下一代測序技術(shù)的內(nèi)容概覽

下一代測序技術(shù)的內(nèi)容概覽高通量DNA測序技術(shù)（下一代測序技術(shù)NGS）在過去的15年里已經(jīng)有了快速的發(fā)展，新的方法也在繼續(xù)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。隨著技術(shù)的發(fā)展，對基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)中的相關(guān)應(yīng)用范圍也在增加。這篇綜述的目的是提供一個(gè)對NGS方法論的概述以及相關(guān)的應(yīng)用。每個(gè)簡要的討論之后都跟有制造商和基于網(wǎng)頁的可視化。關(guān)鍵詞搜索，例如用Google，可能也會提供有幫助的網(wǎng)頁鏈接和信息。方法的建立DNA測序方法的建立是Sanger雙脫氧合成法以及Maxam-Gilbert的化學(xué)裂解法。Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法是基于DNA的化學(xué)修飾然后在鄰近修飾過的核苷酸附件的位點(diǎn)進(jìn)一步裂解DNA骨架。Sanger測序采用了特殊的鏈終止核苷酸（雙脫氧核苷酸）它缺少一個(gè)3‘0H連接位點(diǎn)。因此，不能夠在DNA聚合酶的作用下合成磷酸二酯鍵，結(jié)果是正在伸長的DNA鏈在該位置終止了。雙脫氧核苷酸是具有放射性的或者具有熒光標(biāo)記的，便于分別在測序凝膠或者自動測序儀器上識別。盡管原始的Maxam-Gilbert方法的化學(xué)特性已經(jīng)被進(jìn)行修飾來幫助消除有毒性的反應(yīng)物，但是Sanger測序通過合成雙脫氧核苷酸的方法已經(jīng)變成了一種測序的標(biāo)準(zhǔn)。Sanger測序法在1977年被創(chuàng)建，并且在UNIT7.4中被詳盡的描述了。盡管通過當(dāng)前NGS標(biāo)準(zhǔn)測序相對較慢，但是在Sanger末端終止法的改進(jìn)，自動化，以及商業(yè)化這些方面已經(jīng)使它能夠在當(dāng)前的多種應(yīng)用范圍中成為最適當(dāng)?shù)臏y序方法。特別的，超薄的凝膠板電泳已經(jīng)被多通道毛細(xì)血管電泳代替了，逐漸還出現(xiàn)了自動填充可循環(huán)的毛細(xì)血管以及電動樣品加樣這對提高Sanger測序過程的速度與便利性有很大的貢獻(xiàn)。在Sanger測序中已經(jīng)出現(xiàn)的最顯著的創(chuàng)新點(diǎn)有：（1）熒光染色的發(fā)展，（2）采用末端循環(huán)測序降低所要求的輸入DNA的質(zhì)量并且用耐熱聚合酶高效準(zhǔn)確的將終止物染色與正在伸長的DNA鏈結(jié)合起來，（3）解釋和分析序列軟件的發(fā)展。在自動化的Sanger測序項(xiàng)目中的主導(dǎo)者是AppliedBiosystem（AB）。當(dāng)前商業(yè)化的AB測序儀全部使用的是熒光染色和毛細(xì)管電泳（CE）。用于DNA測序或者片段分析協(xié)議的機(jī)器的容量在發(fā)生改變，4組毛細(xì)血管（SeqStudioGeneticAnalyzer），8到24組毛細(xì)管（3500SeriesGeneticAnalyzer），以及48到96組（3700SeriesGeneticAnalyzer）。所以的這些測序儀產(chǎn)生了600-1000個(gè)堿基的正確的序列。盡管多年以來，不同種類基于Sanger測序的測序儀器已經(jīng)被引進(jìn)，包括來自Licor，Amersham，MilliGen，PerkinElmer和Dupont，所以的這些除了AB儀器都已經(jīng)被停產(chǎn)了。Sanger測序技術(shù)在一些應(yīng)用中任然非常有用，而這些應(yīng)用中高通量測序是不被要求的。一些DNA測序的核心設(shè)備和以測序來獲利的公司提供了Sanger測序服務(wù)。對于個(gè)體測序反應(yīng)對公共的用法是在一個(gè)特殊的模板上用特殊的DNA引物，例如去檢驗(yàn)質(zhì)粒的構(gòu)建和PCR產(chǎn)物。既然來自大量的商家的用于DNA純化的分子生物試劑盒和試劑以及相對較高質(zhì)量的合成產(chǎn)物都是可用的，這就使得甚至是相對較大的Sanger測序項(xiàng)目都能夠在合理的時(shí)間框架和成本范圍內(nèi)完成。除了檢測DNA的序列AB儀器上的毛細(xì)管電泳（CE）還被應(yīng)用到測量酶對基于熒光標(biāo)記的DNA底物的選擇活性，列如，可以分析DNA片段的大小。毛細(xì)管電泳同樣能夠用來同時(shí)分析一個(gè)單反應(yīng)中的多個(gè)底物，產(chǎn)物或者反應(yīng)介質(zhì)，通過不同的熒光標(biāo)記。CE被用在DNA聚合酶和DNA連接酶動力學(xué)，以及包括岡崎片段和核糖核苷酸的刪除修復(fù)的偶聯(lián)酶通路的研究中。ABCE在在糖生物學(xué)中也是很有用的，可以用來分析熒光標(biāo)記的多糖。第二代測序方法術(shù)語“下一代”隱含著DNA測序技術(shù)發(fā)展的下一步，同時(shí)也表明將會產(chǎn)生一個(gè)以下一代命名的新技術(shù)。我們更喜歡用下一代，第三代等這些術(shù)語，因?yàn)槲覀円庾R到上述的自動化的AB測序技術(shù)才是繼采用放射性和凝膠板的Sanger測序技術(shù)之后的第二代測序技術(shù)。假定這個(gè)命名的保守性，對大基因組的高通量測序的低成本要求激發(fā)了一些第二代或者下一代測序技術(shù)的發(fā)展，這些技術(shù)除了采用自動化的Sanger測序之外，還用了大量的創(chuàng)新方法。由于自動化Sanger測序技術(shù)的商業(yè)化的實(shí)現(xiàn)，一些技術(shù)不再被使用（例如，Solid,Polinator,Helicos）。這些第二代測序技術(shù)和相關(guān)的方法將在下面進(jìn)行描述。第二代測序技術(shù)能夠被劃分為兩個(gè)主要的類別，通過雜交測序以及通過合成測序（SBS）。SBS方法是Sanger測序的進(jìn)一步發(fā)展，沒有雙脫氧末端，結(jié)合了重復(fù)循環(huán)合成，成像以及不斷將核苷酸加入到伸長鏈中的方法。第一映像，這些新的方法可能會非常昂貴，但是這些反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行都是以納升、微升或者公升的體積在很小的空間內(nèi)進(jìn)行的，因此花在每個(gè)堿基測序上的成本是微不足道的。持續(xù)的精煉和縮小將進(jìn)一步降低成本。關(guān)于成本要注意的一點(diǎn)是：測序完成的成本是多樣化的，一些可能會忽視常規(guī)估計(jì)的每個(gè)“每個(gè)堿基的成本”。試劑成本通常取決于規(guī)定的容量，并且通常是與商家協(xié)商好的。例如，核心機(jī)構(gòu)和測序中心會規(guī)定大量的測序會獲得折扣價(jià)。成本通常不會包含勞動力和最后過程的生物信息分析。然而，一千美元就能測人類基因組這個(gè)目標(biāo)或者降低每個(gè)堿基的成本是測序技術(shù)和研究機(jī)構(gòu)要面對的黃金標(biāo)準(zhǔn)。通過雜交測序這個(gè)方法首先在1980年被發(fā)展起來，將已知序列的DNA的寡核昔酸放在過濾器上，然后與需要測序的DNA的標(biāo)記片段進(jìn)行雜交。通過重復(fù)雜交然后洗掉不是我們需要的未雜交的DNA,這個(gè)步驟可能是要確定雜交標(biāo)記的片段是否與過濾膜上的DNA探針序列相匹配?；趤碜杂谔结橂s交點(diǎn)的重疊信息，因此它可以用來構(gòu)建更大的連續(xù)序列的信息。通過雜交進(jìn)行的測序被很大程度上投入到技術(shù)中，而這些技術(shù)主要依靠于采用特殊的探針去審核序列例如在醫(yī)療診斷方面的應(yīng)用一在特殊的基因中識別與疾病相關(guān)的SNP（單核昔酸多樣性）或者是識別染色體畸變（染色體重排，缺失，加倍，拷貝數(shù)變異（CNV））。通過合成進(jìn)行的測序（SBS）SBS已經(jīng)采取了一些不同的方法。第二代測序的方法通常采用一個(gè)固體的支持物來容納微管道或者槽穴，在這些微管道（槽穴）中進(jìn)行測序反應(yīng)的發(fā)生通常，大部分新的SBS方法不會用雙脫氧末端終止法，盡管在一些技術(shù)中也用到了可逆的終止末端，它能夠允許在對加入的核苷酸進(jìn)行成像的時(shí)候，核苷酸并入反應(yīng)能夠正常進(jìn)行，然后將在標(biāo)記核苷酸上合成的封鎖基團(tuán)移除，從而允許下一個(gè)堿基能夠加入到序列中當(dāng)前的SBS方法不同于原始的Sanger測序的方面主要是它們依賴于大量更短的序列（當(dāng)前的片段大約是300到500bp）進(jìn)一步，他們相比較于Sange測序來說具有本質(zhì)上的gao錯(cuò)誤率，并且，在識別一致序列的基礎(chǔ)上，它們依賴于較高序列覆蓋達(dá)到百萬或者百億的短的DNA測序片段（大規(guī)模平行的測序）作為獲得正確測序的方式然而，對于一些技術(shù)來說，測序背景錯(cuò)誤的發(fā)生不是總能夠通過增加片段的數(shù)量來更正的。例如，當(dāng)DNA包含同一個(gè)堿基的連續(xù)重復(fù)（如AAAAAAAA）時(shí)發(fā)生的均聚物序列。在這種情況下，測序平臺在正確確認(rèn)一致堿基的數(shù)目的時(shí)候就受到了限制每個(gè)平臺都會產(chǎn)生它自己獨(dú)特的一系列潛在的測序背景錯(cuò)誤，用戶們需要意識到這些局限性同時(shí)采用一些配備了不同技術(shù)的平臺通常被用來避免這些問題長序列片段到短序列的轉(zhuǎn)變的技術(shù)現(xiàn)在又朝著產(chǎn)生長原始序列的技術(shù)發(fā)展，在保持這些技術(shù)的大規(guī)模平行測序的同時(shí)這正在第三代測序技術(shù)中發(fā)生，尤其是第四代測序技術(shù)，將在下面進(jìn)行描述這一部分是由于每個(gè)反應(yīng)的成本，也有一部原因是我們想要獲得盡可能長的原始序列來避免測序背景錯(cuò)誤，如重復(fù)的DNA原件。大部分的SBS技術(shù)采用的方法是將要進(jìn)行測序的單個(gè)DNA分子分散在上百萬個(gè)分離的小井或者槽穴中，或者將其固定在固體支持物的特定位置上。DNA分子通過PCR擴(kuò)增或者通過改良的“滾圈”放大的方法進(jìn)行擴(kuò)增，然后用標(biāo)記過的核苷酸進(jìn)行合成反應(yīng)，或者進(jìn)行基于一個(gè)特定核苷酸加入的化學(xué)反應(yīng)，這些核苷酸都是可以進(jìn)行成像或者能被檢測的。大量的創(chuàng)新技術(shù)已經(jīng)被創(chuàng)造出來使得上百萬的DNA測序片段只在一個(gè)簡單的測序過程中就行產(chǎn)生。測序的過程根據(jù)通量可能會持續(xù)數(shù)小時(shí)或者幾天。454焦磷酸測序盡管已經(jīng)被淘汰了，我們依然將這個(gè)技術(shù)當(dāng)做第一種出現(xiàn)在市場上并且采用新技術(shù)的二代測序的方法，名義上，我們叫做焦磷酸檢測，它是一種核苷酸插入的副產(chǎn)物，用來檢測特定的堿基是否被插入到正在伸長的DNA鏈中。單獨(dú)的DNA片段，長度為400到700bp,被固定在特定的轉(zhuǎn)接器上，然后在在一個(gè)獨(dú)立的乳狀液滴中進(jìn)行PCR反應(yīng)。（emPCR）。珠子上的DNA序列與在轉(zhuǎn)換器上的DNA序列互補(bǔ)，能夠允許DNA片段直接結(jié)合到珠子上，理想的情況下，一個(gè)珠子上只有一個(gè)片段。DNA合成之后緊接著進(jìn)行DNA合成反應(yīng)的化學(xué)檢測，化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在以微升計(jì)量的小槽穴中，焦磷酸被釋放之后就可以在里面檢測到。通過不斷的用包含有四種核苷酸中的一種的測序試劑流過小槽穴，當(dāng)正確的核苷酸被插入到合成的鏈中時(shí)，通過光發(fā)生反應(yīng)就可以檢測到焦磷酸的釋放。光的強(qiáng)度同樣提供了包含測序過程中出現(xiàn)的均聚物的信息，盡管在遇到大量同一種核苷酸測序會有一些困難。焦磷酸測序是在瑞典由焦磷酸測序AB發(fā)展起來的，并且隨后被Qiagen獲得，Qiagen在454生命科學(xué)上獲得許可證，而在此之前它是屬于Roche的。454測序儀在2013年停產(chǎn)了，盡管來自于一些供應(yīng)商的實(shí)際還是可以繼續(xù)使用的。454測序儀通常被用來進(jìn)行基因組測序和宏基因組樣本測序，因?yàn)樗軌颢@得較長的測序片段（600到800bp）并且通量相對較高（2500萬堿基，四小時(shí)一個(gè)循環(huán)，正確率達(dá)99%或者更高），促進(jìn)基因組的組裝。IonTorrent（離子激流測序儀）離子激流測序儀在一個(gè)半導(dǎo)體芯片上直接將核苷酸序列轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字信息。在一個(gè)DNA合成反應(yīng)中，在一正在伸長的DNA鏈上，當(dāng)一個(gè)正確的核苷酸被插入到與她互補(bǔ)的堿基的對面時(shí)，一個(gè)氫離子就會被釋放。這改變了溶液的pH值，而pH值的改變可以被離子感受器記錄為電壓的改變，這更像是pH的測量。如果沒有核苷酸被插入，就不會有電壓峰值產(chǎn)生。使只含有四種核苷酸中的一種的測序試劑持續(xù)地流過并小槽穴，然后在洗掉，當(dāng)合適的核苷酸被插入的時(shí)候，電壓就會發(fā)生改變。當(dāng)連個(gè)相鄰的核苷酸插入同樣的核苷酸的時(shí)候，兩個(gè)氫離子會被同時(shí)釋放，電壓的改變就加倍。因此，一個(gè)種單核苷酸鏈的測序也可以被確定。然而，同一核苷酸組成的較大的均聚物鏈有時(shí)是很難被識別到的。離子激流測序反應(yīng)發(fā)生在上百萬個(gè)小槽穴里，上面覆蓋有一個(gè)包含百萬像素的半導(dǎo)體芯片，它能將化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)樾蛄行畔ⅰ榱耸钩绦蜷_始進(jìn)行，DNA被打斷成200到1500bp的片段然后結(jié)合在介面卡上。通過珠子和介面卡上的序列互補(bǔ)，DNA片段被附著在珠子上，然后通過emPCR進(jìn)行擴(kuò)增。這個(gè)過程能夠使上百萬個(gè)珠子每個(gè)都有一個(gè)DNA片段的多個(gè)復(fù)制片段。然后珠子通過包含每個(gè)小槽穴只能容納一個(gè)珠子的芯片，當(dāng)當(dāng)測序試劑流過小槽穴時(shí)，如果正確的核苷酸被插入，就會釋放出一個(gè)氫離子，信號隨之被記錄下來。這個(gè)系統(tǒng)的一個(gè)主要優(yōu)勢是不需要照相機(jī)，光源或者掃描器；核苷酸插入之后可以立刻被轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蜻M(jìn)行直接記錄的電壓，極大地加快了測序的進(jìn)程。離子激流系統(tǒng)由ThermoFisher出售，并且這個(gè)平臺的很多版本都是可用的，包括PGM系統(tǒng)，。。。。。，每個(gè)的通量特性都不同。一個(gè)自動化的文庫和模板準(zhǔn)備系統(tǒng)同樣是可用的。很多應(yīng)用都是被支持的，包括靶向和體外DNA和RNA測序，轉(zhuǎn)錄組測序，微生物測序，拷貝數(shù)量變異檢測，小RNA和MiRNA測序以及CHIp-seq（染色體免疫共沉淀測序）。Illumina技術(shù)到目前為止，在二代測序領(lǐng)域中占主導(dǎo)地位的是Illumina,ta采用的技術(shù)首先由Solexa和LynxTherape開發(fā)出來。Illumina測序是基于橋式擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展起來的，橋式擴(kuò)增技術(shù)就是將DNA分子的每個(gè)末端固定在介質(zhì)面上，然后使擴(kuò)增反應(yīng)在包含有與連接配適器互補(bǔ)的寡核苷酸序列的固體支持物上進(jìn)行（玻璃支持物）。劃片上的寡核苷酸之間嵌入了這樣的DNA,然后接下來進(jìn)行數(shù)輪的擴(kuò)增，每個(gè)寡核苷酸片段形成大約1000個(gè)克隆的克隆簇。每個(gè)玻璃載片能夠承受上百萬個(gè)平行的簇反應(yīng)。在合成反應(yīng)的過程中，所以修飾過的核苷酸都與四種核苷酸中的每一個(gè)一致，每個(gè)都帶有一個(gè)不同的熒光標(biāo)記，這些被修飾過的核苷酸一旦被插入到合成鏈中，就能把檢測到。這種核苷酸同樣也能作為每個(gè)合成反應(yīng)的終止物，但是在檢測完之后能被解除終止進(jìn)而進(jìn)行下一輪的反應(yīng)。反應(yīng)要進(jìn)行300次或者更多的循環(huán)。使用熒光檢測增加了檢測的速率，因?yàn)榭梢灾苯舆M(jìn)行成像，與需要照相機(jī)進(jìn)行成像的過程完全相反。Illumina測序支持不同的測序協(xié)議，包括基因組測序，外顯子組測序和靶向測序，宏基因組測序，染色體共免疫沉淀測序，以及甲基化組檢測。不同的Illumina測序機(jī)制提供的通量水平是不同的，包括。。。。。。。。。。每種儀器的詳細(xì)介紹以及對特殊測序項(xiàng)目的容量可以從網(wǎng)站上尋找。Illumina測序引起的一個(gè)問題是，在所有克隆簇之間的合成反應(yīng)缺乏同步性，使得不能產(chǎn)生正確的一致序列，降低測序的循環(huán)次數(shù)可以克服這個(gè)問題。我們同樣要注意不要在支持物上產(chǎn)生過多的克隆簇，因?yàn)槲覀冃枰獙⒄_數(shù)量的DNA模板正確排列。因?yàn)楫a(chǎn)生的數(shù)據(jù)量很大，要分析從測序過程中產(chǎn)生的測序錯(cuò)誤是要能夠被檢測的，以幫助我們正確區(qū)分真正的序列突變體和測序方案導(dǎo)致的人為錯(cuò)誤。第三代測序（大段分子片段測序）與第二代測序方法不同，第三代測序方法的目的是為長的DNA分子進(jìn)行測序。當(dāng)前在這個(gè)行業(yè)中商業(yè)化的技術(shù)先驅(qū)是PacificBioscience，它已經(jīng)將兩個(gè)測序系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，即原始的RSII模型和最近的Sequel。PacBio測序同樣被當(dāng)成單分子實(shí)時(shí)測序，它使很長的DNA分子片段都能夠被測序，長度為30到50kb，或者更長。SMRT（單分子實(shí)時(shí)測序）方法包括建造一個(gè)設(shè)計(jì)的DNA聚合酶，能夠與被測序的DNA結(jié)合，放置在小槽穴的底部（零模導(dǎo)波，或者ZMW,在一個(gè)SMRT的流通池里）。一個(gè)ZWM是一個(gè)小室，它能夠指引光進(jìn)入到一個(gè)相對于光照波長來說范圍很小的區(qū)域。由于所用光的ZMW設(shè)計(jì)和波長，成像僅僅會發(fā)生在ZMW的底部，在那里DNA聚合酶結(jié)合到DNA上，然后插入每一個(gè)堿基到正在伸長的鏈上。四種核苷酸都被標(biāo)記上不同的連接由磷酸基團(tuán)的熒光標(biāo)記，以便用來進(jìn)行不同的檢測。如果一個(gè)核苷酸被插入到正在合成的鏈中，當(dāng)正確的熒光標(biāo)記的核苷酸被結(jié)合時(shí)成像以毫秒尺度發(fā)生。核苷酸嵌入完成之后，帶有磷酸基團(tuán)的熒光部分被釋放，然后從ZMW的底部流走，并再也不能檢測到。下一個(gè)核苷酸可以被繼續(xù)加入。成像與核苷酸嵌入的比例是同時(shí)的，這樣每個(gè)堿基就能被識別，當(dāng)它被嵌入到正在合成的核苷酸鏈中時(shí)。這同時(shí)發(fā)生在上百萬公式的ZMW中，展示在SMRT細(xì)胞中的一個(gè)單芯片上。在PacBio過程中模板準(zhǔn)備是獨(dú)一無二的，因?yàn)樗婕暗揭粋€(gè)SMRT的所以產(chǎn)物，一個(gè)環(huán)狀的雙鏈DNA分子帶有一個(gè)已知的配適序列能夠與引物互補(bǔ)，用來在模板上起始DNA的合成。這使得聚合酶通過歷遍每個(gè)ZMW中的環(huán)狀分子，次通讀整個(gè)大的模板知道聚合酶停止，這樣能夠形成一致的序列（環(huán)狀一致序列CCS）。當(dāng)配適序列連接到插入的每一側(cè)帶有每個(gè)DNA合成起始位點(diǎn)的時(shí)候，測序酶能夠在另一條DNA鏈上，從5‘端到3‘端歷遍環(huán)狀的SMRTbell，從dsSMRTbell的兩條鏈中都能獲得互補(bǔ)信息。PacBio實(shí)時(shí)測序的一個(gè)重要優(yōu)勢就是成像和檢測過程就是在DNA合成過程中能檢測到的每個(gè)核苷酸添加的速率，稱為插入空格持續(xù)時(shí)間（PD）。大量（不是全部）帶有堿基修飾的核苷酸，列如一些腺嘌呤和胞嘧啶的甲基化，改變了IPD因此能夠被當(dāng)成修飾過的堿基識別。大量不同的修飾都能夠被檢測并且根據(jù)后續(xù)的研究進(jìn)行分類。在這一點(diǎn)上，不是所有的修飾都能夠被識別到，包括m5C，因?yàn)樗斐傻腎PD的修飾很小。然而，通過化學(xué)識別也能夠?qū)崿F(xiàn)這類核苷酸的檢測。PacBioSMRT測序本身就自帶有較高的錯(cuò)誤率，但是通常是可以避免的，由于在每個(gè)SMRTbell模板的ZMW中獲得的片段通量的深度。因?yàn)殄e(cuò)誤是隨機(jī)的而不是系統(tǒng)的，因此多次對模板進(jìn)行測序并且與將個(gè)體序列片段進(jìn)行比對能夠獲得高精確度的CCS片段。進(jìn)一步的,多個(gè)模板的相似序列提供了額外的一致性。PacBioSMRT測序比之前的方法多了一些優(yōu)點(diǎn)。它除了能夠提供大的測序片段以便DNA組裝之外，還能夠快速的識別甲基化位點(diǎn)以便進(jìn)行后續(xù)的研究。列如，采用PacBio技術(shù)能夠相對簡單的組裝一個(gè)完整的細(xì)菌基因組序列，僅僅用一些SMRT小室，而且還能夠確定里面的甲基化模式。通常，PacBio組裝是與其他技術(shù)聯(lián)合使用的，例如Illumina測序，以獲得更高的精確度。就通量而言，PacBioRSII用的是有150000個(gè)ZMW的芯片，當(dāng)經(jīng)最佳使用時(shí)，每個(gè)SMRT小室能夠產(chǎn)生多達(dá)350百萬堿基的序列。采用泊松分布能實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化，以至于每個(gè)小室中只有一個(gè)聚合酶結(jié)合在DNA分子上。最近的PacBio儀器，Sequel，有一百萬個(gè)ZMW并且能夠產(chǎn)生約365000個(gè)片段，平均長度為10――15kb。隨著化學(xué)和技術(shù)的不斷更新(例如磁力珠載體)，以及使用SAGEPippin來分離大的DNA片段，PacBio測序被設(shè)計(jì)提供更多更長以及更精確的測序片段。第四代尖端技術(shù)它可以使長DNA分子穿過小直徑的孔，并且測量不同的通量，當(dāng)每個(gè)核苷酸通過一個(gè)連接的檢測器的時(shí)候。在理論上，超過100kb的DNA分子能夠穿過納米孔，并且有很多通道時(shí)，數(shù)十到數(shù)百Gb的序列能夠以相對較低的成本獲得。兩種類型的納米孔系統(tǒng)正在被發(fā)展用以DNA測序，即生物膜系統(tǒng)和固態(tài)感受器技術(shù)。生物納米孔測序主要依賴于使用跨膜蛋白嵌入到一個(gè)脂膜中，從而產(chǎn)生孔洞。兩個(gè)蛋白質(zhì)被用來產(chǎn)生孔洞，而且已經(jīng)被深入的研究過：a-溶血素和分枝桿菌陰莖垢孔蛋白A(MspA)。DNA從孔中穿過的速率由添加的馬達(dá)蛋白規(guī)定，例如一種高度前景的DNA聚合酶(phi29),在加入核苷酸之后，會使DNA不斷變化。其他配件蛋白，例如一個(gè)DNA解旋酶，核酸外切酶I,或者鏈接到DNA鏈上的寡核苷酸，使解旋和鏈接的DNA核苷酸通過納米孔已進(jìn)行檢測。DNA能夠以成百上千個(gè)核苷酸的連續(xù)速率移動穿過小孔。固態(tài)感受器技術(shù)采用的是不同的材料或者金屬合金支持物，帶有納米級的小孔，使得DNA或者RNA能夠通過。以納米孔為基礎(chǔ)的DNA序列首先在20世紀(jì)90年代提出，然后由帶有一個(gè)便攜式MinION的ONT在最近實(shí)現(xiàn)商業(yè)化,，，，，，，，，，，，，，，這些測序儀用的蛋白質(zhì)納米孔是在一一個(gè)耐電的高分子膜上，當(dāng)每個(gè)核苷酸通過檢測器的時(shí)候，高分子膜的特性就會發(fā)生改變。長的雙鏈DNA分子首先被結(jié)合在一個(gè)前進(jìn)的酶上，例如phi29聚合酶。當(dāng)復(fù)合體通過納米孔的時(shí)候，一個(gè)DNA鏈進(jìn)入納米孔以及通過孔的遷移率被DNA聚合酶的合成以及轉(zhuǎn)移牽制。前進(jìn)的酶能夠使DNA持續(xù)并快速地輕松地穿過它。當(dāng)一個(gè)核苷酸通過小孔，它就打斷了一個(gè)已經(jīng)使用到納米孔的電流。每種核苷酸提供了一種特性的電子信號，能夠被記錄成一個(gè)電流干擾事件。記錄是實(shí)時(shí)的，并且當(dāng)10kb的片段也是合理通過的,在理論上，100kb的DNA能夠通過納米孔并且被檢測到。一旦DNA離開一個(gè)納米孔，這個(gè)小洞對其他不同的DNA分子就是可用的。因?yàn)镸inINO小巧便攜的尺寸，它有可能應(yīng)用到許多領(lǐng)域中，這些應(yīng)用對容量或者空間要求都是非常高的。當(dāng)前的錯(cuò)誤率相對較高，但是由于也使用到其他高通量測序方法，這可以被用大量要被測序的分子來糾正。納米孔技術(shù)已經(jīng)被用到測序環(huán)境和宏基因組取樣中，它當(dāng)前可以在太空站使用，并且已經(jīng)被用來鑒定菌株。病毒基因組，環(huán)境監(jiān)測以及單倍型監(jiān)測已經(jīng)可以通過MinION實(shí)現(xiàn)。內(nèi)米孔技術(shù)同樣能夠用來識別堿基修飾，與PacBio技術(shù)一樣，能夠使后生事件被準(zhǔn)確地識別出來。納米孔測序同樣提供了直接的DNA測序方法，以及不需要PCR的cDNA測序。因此，納米孔測序有潛力提供相對低成本的DNAheadRNA測序，環(huán)境監(jiān)測以及基因組性分析。用于高通量測序和完成大興基因組計(jì)劃的輔助方法光學(xué)映像盡管最近高通量單分子長閱讀片段測序方法遙遙領(lǐng)先，但是，在基因組中，其他的方法也能用來完善或者證明不同DNA片段重疊群的順序。這些方法中最流行的是光學(xué)映射，使用基于序列的核苷酸位置沿長DNA分子分布的標(biāo)記方法。這些方法為將已知的基因定位到基因組圖譜上提供了大量的支架。通過沿著DNA大分子（與限制性酶切位點(diǎn)圖譜的原理一樣）創(chuàng)造一個(gè)可見的物理圖譜，這是一個(gè)可以將DNA序列和物理定位連接起來的方法。這個(gè)方法首先由DavidC創(chuàng)造出來，但是其他的方法學(xué)同樣被用來創(chuàng)造光學(xué)圖譜。納米流體方法，是一種新的方法來使DNA分子中特定位點(diǎn)可視化并識別出DNA分子中的特定位點(diǎn)的方法，并且片段的生物信息學(xué)成像捕獲和分析已經(jīng)在技術(shù)中逐漸得到提升。光學(xué)映像對于完善大的基因組項(xiàng)目（染色體組尺寸重疊簇）以及其他應(yīng)用是非常有用的，例如基因組中的重排現(xiàn)象的識別。它同樣能被用來輔助基因組組裝，基因組結(jié)構(gòu)對比，以及校正基因組組裝的錯(cuò)誤。它也能被用來比較菌株差異性，例如在醫(yī)學(xué)微生物學(xué)中的應(yīng)用。這個(gè)方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是它避免了克隆或者PCR的手動過程，并且可以同時(shí)對一個(gè)單分子進(jìn)行分析。然而，人工操作也可以被引入，因此復(fù)雜的片段可以被用來構(gòu)建一個(gè)連續(xù)的圖譜。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)超越了脈沖場凝膠電泳的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對于創(chuàng)造較大的DNA分子片段染色體圖譜。光學(xué)映像是非常節(jié)約時(shí)間的，并且除了提供片段的大小信息，還提供了路線圖位置能夠被用來構(gòu)建一致的染色體圖譜。通常，光學(xué)映像由將基因組DNA剪切呈大小為100mb到1gb片段大小開始。關(guān)鍵是將這些大的DNA片段在特定的內(nèi)置位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，這樣可以使得標(biāo)記的分子能夠被成像并且與所提供的重疊圖譜在一條線上。一些方法能夠被用來標(biāo)記特殊的基因組位置，包括用限制性單末端或者較少切點(diǎn)的限制性酶消化過的DNA位點(diǎn)，或在特定消化位點(diǎn)消化的一系列酶消化過的DNA位點(diǎn)。標(biāo)記能夠在一個(gè)自由末端上進(jìn)行，可以采用特殊染色的方法，或者采用單鏈裂解酶和高分子染色劑的插入來進(jìn)行酶的填充反應(yīng)。與DNA在特殊位點(diǎn)結(jié)合的酶同樣能夠被采用（例如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶），在該位置，一個(gè)標(biāo)記在結(jié)合之后能夠從酶轉(zhuǎn)移到DNA上。標(biāo)記過的A+T或者C+G富集的DNA位點(diǎn)同樣能夠被使用。結(jié)果片段能夠被連接到玻璃載體的表面或者結(jié)合到細(xì)長的線性管子，采用合適的顯微鏡用來成像。一旦被固定在固體介質(zhì)上，這個(gè)分子就被物理性的進(jìn)行延長。然后它們能夠被按大小進(jìn)行分類，然后對位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，成像，然后記錄，創(chuàng)造一個(gè)分子的光學(xué)圖譜：通過結(jié)合來自于多個(gè)DNA分子的成像，一個(gè)重疊的大的一致的光學(xué)圖譜能夠被制造出來，這個(gè)在之后可以用來當(dāng)做固定其他物理材料，序列或者重疊片段的支架。在這個(gè)領(lǐng)域的商業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者是生物納米基因組。。輔助技術(shù)DNA剪切所有DNA測序方法的關(guān)鍵步驟就是將DNA片段打斷呈特定的尺寸。一些剪切和擴(kuò)增片段DNA的設(shè)備都可以用來分離不同尺寸的DNA，從而用以構(gòu)建文庫。CovarisInc.ShearingC.I提供了一些聲學(xué)的剪切技術(shù)和耗材可以將DNA和RNA打斷成合適的片段大小，用以DNA和片段文庫的準(zhǔn)備（150bp到5kb）并且同樣為染色體和RNA剪切提供了方案。為了將更大的片段分離，他們提供了G-TUBE，主要是致力于將DNA剪切成大片段，平均尺寸在6kb到20kb，這要求在室溫條件下進(jìn)行。g-TUBE與一連串頂端的連續(xù)重疊片段一起發(fā)揮作用，最終DNA片段的尺寸大小是由加速度變化率和離心機(jī)的速率