細胞增殖和活力

檢測細胞增殖能力的方法一種是直接的方法，通過直接測定進行分裂的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力。一種是間接的方法，即細胞活力（cellviability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。細胞活力檢測法并不能最終證明檢測樣品中的細胞是否在增殖。如細胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時若采用細胞活力檢測法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細胞數(shù)量，但我們并不能從藥物干擾組細胞數(shù)大于對照組的事實說明藥物可促進細胞增殖的結論。所以最直接的證據(jù)應該采用方法一。第一頁，共23頁。細胞增殖檢測技術直接計數(shù)胸腺嘧啶核苷(3H‐TdR)滲入法5.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)檢測法5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（EdU）羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)檢測法CCK8MTT檢測法ATP檢測第二頁，共23頁。1.直接計數(shù)利用計數(shù)板或計數(shù)儀得出細胞的數(shù)目，然后對數(shù)目進行比較。優(yōu)點：簡單：不需要特定的試劑和儀器準確缺點：不適合樣品數(shù)量多的情況不適合評估特定的亞群第三頁，共23頁。臺盼藍細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結合，使其著色。而活細胞能阻止染料進入細胞內。故可以鑒別死細胞與活細胞。第四頁，共23頁。2.胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)滲入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質。用同位素H標記TdR即H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DNA合成代謝過程，通過測定細胞DNA鏈內標記核苷酸的量的放射性強度，可以反映細胞DNA的代謝及細胞增殖情況。優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復性好。缺點：但需一定設備條件，同時還存在放射性核素污染問題。第五頁，共23頁。3.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)檢測法Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細胞培養(yǎng)加入，而后利用Brdu專一性抗體，顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。BrdU標記很適合免疫組化IHC、免疫細胞化學IC、細胞內ELISA、流式細胞分析和高通量篩選。優(yōu)點：不僅能用于體外實驗，還能用于活體實驗，缺點：就是需要變性DNA后才能與抗體結合，但這就破壞了DNA雙鏈結構，影響了其他染料的結合染色，導致染色彌散，準確性降低等問題第六頁，共23頁。74.5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（EdU）也是一種胸腺嘧啶核苷類似物。它也能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復制的DNA分子，通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應檢測DNA復制活性，通過檢測EdU標記便能準確地反映細胞的增殖情況。EdU檢測染料只有BrdU抗體大小的1/500，在細胞內很容易擴散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測，可有效避免樣品損傷，在細胞和組織水平能更準確地反映細胞增殖等現(xiàn)象。第七頁，共23頁。5.羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)檢測法羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有與細胞特異性結合的琥珀酰亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團，使CFSE成為一種良好的細胞標記物。CFSE進入細胞后可以不可逆地與細胞內的氨基結合偶聯(lián)到細胞蛋白質上。當細胞分裂時，CFSE標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。這樣，在一個增殖的細胞群中，各連續(xù)代細胞的熒光強度呈對遞減，利用流式細胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進行分析。第八頁，共23頁。5.羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)檢測法CFSE能夠輕易穿透細胞膜，在活細胞內聚積并與胞內蛋白共價結合，水解后的CFSE釋放出熒光物質，這些共價結合的熒光物分子很少從細胞內脫落。CFSE標記后的細胞用于體內觀察可以長達數(shù)周。因此，CFSE常被用來做活細胞檢測試驗和用熒光電鏡觀察細胞長期活動的試驗。利用流式細胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進行分析。CFSE標記的細胞的激發(fā)和發(fā)射波長分別為500nm和520nm第九頁，共23頁。6.CCK8檢測法是一種基于WST‐8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測方法。CCK‐8細胞活性檢測試劑中含有WST‐8：2‐(2‐甲氧基‐4‐硝基苯基)‐3‐(4‐硝基苯基)‐5‐(2,4‐二磺酸苯)‐2H‐四唑單鈉鹽]。WST‐8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚產(chǎn)物formazan。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關系。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。第十頁，共23頁。7.MTT檢測法MTT檢測法主要反映細胞的能量代謝，是檢測細胞增殖活力的一種簡便準確的方法。其原理是在活細胞生長和增殖過程中，線粒體內的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的水不溶性的甲瓚(Formazan)，并沉積在細胞中，死細胞無此功能?；罴毎€粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)和細胞活力成正比。MTT方法用于判斷藥物、外源性基因、小RNA、蛋白、抗體、細胞因子、血清等對于細胞的作用，以明確上述因子對于細胞生物學行為的影響（如細胞活力、增殖、凋亡等方面）。第十一頁，共23頁。8.ATP檢測細胞內的ATP含量受到了嚴格調控，檢測ATP也可以得到細胞增殖的信息。死亡細胞或即將死亡的細胞幾乎不含ATP，在細胞溶解物或提取物中測得的ATP濃度與細胞數(shù)之間存在嚴格的線性關系。利用熒光素酶luciferase及其底物熒光素luciferin的ATP檢測以生物發(fā)光為基礎，能夠提供非常靈敏的結果。如果有ATP存在熒光素酶就會發(fā)光，而且其發(fā)光強度與ATP濃度成正比，用能讀取發(fā)光信號的光度計和酶標儀都可以方便的進行檢測。這種方法非常適用于高通量細胞增殖檢測和篩選。第十二頁，共23頁。細胞計數(shù)計算板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按公式計算：細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×104

第十三頁，共23頁。選擇策略怎樣選擇最適合的檢測方法，主要依賴于使用的細胞類型和具體研究方案，還取決于實驗者在細胞增殖中期望得到的信息。假如希望了解細胞增殖中的代謝活性變化，可以使用四唑鹽和比色法檢測；如果關注重點在于對DNA合成的改變，可以選擇用BrdU或EdU標記，再通過比色法、化學發(fā)光或熒光檢測進行分析；若研究的是單個細胞，也可以用BrdU或EdU標記來檢測DNA合成，將其與熒光標記的相應抗體結合，就可以通過流式細胞儀來進行流式分選。第十四頁，共23頁。選擇策略應該注意，測定細胞增殖很多時候單一方法都是有缺陷的，四唑鹽—MTT法不夠精確；最直接的指標是活細胞數(shù)量的變化，結果比較準確，但細胞直接計數(shù)法所需細胞量較多，操作繁瑣費時；而3H摻入法麻煩且不安全。所以，建議最好用兩種以上的方法進行測定，這樣做主要是可以有一個用于輔助修正的數(shù)據(jù)。第十五頁，共23頁。注意事項-選擇適當?shù)眉毎臃N濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。第十六頁，共23頁。注意事項-設置調零孔實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜不同的是對照孔加溶解藥物的介質加藥組加入不同濃度的藥物。每組設定3復孔設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。第十七頁，共23頁。注意事項-藥物濃度的設定一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。第十八頁，共23頁。注意事項-時間點的設定在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。第十九頁，共23頁。注意事項-培養(yǎng)時間200ul的培養(yǎng)液對于10的4~5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48h換液的。

第二十頁，共23頁。注意事項MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定