細(xì)菌分類(lèi)與鑒定實(shí)驗(yàn)室技術(shù)發(fā)展

（一）細(xì)菌分類(lèi)鑒定的指標(biāo)

1.傳統(tǒng)指標(biāo)2.分子生物學(xué)指標(biāo)第一頁(yè)，共26頁(yè)。1.生物分類(lèi)的傳統(tǒng)指標(biāo)形態(tài)特征群體：菌落形態(tài)，在半固體或液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)等；個(gè)體：細(xì)胞形態(tài)，染色反應(yīng)，各種特殊構(gòu)造等。

從不同層次，用不同學(xué)科的技術(shù)方法來(lái)研究和比較不同微生物的細(xì)胞、細(xì)胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)的反映微生物類(lèi)群特征的資料。第二頁(yè)，共26頁(yè)。生理生化反應(yīng)營(yíng)養(yǎng)要求：能源，碳源，氮源，生長(zhǎng)因子等；酶：產(chǎn)酶種類(lèi)和反應(yīng)特性等；代謝產(chǎn)物：種類(lèi)，產(chǎn)量，顯色反應(yīng)等。第三頁(yè)，共26頁(yè)。生態(tài)特性：

生長(zhǎng)溫度，對(duì)氧的需要，宿主種類(lèi)等；生活史特點(diǎn)：

在生活史中出現(xiàn)的菌體變化特點(diǎn)及其規(guī)律性；血清學(xué)反應(yīng)：

利用抗原構(gòu)造上的差別進(jìn)行鑒定；噬菌體的敏感性；其他第四頁(yè)，共26頁(yè)。2.生物分類(lèi)的分子生物學(xué)指標(biāo)DNARNA第五頁(yè)，共26頁(yè)。染色鏡檢形態(tài)觀察按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定標(biāo)準(zhǔn)化成品鑒定產(chǎn)品（如：API試劑條）

半自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（如：ATBExpression）全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（如：VITEK2）色譜、光譜分析技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)1.生理生化檢測(cè)技術(shù)2.色譜、光譜分析技術(shù)3.分子生物學(xué)技術(shù)（二）細(xì)菌分類(lèi)鑒定的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)第六頁(yè)，共26頁(yè)。人工鑒定培養(yǎng)基的微量化、標(biāo)準(zhǔn)化和商品化數(shù)碼分類(lèi)鑒定技術(shù)（生化反應(yīng)的數(shù)字化）自動(dòng)化鑒定技術(shù)（生物信息的電腦化）細(xì)菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)都實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化1.生理生化檢測(cè)技術(shù)第七頁(yè)，共26頁(yè)。前期準(zhǔn)備增菌劃線分離染色鏡檢血清手工細(xì)菌鑒定手工鑒定流程第八頁(yè)，共26頁(yè)。

1）

臨床常見(jiàn)菌的初步分群雙岐索引鑒定

例如：葡萄球菌屬雙岐索引鑒定第九頁(yè)，共26頁(yè)。早在七十年代中期，一些國(guó)外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細(xì)菌的新方法。這些技術(shù)的應(yīng)用，為醫(yī)學(xué)微生物檢驗(yàn)工作提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、科學(xué)的細(xì)菌鑒定程序，大大提高了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。目前，微生物編碼鑒定技術(shù)已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，并早已商品化和形成獨(dú)特的不同細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系統(tǒng)。這種鑒定系統(tǒng)是自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)的基礎(chǔ)。2）數(shù)碼鑒定法第十頁(yè)，共26頁(yè)。

數(shù)碼鑒定是指通過(guò)數(shù)學(xué)的編碼技術(shù)將細(xì)菌的生化反應(yīng)模式轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)模式，給每種細(xì)菌的反應(yīng)模式賦予一組數(shù)碼,建立數(shù)據(jù)庫(kù)或編成檢索本。通過(guò)對(duì)未知菌進(jìn)行有關(guān)生化試驗(yàn)并將生化反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字（編碼），查閱檢索本或數(shù)據(jù)庫(kù)，得到細(xì)菌名稱(chēng)。

其基本原理是計(jì)算并比較數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)每個(gè)細(xì)菌條目對(duì)系統(tǒng)中每個(gè)生化反應(yīng)出現(xiàn)的頻率總和。數(shù)碼鑒定法基本原理第十一頁(yè)，共26頁(yè)。微量生化反應(yīng)系統(tǒng)Micro-ID系統(tǒng)VP硝酸鹽還原

苯丙氨酸脫羧酶硫化氫吲哚鳥(niǎo)氨酸賴(lài)氨酸丙二酸鹽尿素七葉甘ONPG阿拉伯糖側(cè)金盞花醇肌醇三梨醇421421421421421—+——+++——

—

+

+

+——

020021400021400

234

3

4相加所得數(shù)字：23434查出相應(yīng)細(xì)菌為：大腸埃希菌項(xiàng)目分值數(shù)碼鑒定法基本原理第十二頁(yè)，共26頁(yè)。先將細(xì)菌分離純化。做染色形態(tài)觀察、氧化酶、糖發(fā)酵試驗(yàn)。根據(jù)染色、氧化酶、糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果選擇不同的生化反應(yīng)板進(jìn)行接種（同一個(gè)鑒定系統(tǒng)，配有不同細(xì)菌的生化反應(yīng)板）。培養(yǎng)后，讀取生化反應(yīng)結(jié)果，得到一組數(shù)據(jù)。將這組數(shù)據(jù)查編碼本（即數(shù)據(jù)庫(kù)），即得到鑒定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方法：數(shù)碼鑒定法基本原理第十三頁(yè)，共26頁(yè)。3）自動(dòng)化的微生物鑒定和藥敏試驗(yàn)分析系統(tǒng)

細(xì)菌數(shù)碼分類(lèi)技術(shù)是細(xì)菌自動(dòng)化鑒定技術(shù)的基礎(chǔ)，細(xì)菌鑒定自動(dòng)化是把生化反應(yīng)數(shù)字化技術(shù)進(jìn)一步電腦化，數(shù)據(jù)庫(kù)用電腦管理，結(jié)果用電腦分析和鑒定。

鑒定系統(tǒng)的工作原理因不同的儀器和系統(tǒng)而異。不同的細(xì)菌對(duì)底物的反應(yīng)不同是生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌的基礎(chǔ)，而試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度取決于鑒定系統(tǒng)配套培養(yǎng)基的制備方法、培養(yǎng)物濃度、孵育條件和結(jié)果判定等。大多鑒定系統(tǒng)采用細(xì)菌分解底物后反應(yīng)液中pH的變化，色原性或熒光原性底物的酶解，測(cè)定揮發(fā)或不揮發(fā)酸，或識(shí)別是否生長(zhǎng)等方法來(lái)分析鑒定細(xì)菌。第十四頁(yè)，共26頁(yè)。對(duì)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行鑒定與藥敏測(cè)試全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏檢測(cè)系統(tǒng)第十五頁(yè)，共26頁(yè)。檢測(cè)流程純培養(yǎng)新鮮平板上挑取菌落制成標(biāo)準(zhǔn)濁度（0.5~0.6麥?zhǔn)蠁挝唬┑木鷳乙壕杭尤肴鉁?，倒入檢測(cè)板，上機(jī)檢測(cè)。第十六頁(yè)，共26頁(yè)。檢測(cè)流程掃描板條，輸入資料，等待鑒定結(jié)果。檢測(cè)流程第十七頁(yè)，共26頁(yè)。挑選菌落樣品制備于樣品盤(pán)上菌種鑒定結(jié)果未知微生物?

MALDI

BioTyper軟件-數(shù)據(jù)庫(kù)分析獲取質(zhì)譜指紋信號(hào)以蛋白為基礎(chǔ)的分析方法(Proteinbasedapproach)1.樣品制備2.質(zhì)譜信號(hào)3.菌種鑒定2.質(zhì)譜分析的細(xì)菌鑒定流程第十八頁(yè)，共26頁(yè)。直接涂抹法(DirectTransfer)單一菌種(Pureculture)涂抹單一菌落于樣品盤(pán)上(SinglecolonyonMALDI)Target加上1

ml基質(zhì)溶液(Overlaywith1mlHCCAMatrix)90-95%以上的常規(guī)樣品可于此制備法得到鑒定結(jié)果步驟1：樣品制備第十九頁(yè)，共26頁(yè)。4364.065380.646254.646315.495096.017157.657273.876410.907870.628368.99010002000300040005000Intens.[a.u.]400045005000550060006500700075008000m/z質(zhì)譜圖:多數(shù)為核糖體蛋白(ribosomalproteins)信號(hào)大腸桿菌

(E.coli)步驟

2：采集譜圖第二十頁(yè)，共26頁(yè)。Calculationofamatchingscorebasedon:RelScore

%matchesofthereferencespectrum (e.g.6/10=0.6)

RelP-Num.

%matchesoftheunknownspectrum (e.g.6/20=0.3)I-Corr.

valueofintensitycorrelationUnknownmicroorganismismatchedagainsteachMainspectruminbiotyperlibrary.Rankingaccordingtomatchingscore,thresholdforIDMSP:MainSpectrumPeaks步驟

3：數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)第二十一頁(yè)，共26頁(yè)。ResultReport|DetectedSpecies|Ranking|actSc|maxSc|RelScore|PNk|PNb|PNm|RelP-Num.|I-Corr.|1000*Pro---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Spectrum#12|Ps.mendocinaDSM50017|1|3813|4271|0.89|41|10|83|0.55|0.88|438|Ps.oleovoransB396|2|1671|3450|0.48|14|8|83|0.22|0.39|41|Ps.fluoreszensB340|3|868|4186|0.21|6|7|83|0.11|0.19|4|Ps.veroniiDSM11331|4|847|4250|0.20|5|7|83|0.10|0.14|3|Ps.putidaDSM291|5|374|2821|0.13|3|3|83|0.05|0.12|1|Ps.putidaB401|6|329|2638|0.12|3|2|83|0.05|0.11|1譜圖模式比對(duì)進(jìn)行細(xì)菌鑒定第二十二頁(yè)，共26頁(yè)。得分范圍分?jǐn)?shù)的解釋2.300-3.000highlyprobablespeciesidentification完全可靠地鑒定到種的水平2.000-2.299securegenusidentification,probablespeciesidentification可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平1.700-1.999

probablegenusidentification有可能鑒定到屬的水平0.000-1.699

noreliableidentification沒(méi)有可信的鑒定結(jié)果微生物鑒定得分及含義第二十三頁(yè)，共26頁(yè)。24MALDIBiotyper

1樣品

~5分鐘96樣品(整盤(pán))~30分鐘生化反應(yīng)測(cè)試鑒定法8小時(shí)–數(shù)天CanIidentifymicroorganisms

fast

?第二十四頁(yè)，共26頁(yè)。Acetobacteracetisubsp.acetiAcetobacterpasteurianussubsp.lovaniensisAcetobacterpasteurianussubsp.pasteurianusActinomaduraaurantiacaActinomaduralibanoticaActinomaduralividaAgrobateriumtumefaciensArthrobacterglobiformisArthrobacteroxydansArthrobacterpyridinolisArthrobactersulfureusBacillusalcalophilusBacilluscohniiBacillussphaericusBrevibacillusbrevisBrevibacteriumlinensCellulomonasflavigenaCellulomonasturbataCorynebacteriumglutamicumComamonastestosteroniiGluconobacteroxydanssubsp.oxydansGluconobacteroxydanssubsp.oxydansGordoniaamaraeGordoniarubropertinctaGordoniaterraeHalomonasdenitrificansHalomonaselongataHalomonaselongataHalomonashalmophilaHalomonashalmophilaHydrogenophagaflavaHydrogenophagapseudoflavaMethylobacteriummesophilicumMethylobacteriumorganophilumMethylobacteriumradiotoleransMethylobacteriumrhodesianumParacoccusversutusParacoccusversutusPseudomonasbalearicaPseudomonasfluorescensPseudomonasfluorescensPseudomona