熒光免疫標(biāo)記技術(shù)

熒光免疫標(biāo)記技術(shù)第一頁，共三十七頁，2022年，8月28日知識目標(biāo)技能目標(biāo)素質(zhì)目標(biāo)1.重點(diǎn)掌握免疫熒光顯微技術(shù)、免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用2.熟悉熒光的基礎(chǔ)知識、熒光免疫分析常用儀器和設(shè)備3.了解熒光抗體的制備1.會使用熒光顯微鏡等常用儀器和設(shè)備2.會用熒光免疫技術(shù)檢測抗原抗體3.能將熒光免疫測定與臨床應(yīng)用相聯(lián)系通過學(xué)生相互鼓勵(lì)、嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真操作，各小組共同協(xié)作完成任務(wù)，培養(yǎng)了與人合作、與人溝通的能力任務(wù)目標(biāo)第二頁，共三十七頁，2022年，8月28日1熒光標(biāo)記物的制備

2熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)3其他熒光免疫技術(shù)任務(wù)對象第三頁，共三十七頁，2022年，8月28日

任務(wù)過程

復(fù)習(xí)提問

案例導(dǎo)入

講解與示教學(xué)生操作討論分析

評價(jià)、考核

課后思考題教學(xué)環(huán)節(jié)2′30′2′10′40′5′1′第四頁，共三十七頁，2022年，8月28日

患兒，男，間斷發(fā)熱五天，伴咳嗽3天。體溫最高39度，病程第2天查血常規(guī)正常，診斷“呼吸道感染”并靜滴“阿奇霉素”3天，無明顯改變，即而出現(xiàn)咳嗽，為陣發(fā)性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：雙肺紋理增粗，右上肺片影。復(fù)查血常規(guī)仍正常。患兒肺部感染系哪種病原體所致？如何快速診斷？案例導(dǎo)入第五頁，共三十七頁，2022年，8月28日老師糾正點(diǎn)評

學(xué)生操作一位學(xué)生操作演示學(xué)生分組再操作第六頁，共三十七頁，2022年，8月28日【主要試劑與器材】1.抗原基質(zhì)片固定有核抗原，可采用小鼠肝組織切片或印片經(jīng)丙酮固定即可。目前有商品化試劑供應(yīng)。2.標(biāo)記抗體FITC標(biāo)記的羊抗人IgG，有商品化試劑供應(yīng)。臨用時(shí)稀釋至工作濃度。。4.緩沖甘油9份甘油和1份PBS混勻。5.待檢血清，陰性、陽性對照血清。6.其它熒光顯微鏡、染色缸、吸管、微量加樣器等。實(shí)驗(yàn)操作第七頁，共三十七頁，2022年，8月28日【操作方法】1.自冰箱中取出抗原基質(zhì)片，平衡至室溫，用記號筆畫圈標(biāo)記。2.將待檢血清和對照血清用PBS作1∶10稀釋，用微量加樣器加50μl待檢血清或?qū)φ昭逵诨|(zhì)片上，水平置于濕盒中37oC溫箱反應(yīng)30min。3.以PBS沖洗抗原基質(zhì)片，再分別浸于盛有PBS染色缸中，反復(fù)漂洗3次，每次5min。4.取出玻片，吹干，加50μl最適工作濃度的標(biāo)記抗體，平置于濕盒內(nèi)，37oC溫箱反應(yīng)30min。

5.重復(fù)步驟3，洗去未結(jié)合的熒光抗體。6.滴加緩沖甘油封片，用熒光顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)操作第八頁，共三十七頁，2022年，8月28日【結(jié)果判斷】1.熒光顯微鏡下見肝細(xì)胞核呈黃綠色，為陽性；反之為陰性。2.根據(jù)熒光分布情況，可分為四種熒光核型：⑴均質(zhì)型:細(xì)胞核呈均勻一致的熒光。⑵周邊型:細(xì)胞核周圍呈現(xiàn)熒光，核中央染色弱或無熒光。⑶斑點(diǎn)型：細(xì)胞核呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光。⑷核仁型：核仁部分呈現(xiàn)熒光。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作第九頁，共三十七頁，2022年，8月28日【注意事項(xiàng)】1.滴加的血清或標(biāo)記抗體應(yīng)充分覆蓋滿抗原片。樣品之間防止交叉污染。反應(yīng)時(shí)應(yīng)置于濕盒內(nèi)，防止干燥。2.每次沖片應(yīng)徹底，防止非特異熒光的干擾。3.熒光受溫度影響較大，不能及時(shí)觀察時(shí)應(yīng)注意低溫避光保存。實(shí)驗(yàn)操作第十頁，共三十七頁，2022年，8月28日【應(yīng)用與評價(jià)】

熒光抗體技術(shù)應(yīng)用較廣，可用于病原微生物鑒定及其抗體的檢測；自身免疫病自身抗體的檢測，免疫細(xì)胞表面抗原的檢測等。此方法檢測ANA，主要用于初步篩查，具有簡便、快速、敏感等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)操作第十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日討論分析提出問題展開討論

用什么可以觀察到熒光？為什么有熒光就能做出診斷？第十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescencetechnique）又稱熒光抗體技術(shù)。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。該技術(shù)的主要優(yōu)缺點(diǎn)主要優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。免疫熒光技術(shù)討論分析第十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日

免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合。

以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體(或抗原)結(jié)合、但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。免疫熒光技術(shù)-基本原理討論分析第十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日

熒光是指一個(gè)分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素是一種可吸收激發(fā)光的光便能產(chǎn)生熒光，并能作為染料使用的有機(jī)化合物，亦稱熒光色素。發(fā)生原理---基態(tài)激發(fā)態(tài)產(chǎn)生特點(diǎn)：激發(fā)---即刻產(chǎn)生停止激發(fā)---瞬間消失種類---光致熒光，化學(xué)熒光，X線熒光，陰極射線熒光討論分析熒光第十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日熒光壽命---熒光物質(zhì)被瞬時(shí)光脈沖激發(fā)后產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用時(shí)間。熒光淬滅---熒光物質(zhì)的熒光輻射能力在受到激發(fā)光較長時(shí)間的照射后發(fā)生的減弱現(xiàn)象。淬滅劑---苯胺、硝基苯、酚等熒光（標(biāo)記）物質(zhì)的保存熒光討論分析第十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日

熒光色素:能夠產(chǎn)生明顯熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物稱為熒光色素或熒光染料。用于標(biāo)記抗體的熒光色素，必須具有化學(xué)上的活性基因，能與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合，且不影響標(biāo)記抗體的生物活性及抗原抗體的特異性結(jié)合。討論分析異硫氰酸熒光素(FITC)第十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日熒光FITC+RB200標(biāo)記討論分析第十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日光源：高壓汞燈、氙燈、鹵素?zé)魹V板：隔熱濾板、激光濾板（UG、BG）、吸收濾板（OG、GG）光路：透射光、落射光熒光顯微鏡討論分析第十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日a透射光b落射光

討論分析第二十頁，共三十七頁，2022年，8月28日

熒光顯微鏡臺式機(jī)---FACSCalibur雙激光---488nm 635nm四熒光參數(shù)分選、濃縮系統(tǒng)討論分析第二十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日大型機(jī)---FACSVantageSE

多激光多波長八熒光參數(shù)高速分選單細(xì)胞點(diǎn)對點(diǎn)分選討論分析第二十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日基本原理---熒光顯微鏡；熒光Ab；標(biāo)本（組織或細(xì)胞中Ag)技術(shù)類型：直接法---熒光素標(biāo)記Ab直接檢測間接法---熒光素標(biāo)記二抗補(bǔ)體結(jié)合法---熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體Ab雙結(jié)合法---兩種熒光素標(biāo)記Ab重點(diǎn)熒光免疫顯微技術(shù)討論分析第二十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日討論分析第二十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日間接免疫熒光檢測自身抗核抗體討論分析第二十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日FALSSensorLaser前向角散射光（FSC）：反映細(xì)胞的大小熒光免疫顯微技術(shù)討論分析第二十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向角散射光（SSC）：反映細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少

熒光免疫顯微技術(shù)討論分析第二十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日雙色直接染色細(xì)胞T細(xì)胞B細(xì)胞熒光免疫顯微技術(shù)討論分析第二十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日直方圖分析：對細(xì)胞的某一個(gè)單參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析橫坐標(biāo)為熒光或散射光強(qiáng)度縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)熒光免疫顯微技術(shù)第二十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日討論分析第三十頁，共三十七頁，2022年，8月28日間接免疫熒光法示意圖討論分析第三十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日熒光免疫顯微技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用：細(xì)菌檢驗(yàn)---細(xì)菌培養(yǎng)物、感染組織、病人分泌排泄物等（菌種鑒定）病毒檢驗(yàn)---特殊意義亦可檢測血清中Ab(間接法)---流行病學(xué)調(diào)查和臨床回顧性診斷寄生蟲檢驗(yàn)---間接法測Ab,如抗瘧Ab、阿米巴Ab等自身Ab檢測討論分析第三十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日配分與評分標(biāo)準(zhǔn)序號考核要點(diǎn)分值評分標(biāo)準(zhǔn)得分12抗原基質(zhì)片，平衡至室溫(2)記號筆畫圈標(biāo)記

待檢血清和對照血清用PBS作1∶10稀釋

(2)微量加樣器50μl待檢血清或?qū)φ昭逵诨|(zhì)片上⑶水平置于濕盒中37oC溫箱反應(yīng)30min11111不符合要求將此分扣除不符合要求將此分扣除考核第三十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日配分與評分標(biāo)準(zhǔn)序號考核要點(diǎn)分值評分標(biāo)準(zhǔn)得分3⑴以PBS沖洗抗原基質(zhì)片(2)浸于盛有PBS染

色缸中⑶反復(fù)漂洗3次⑷每次5min111不符合要求將此分扣除考核第三十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日配分與評分標(biāo)準(zhǔn)序號考核要點(diǎn)分值評分標(biāo)準(zhǔn)得分4⑴取出玻片，吹干(2)

加50μl最適工作濃度的標(biāo)記抗體⑶平置于濕盒內(nèi)，37oC溫箱反應(yīng)30min111不符合要求將此分扣除考核第三十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日序號考核要點(diǎn)