雙向電泳技術(shù)

雙向電泳技術(shù)1第1頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五*1809年俄國物理學家Peйce首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。

*1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。

他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。

*1937年瑞典Uppsala大學的Tiselius對電泳儀器作了改進，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開拓性貢獻而獲得了1948年的諾貝爾化學獎。

*1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對氨基酸的分離進行過研究。

*從上世紀50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。

*1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代。

*由80年代發(fā)展起來的新的毛細管電泳技術(shù)，是化學和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。

*雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1000個E.coli蛋白。

2第2頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五一、電泳的基本原理1、在電場作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的方向移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis)。由F=Eq，f=6πrυ

η可得υ=Eq/(6πrη)2、帶電顆粒的泳動速度同電場強度和分子本身所帶的凈電荷量成正比，與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比。蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。其泳動速度取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量以及顆粒的大小和形狀。第一節(jié)蛋白質(zhì)電泳的基本原理3第3頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷(種類和數(shù)量)、大小和形狀，在一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進行分離、分析和鑒定的基本原理。4第4頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五二、影響電泳速度的因素

1、電場強度；2、緩沖溶液的pH；3、緩沖溶液的離子強度；4、電滲；5、焦耳熱三、電泳的分類

按原理分類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應用。穩(wěn)態(tài)電泳（或稱置換電泳）：分子顆粒的電泳遷移在一定時間達到一個穩(wěn)態(tài)后，帶的寬度不隨時間而變化。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。5第5頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五6第6頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。7第7頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)。8第8頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層電泳、板電泳、柱電泳。根據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量電泳、免疫電泳。按pH的連續(xù)性不同，可分為：連續(xù)pH電泳，不連續(xù)pH電泳。9第9頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五四、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。PAGE應用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點等。10第10頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五1、丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點：①幾乎無電滲作用。②化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應。對pH和溫度變化較穩(wěn)定。?在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無色透明，有彈性，機械性能好，易觀察。?凝膠孔徑可調(diào)。?分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，因而有更高的分辨率。11第11頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五2、聚丙烯酰胺凝膠的聚合12第12頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五催化劑和加速劑的種類①AP-TEMED：化學聚合作用。加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的堿基可使催化劑過硫酸銨(簡稱AP)的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活Acr單體，形成單體長鏈，在交聯(lián)劑Bis作用下聚合成網(wǎng)狀的凝膠。②核黃素-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能發(fā)生，因為核黃素在TEMED及光照條件下，還原成無色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。13第13頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五14第14頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五丙烯酰胺會產(chǎn)生如下幾個化學反應：?高濃度酸和堿會促進其水解形成丙烯酸和NH3。?與一些羥基化合物如酚或酯族醇反應，生成β-芳氧基或烷氧基丙酰胺。?在20℃能NH3反應，生成β、β′、β″-氮川三丙酰胺。?與一些硫醇反應，生成β-烷基丙酰胺。?也會由于超聲、γ-射線和自然光線引起聚合作用。如果烴鍵靠近在高度聚合的位置，酰胺基也會受到分子間的縮聚作用而成亞胺橋。15第15頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五凝膠的孔徑可調(diào)性及其他性質(zhì)?每100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，用T%表示；T%=(a+b)/m?a：丙烯酰胺克數(shù)；b：N,N-甲叉雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積(毫升)。3、聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑：16第16頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五17第17頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五濃縮效應18第18頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五聚丙烯酰胺凝膠電泳的異常現(xiàn)象及解決辦法1.凝膠未聚合2.未加水層時凝膠聚合3.電泳后未能檢測出樣品4.樣品分離區(qū)帶寬或拖尾5.只顯一條區(qū)帶6.分離區(qū)帶呈條紋狀19第19頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)蛋白質(zhì)等電聚焦電泳1966年，瑞典科學家Rible和Vesterberg建立。等電聚焦：isoelectricfocusing,IEF。1.電泳系統(tǒng)中加進兩性電解質(zhì)載體，當通直流電時，兩性電解質(zhì)載體即形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。蛋白進入時，不同的蛋白移動到與其等電點相當?shù)膒H位置上，從而使不同等電點的蛋白得以分離。2.優(yōu)點：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測定蛋白或多肽的等電點。3.缺點：需無鹽溶液，不適用于在等電點不溶解或發(fā)生變性的蛋白。20第20頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五

利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子等電點的不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的（或非線性）pH梯度中進行蛋白質(zhì)的分離和分析。分析對象只限于蛋白質(zhì)和其他兩性分子。根據(jù)建立pH梯度原理不同，可分為載體兩性電解質(zhì)pH梯度（carrierampholytepHgradient)和固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)。21第21頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五一、基本原理1、蛋白質(zhì)的等電點：取決于其氨基酸的組成。

組成每一種蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸的數(shù)目和比例是不同的，故蛋白質(zhì)的等電點范圍很寬，這使得可以利用它來分離和分析蛋白質(zhì)。

22第22頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五2、聚焦效應3、等電聚焦的分辨率23第23頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五二、載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳1、載體兩性電解質(zhì)應具備的條件在等電點處有足夠的緩沖能力，以便能控制pH梯度，而不致被樣品的緩沖能力而改變pH梯度。在等電點處有足夠高的電導，以便使一定的電流通過，具備不同pH的載體有相同的電導系數(shù)，是整個體系中的電導均勻。分子質(zhì)量小，便于與被分離的高分子物質(zhì)分離?；瘜W組成不同于被分離物質(zhì)，不干擾測定。應不與分離物質(zhì)反應或使之變性。

由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備(有不同pH范圍的商品兩性電解質(zhì)載體)24第24頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五2、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的形成有兩種方法產(chǎn)生pH梯度：用兩種不同的pH的緩沖液互相擴散，在混合區(qū)形成pH梯度。這種方法形成的pH梯度很不穩(wěn)定，重復性差，現(xiàn)已不使用。人工pH梯度。利用載體兩性電解質(zhì)在電場作用下自然形成pH梯度，常用該方法。天然pH梯度。25第25頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五3、載體兩性電解質(zhì)分離原理等電聚焦樣品可放于任何位置。4、載體兩性電解質(zhì)的缺點載體兩性電解質(zhì)合成過程復雜，影響蛋白質(zhì)點的位置，從而影響了重復性；負極漂移現(xiàn)象，使pH梯度不穩(wěn)定；負極漂移現(xiàn)象使堿性蛋白質(zhì)無法聚焦；凝膠灌制重復性差，凝膠機械穩(wěn)定性差，影響重復性。5、等電聚焦中應注意的事項pH梯度的選擇；添加中性載體兩性電解質(zhì)；電流降到最小切恒定時盡快結(jié)束IEF;pH梯度測定：電泳結(jié)束后，用微電機檢測凝膠表面pH;蛋白質(zhì)在pI處形成沉淀。添加表面活性劑。26第26頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五三、固相pH梯度等電聚焦電泳技術(shù)

固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術(shù)。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。27第27頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五1、固相pH梯度的介質(zhì)其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，它們與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有相似的聚合行為。28第28頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五2、固相pH梯度的建立

固相pH梯度等電聚焦技術(shù)的突破要歸功于Immobilines試劑（AmershamPharmaciaBiotech,APB）的基礎(chǔ)上開發(fā)的固相pH梯度（IPG）技術(shù)。Immobilines（固相試劑）是一系列性質(zhì)穩(wěn)定的具有弱酸弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有類的聚合行為。每個分子都有一個單一的酸性或堿性緩沖基團與丙烯酰胺單連，其結(jié)構(gòu)式為：

其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的雙鍵可以在聚合過程中共價鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質(zhì)中。所以它是固相的，即使是在電場中也不會漂移。分子另一端的R基團為弱酸或弱堿性的緩沖基團，利用緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可形成近似線性的分布在pH3～10范圍的緩沖體系。所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后才形成pH梯度。29第29頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五固相pH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團

30第30頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五4、固相pH梯度的優(yōu)點和注意事項3、固相pH梯度等電聚焦原理蛋白質(zhì)分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中遷移，知道達到自己的等電點，停止遷移。固相pH梯度可窄至pH0.1的范圍，因此分辨率極高，可達0.001pH；pH梯度穩(wěn)定，不漂移；靈活性大，可隨意選擇pH梯度和斜率；重復性好；加樣容量大；樣品中鹽的干擾?。粚A性蛋白質(zhì)也能很好的分離，無邊緣效應，故可用很窄的膠條（如5mm寬）聚焦，特別適合于雙向電泳的第一相，但固相pH梯度灌膠技術(shù)復雜，只能使用聚丙烯酰胺凝膠，電泳時候需要高電壓，電泳時間長，窄范圍pH測定困難，只能計算。注意事項：溫度：20-30℃；電壓：梯度上升。31第31頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五加樣方式

32第32頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五等電聚焦電泳進行過程中等電聚焦電泳結(jié)束后（－）（－）高pH高pH低pH低pH33第33頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳一、常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳1、基本原理:天然狀態(tài)生物大分子聚丙烯酰胺凝膠電泳（nativePAGE）,在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中分離蛋白質(zhì)。可得到天然蛋白質(zhì)的分子量。34第34頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五連續(xù)電泳不連續(xù)電泳濃縮效應凝膠層緩沖液離子成分pH電位梯度濃縮效應電荷效應分子篩效應35第35頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五2、影響凝膠聚合的因素形成凝膠試劑的純度凝膠濃度溫度和氧氣的影響：23-25℃3、聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點36第36頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五二、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1、基本原理聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulphate)SDS，蛋白電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無關(guān)。加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使蛋白的二硫鍵還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到P分子上，形成蛋白-SDS，帶上相同密度負電荷，形狀為長橢圓形，短軸一定，長軸長度正比于蛋白分子量。分離測定：測分子量(與標準蛋白比較)鑒定樣品純度(條帶數(shù)目)測定樣品蛋白含量：掃描定量(比色)

37第37頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的影響因素溶液中SDS單體的濃度二硫鍵是否完全還原緩沖系統(tǒng)的選擇凝膠濃度的選擇38第38頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五凝膠電泳的操作要點1.凝膠制備2.電極緩沖液3.樣品處理及加樣4.電泳5.染色與固定6.脫色7.分析39第39頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五？pH值不對=40第40頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五第四節(jié)雙向電泳一、基本原理

IEF-SDS41第41頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五非變性2D：兩向均在非變性條件下進行，這樣分離的蛋白質(zhì)點的等電點和表觀分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是一樣的；非變性/SDS-2D：第一向采用非變性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進行。適于分析非共價鍵連接的蛋白－蛋白間的相互作用。非變性/還原/SDS-2D：非變性條件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS進行平衡，再進行第二向SDS-PAG電泳。此時分離的蛋白質(zhì)點可進行點的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。變性2D：樣品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃變性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40條件下進行，之后膠條用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后進行SDS。該技術(shù)適于DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析，或分析被碳氫鍵連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于100Kd的蛋白質(zhì)點少于第三種方式雙向電泳的分類42第42頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五二、流程（一）樣品制備（二）第一向：等電聚焦1、加樣2、運行（三）膠條的平衡（四）第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（五）膠上蛋白的檢測1、考馬斯亮藍染色2、銀染3、負染4、熒光染色43第43頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五（六）雙向電泳凝膠的檢測

1、目測2、自動化檢測3、雙向電泳的數(shù)據(jù)庫（七）雙向凝膠電泳技術(shù)當前面臨的挑戰(zhàn)：1、低拷貝蛋白的檢測受限；2、極酸或極堿蛋白的分離較難；3、分子質(zhì)量極大或極小蛋白的分離較難；4、難溶蛋白的檢測較困難；5、得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù)44第44頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五一維固相pH梯度等電聚焦（IEFwithIPG）：

IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的IEF分離達到真正的平衡狀態(tài)。45第45頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五IPG膠條的重泡脹泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進入IPG內(nèi)，從而能進行接下來的IEF。不同的加樣方法和加樣量會導致最終結(jié)果的差異：ProteanIEFcell、IPGphor等集成設(shè)備的使用：20mmol/LDTT墊片的使用：溫度的選擇：46第46頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五蛋白載樣量影響IPG膠條對蛋白載樣量的因素包括：待分析的蛋白點的量應滿足隨后的質(zhì)譜分析。電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。待研究蛋白的豐度：樣品的復雜度：復雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復實驗才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。IPG膠條的pH范圍：47第47頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100g/125l200~500ug/125l11cm50~200g/185l250~1000ug/185l17cm100~300g/300l1~3mg/300l48第48頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五IPGIEF中pH梯度的選擇

常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預試驗確定。49第49頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五預分步收集細胞漿細胞核細胞膜核糖體及其他特定細胞成份細胞分泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第二步第三步用窄pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白陣列那些亞細胞定位位置的功能蛋白質(zhì)3倍3倍亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖50第50頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五聚焦時間的優(yōu)化

理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復性所需最佳時間是IEF分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦時間太短，會導致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。51第51頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五IEF的基本條件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid52第52頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五兩維間的平衡

一維結(jié)束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS時電泳能順利進行。建議方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。如果用TBP代替DTT則只需一步平衡。53第53頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為在IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認為非限制性IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當了濃縮膠。54第54頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩(wěn)定（stability）：兼容性（synergy）：55第55頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五有機染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍染色技術(shù)可實現(xiàn)PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會對蛋白質(zhì)進行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺點是：對某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對其后的蛋白質(zhì)測序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。56第56頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五負染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點透明。速度快（5~15min），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡合金屬離子就可進行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。57第57頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五膠體擴散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似。這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。58第58頁，共67頁，2023年，2月20日，星期五有機熒光團染料包括共價結(jié)合和非共價結(jié)合的熒光團染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標準的實驗室300nm紫外透射儀進行照像保存，其線性范圍為3個數(shù)量級。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過SAGE所獲得的基因表達水平的動態(tài)范圍相匹配。在Tris/