)顯示出來(lái)(圖6-2A))。第四十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日如果二抗不是標(biāo)記抗體而只是作為橋抗體,則可再與三抗反應(yīng),后者分別由產(chǎn)生一抗的同種動(dòng)物產(chǎn)生,又與不同的標(biāo)記物結(jié)合,最終顯示出不同的抗原所在部位(圖6-2B)。
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圖6-2間接異種動(dòng)物抗體法和雙重免疫染色原理
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3.間接法----同種動(dòng)物抗體法也稱分步固定法。做第一種染色時(shí),在一抗(兔抗X)與組織抗原X結(jié)合后,用第一種標(biāo)記二抗(如FITC--羊抗兔IgG)飽和一抗(兔抗X)上的抗原決定簇,這就排除了第二種染色時(shí)所用的二抗(如TRITC-羊抗兔IgG)再與之結(jié)合的可能。此時(shí)由于二抗過(guò)量,每個(gè)FITC-羊抗兔IgG分子上的兩個(gè)抗原結(jié)合部位(Fab段)只有其中一個(gè)與一抗上的抗原決定簇結(jié)合,另一個(gè)處于游離狀第四十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日態(tài),有可能與下一種染色中的一抗(兔抗Y)交叉反應(yīng)。因此,在完成第一種染色后,用多聚甲醛蒸氣處理組織片,使二抗的游離抗原結(jié)合部位失活,即可消除第二種染色中所用的一抗(兔抗Y)與之發(fā)生交叉反應(yīng)的可能,使各種免疫染色所用抗體都不再會(huì)有交叉反應(yīng),從而可以一種接一種地進(jìn)行多種免疫顯色(圖6-3)。第四十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
圖6-3間接法同種動(dòng)物抗體法(分步固定法)多重免疫染色原理
第四十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日4.標(biāo)記抗原法:
應(yīng)用這一方法前,首先用不同的標(biāo)記物分別標(biāo)記與待檢抗原相同的純抗原。染色時(shí)先用未標(biāo)記的特異性抗體與組織抗原反應(yīng),由于抗體過(guò)量及空間結(jié)構(gòu)的原因,每個(gè)特異性抗體IgG分子中只有一個(gè)抗原結(jié)合部位(Fab段)與組織抗原結(jié)合,另一個(gè)則與后來(lái)所用的標(biāo)記純抗原結(jié)合,從而顯示出相應(yīng)的組織抗原的部位。采用本法時(shí),即使抗體不純也不會(huì)影響結(jié)果的特異性,因?yàn)闃?biāo)記好的純抗原只與相應(yīng)抗體結(jié)合,從而使組織中相應(yīng)的抗原分別得到特異性顯示(圖6-4)。第五十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日?qǐng)D6-4標(biāo)記抗原法免疫雙重染色原理
第五十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
5.其他方法
免疫熒光法和免疫酶法的敏感性不同,可以組合應(yīng)用實(shí)現(xiàn)雙標(biāo)。先用免疫酶法作第一重染色,由于敏感性高,一抗可以高度稀釋,顯色反應(yīng)后,二抗又被顯色反應(yīng)生成物包繞,不易與下一重的一抗相結(jié)合。此后以免疫熒光法作第二重染色,由于敏感性低,所用的抗體系統(tǒng)不會(huì)與前一重染色中高度稀釋的抗體交叉反應(yīng),就能分別標(biāo)示出不同抗原。同樣,還可將免疫金銀法與上兩種方法做不同組合,或?qū)⒚庖呓疸y法與免疫金法組合來(lái)實(shí)現(xiàn)雙標(biāo)。第五十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
二、免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)
最適合觀察存在于同一細(xì)胞內(nèi)的不同抗原。不同的熒光素在相應(yīng)的光波激發(fā)下會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色,例如異硫氰熒光素(FITC)呈綠色,異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)呈紅色熒光。把它們分別標(biāo)記在不同的抗體上,各自與相應(yīng)的抗原相結(jié)合,就能實(shí)現(xiàn)用不同顏色顯示不同的抗原。由于每種熒光素在特定波長(zhǎng)的光波激發(fā)下才呈現(xiàn)相應(yīng)的熒光(如FITC在490nm光波激發(fā)下呈綠色,TRITC在546nm光波激發(fā)下呈紅色),用熒光顯微鏡觀察雙標(biāo)陽(yáng)性結(jié)果時(shí),可以依次選用特定波長(zhǎng)的激發(fā)濾光片分別觀察。第五十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
要精確地比較陽(yáng)性結(jié)果,則需用兩次曝光的技術(shù),選用彩色底片,先對(duì)一種顏色熒光顯示的陽(yáng)性結(jié)果拍照,然后轉(zhuǎn)換激發(fā)濾光片,對(duì)另一種顏色熒光顯示的陽(yáng)性結(jié)果作第二次曝光,此時(shí)不可移動(dòng)載玻片,以保證切片上不同顏色代表的相應(yīng)抗原,可以分析比較它們相互間的關(guān)系。也可以不移動(dòng)切片,同時(shí)拍兩張不同顏色熒光照片,比較抗原存在部分,對(duì)處于同一細(xì)胞內(nèi)的抗原,用這種方法觀察結(jié)果較好。有時(shí)在同一波長(zhǎng)觀察兩種熒光,并進(jìn)行照相也能得到較滿意的結(jié)果。
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(一)洗脫法用同種動(dòng)物產(chǎn)生的特異性抗血清為一抗(如兔抗X抗原及兔抗Y抗原血清),二抗也由一種動(dòng)物產(chǎn)生(如羊抗兔IgG),但用不同顏色的熒光素分別標(biāo)記(如FITC-羊抗兔IgG及TRITC-羊抗兔IgG)。
1.設(shè)備與試劑(1)濕盒,冰箱和烤箱。(2)伊文藍(lán)溶液:取伊文藍(lán)lg溶解于l00mlPBS中,加入1%NaN31m1。過(guò)濾后貯存于4℃冰箱中。用前取0.1ml,加PBS9.9ml稀釋成0.01%濃度使用。第五十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(3)洗脫液:12.5%高錳酸鉀(KMn2O4)1ml,5%硫酸(H2SO4)1ml,加蒸餾水140ml混勻而成。
(4)0.5%焦亞硫酸納還原液:500mg焦亞硫酸鈉(Na2S2O5)加蒸餾水至l00ml。
(5)甲基綠溶液:0.1%甲基綠4m1加入PBS36ml混勻。
(6)緩沖甘油:純甘油(分析純)20ml,加入0.5mol/L碳酸緩沖液(pH9.5)20m1,充分混勻,待其中氣泡完全消失,即可使用。
(7)0.5mol/L碳酸緩沖液(pH9.5):將NaHCO33.7g,Na2CO20.6g溶解于l00m1蒸餾水中,混合,調(diào)pH至9.5。第五十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
2.操作步驟
(1)石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,降乙醇至水;固定組織的恒冷切片,直接入0.01mol/LPBS;新鮮組織的恒冷切片,室溫干燥30~60min,在100%冷丙酮內(nèi)固定5~l0min后入PBS,組織周邊擦干。
(2)滴加適當(dāng)稀釋度的免疫血清,在濕盒、37℃溫箱中放置30~60min,或在4℃冰箱中過(guò)夜。
(3)PBS洗3次,每次5min,吸水紙吸去殘留液。
(4)滴加適當(dāng)稀釋度的間接熒光抗體(用0.01%伊文藍(lán)溶液稀釋,以消除非特異性自發(fā)熒光),在濕盒中37℃放置30~60min。
第五十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(5)PBS洗2次,每次5min,再用蒸餾水洗1min。(6)甘油緩沖液封固,熒光顯微鏡觀察,拍照。(7)PBS泡數(shù)分鐘,去除封固,蒸溜水洗50min。(8)入洗脫液,洗脫時(shí)間隨切片厚度而定,一般為1~5min,較厚的振動(dòng)切片,需10min以上。(9)切片置入0.5%焦亞硫酸鈉液30s。(10)流水沖洗10~20min,蒸餾水浸5min。(11)重復(fù)步驟2~6進(jìn)行第二重免疫熒光染色。第五十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
若需要,可用甲基綠套染核,染色5min,再用PBS洗5min,然后封固。在熒光顯微鏡下觀察,可見細(xì)胞核呈紅色。如果前一重染色中二抗是FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG,則第二重可用TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗。完成第二重染色后,在鏡下找到第一次拍照的部位再次攝影,比較兩重染色的結(jié)果。由于洗脫法不能使兩種熒光素同時(shí)存在于一張切片上,因而不能用二次曝光的方法在同一張照片上顯示出兩種抗原。
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3.注意事項(xiàng)
(1)每次洗脫后,在進(jìn)行下一重染色之前鑒定洗脫效果。例如,在洗脫第一重染色中顯示X抗原抗體復(fù)合物后,先用非免疫血清(正常兔血清)或Y抗原吸附滅活的抗血清代替抗Y血清,以同樣步驟做第二重染色,結(jié)果應(yīng)為陰性,如果出現(xiàn)陽(yáng)性,即表明洗脫不完全,第一重染色中殘留的抗體系統(tǒng)與后一重抗體系統(tǒng)發(fā)生了交叉反應(yīng),陽(yáng)性部位是X抗原而不是Y抗原。不經(jīng)鑒定直接做第二重染色,就可能把第一重染色殘留的抗體系統(tǒng)表現(xiàn)出來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果誤為Y抗原,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。第六十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(2)本法中應(yīng)用的洗脫液具有很強(qiáng)的氧化作用,可能損害下一重染色所需要顯示的組織抗原的抗原性,造成洗脫后的假陰性結(jié)果。為此,在對(duì)組織切片做雙重染色之前,最好先用免疫組織化學(xué)濾紙模型,檢測(cè)洗脫液對(duì)所要染的各種抗原是否有破壞作用,也可將數(shù)張組織切片先用洗脫液處理后,分別對(duì)各個(gè)抗原做一重染色,了解最易受洗脫液損害的抗原。在雙重染色中,第一重染色總是先行顯示最嬌弱的抗原,而把能經(jīng)受洗脫液作用的抗原留待第二重染色中顯示。第六十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(二)非洗脫直接法
直接法雙標(biāo)的前提要備有不同熒光素分別標(biāo)記的特異性抗體,如FITC標(biāo)記的兔抗X抗體,TRITC標(biāo)記的兔抗Y抗體。
1.設(shè)備與試劑
同洗脫法。
2.實(shí)驗(yàn)步驟
(1)切片準(zhǔn)備:同洗脫法。
(2)把標(biāo)記好的抗X、抗Y熒光抗體,按適當(dāng)稀釋度混合在一起(用0.01%伊文藍(lán)溶液稀釋)滴加在切片上,37℃中放置30~60min?;?℃過(guò)夜。
(3)傾去熒光抗體,PBS洗2次,每次5min,蒸餾水洗1min。
(4)50%甘油緩沖液封固。
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(三)間接法-異種動(dòng)物抗體法
所用的特異性抗體來(lái)自不同種動(dòng)物,如兔抗X血清,由鼠抗Y血清,然后用FITC標(biāo)記羊抗兔IgG,TRITC標(biāo)記豬抗鼠IgG作為相應(yīng)的二抗。染色時(shí),不同的一抗可以混合在一起,不同的二抗也可混合在一起,按間接免疫熒光法步驟進(jìn)行。當(dāng)一抗分別與切片上的X、Y抗原結(jié)合后,再用混合二抗與之反應(yīng)。由于兔和鼠IgG的Fc段抗原有種屬特異性,因此羊抗兔IgG和豬抗鼠IgG各自與相應(yīng)的Fc段抗原結(jié)合,不會(huì)交叉反應(yīng),X抗原即被FITC標(biāo)示,Y抗原則為TRITC標(biāo)示。這一方法的特異性與直接法一樣,但敏感性高于后者。
第六十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日第六十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(四)間接法-同種動(dòng)物抗體法
本法應(yīng)用兔抗X、兔抗Y抗原的血清為一抗,二抗也可由一種動(dòng)物產(chǎn)生,如羊抗兔IgG,但是用不同的熒光素如FITC及TRITC分別標(biāo)記,以顯示肽類抗原的方法為例,操作步驟如下:(1)石蠟切片厚3~5μm,脫蠟進(jìn)水。(2)以l%人血清白蛋白(HAS)或10%正常羊血清作用10min,阻斷切片對(duì)蛋白質(zhì)非特異性吸附。(3)用適當(dāng)稀釋的兔抗X血清與之反應(yīng),一抗的稀釋度及反應(yīng)時(shí)間均按間接免疫熒光法摸出的最佳條件而定。
第六十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(4)以0.05mol/LTBS(pH7.4、內(nèi)含l%TritonXl00,下同)洗5min,共3次。(5)TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG在室溫下反應(yīng)1h。(6)PBS洗10min,共3次,這時(shí)第一重染色已完成,X抗原由TRITC顯示。(7)切片逐級(jí)乙醇脫水,二甲苯透明,空氣中干燥后,置多聚甲醛密閉容器中,80℃溫箱內(nèi)以甲醛蒸氣固定2~4h,使第一重染色中二抗的抗原結(jié)合部位失活。(8)將切片以TBS洗5min,共3次。(9)1%HAS(或10%正常羊血清)作用30min。(10)再以適當(dāng)稀釋的兔抗Y血清及FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG,按上述步驟做第二重染色。第六十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(11)TBS洗后,以緩沖甘油封蓋,在熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長(zhǎng)的激發(fā)光觀察TRITC及FITC所標(biāo)示的X、Y抗原所在部位。(12)如用彩色底片對(duì)切片同一部位用546nm及490nm波長(zhǎng)的激發(fā)光分別做兩次曝光,即可在同一張照片上顯示不同顏色標(biāo)示的兩種抗原。這種雙標(biāo)方法的關(guān)鍵在于完成第一重染色后,用多聚甲醛蒸氣使二抗的游離抗原結(jié)合部位被固定而失活,不會(huì)再與下一重染色中的抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng),因此也可稱為分步固定法。多聚甲醛蒸氣處理切片的時(shí)間,需根據(jù)切片的厚度掌握,一般5μm厚的切片,蒸氣固定的時(shí)間需長(zhǎng)達(dá)4h,效果較好。處理時(shí)間太短,可能使抗體滅活不徹底,仍然有可能與下一重染色中的一抗交叉反應(yīng)。第六十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
同洗脫法一樣,為檢查甲醛蒸氣固定對(duì)抗體的滅活效果,可以用正常兔血清以取代第二重染色中的一抗,按前述步驟做第二重染色,如果出現(xiàn)陽(yáng)性,表明滅活不徹底,就需要再延長(zhǎng)甲醛蒸氣固定時(shí)間。凡是經(jīng)過(guò)甲醛溶液固定后仍然能保持抗原性的抗原,用這種分步固定法可以取得良好的雙重或多重免疫染色結(jié)果,有些抗原對(duì)甲醛固定作用比較敏感,其抗原性可能被破壞,對(duì)這樣的抗原可以在第一重染色中先行顯示。多聚甲醛蒸氣對(duì)FITC和TRITC的顏色和強(qiáng)度幾乎沒(méi)有影響,但因FITC的熒光比較容易衰退,因此在第一重染色中先用TRITC標(biāo)記的二抗,在第二重染色中再用FITC標(biāo)記的二抗效果較好。
第六十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日第六十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
三、免疫酶標(biāo)雙標(biāo)技術(shù)免疫酶標(biāo)雙標(biāo)技術(shù)與免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)的原理有很多相同之處,但作為標(biāo)記物的酶有好幾種,如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶(GO)等,它們各自又有幾種不同的底物,顯色反應(yīng)所得顏色也各不相同,因此,免疫酶染色的方法種類比免疫熒光染色更多樣化。酶反應(yīng)物性質(zhì)較穩(wěn)定,不像標(biāo)記在抗體上的熒光素那樣容易被洗脫,在光鏡下同一張切片可同時(shí)見到兩種顏色的顯色物并存,不必像兩重?zé)晒馊旧菢臃謩e觀察。
第七十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(一)洗脫法原理步驟都與前述洗脫法雙重免疫熒光染色相似,可按不同的酶和底物系統(tǒng)呈色,在完成第一重免疫酶染色后,將抗原抗體復(fù)合物洗脫,再做第二重染色。用于雙重酶染色的洗脫液有多種,常用的是pH2.2的甘氨酸-鹽酸溶液,能夠消除第一重染色的抗體系統(tǒng)與下一重染色的交叉反應(yīng),但保留顯色反應(yīng)所得的顏色。第七十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日第七十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(二)非洗脫法
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