微生物遺傳育種課件基因重組與育種

微生物遺傳育種課件基因重組與育種第1頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第2頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

重組與突變的不同點(diǎn)：

突變是指一個(gè)細(xì)胞的同一個(gè)基因組中某一點(diǎn)或某一DNA片段發(fā)生的變異；而重組是來(lái)自兩個(gè)細(xì)胞的不同基因組間遺傳物質(zhì)交換的結(jié)果，重組可在微生物細(xì)胞不發(fā)生突變的情況下形成新的基因型與表型。第3頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六雜交（Hybridization）:是指不同基因型的親本個(gè)體或細(xì)胞（指單細(xì)胞生物）交配而產(chǎn)生子代的過(guò)程。重組是分子水平上的概念，而雜交是細(xì)胞水平上的概念。雜交中必然含有重組，但重組則不限于雜交這一種形式。第4頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第一節(jié)細(xì)菌、放線菌的接合及育種一、細(xì)菌的接合作用

接合（Conjugation）：指供體菌與受體菌的完整細(xì)胞經(jīng)過(guò)直接接觸而傳遞大段DNA（包括質(zhì)粒）遺傳信息的現(xiàn)象。第5頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（一）接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1946年，J.Lederberg和E.L.Tatum將來(lái)自E.coliK12的兩種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株混合培養(yǎng)，其遺傳標(biāo)記如圖。結(jié)果在單獨(dú)培養(yǎng)的平板上無(wú)菌落，而在混合培養(yǎng)的平板上長(zhǎng)出了原養(yǎng)型菌落。第6頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六對(duì)接合現(xiàn)象的解釋?zhuān)海?）可能是細(xì)菌接合后發(fā)生基因重組的結(jié)果；（2）細(xì)菌并沒(méi)有接合，而是交換了DNA（轉(zhuǎn)化）；（3）細(xì)菌細(xì)胞并沒(méi)有接合，而是通過(guò)培養(yǎng)基交換了養(yǎng)料，即互養(yǎng)；（4）細(xì)菌細(xì)胞并沒(méi)有接合，而是親本細(xì)菌發(fā)生了回復(fù)突變的結(jié)果；（5）雖經(jīng)接合而未發(fā)生基因重組，只是形成異核體或雜合二倍體。第7頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）接合作用的證明1、轉(zhuǎn)化作用的排除由于在報(bào)道接合試驗(yàn)結(jié)果之前轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)已經(jīng)是眾所周知，因此有人懷疑該結(jié)果是由轉(zhuǎn)化所導(dǎo)致的。1950年，B.D.Davis設(shè)計(jì)了U形管實(shí)驗(yàn)否定了這一推測(cè)（見(jiàn)右圖）第8頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、互養(yǎng)的排除營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌通過(guò)培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而產(chǎn)生的現(xiàn)象稱(chēng)為互養(yǎng)。Lederberg和Tatum將培養(yǎng)過(guò)一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)滅菌、過(guò)濾，然后加入到另一營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌培養(yǎng)物中。即使前一種菌在培養(yǎng)、滅菌、過(guò)濾之前曾發(fā)生過(guò)裂解，也不能是后一種菌產(chǎn)生原養(yǎng)型。第9頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、回復(fù)突變的排除若要發(fā)生兩種突變的回復(fù)突變，其幾率為10－12，這是不可能的。第10頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4、異核體和雜合二倍體的排除A＋B—A—B＋A＋B—A—B＋A＋B＋異核體雜合二倍體單倍重組體異核體和雜合二倍體的遺傳性狀不穩(wěn)定，在傳代過(guò)程中會(huì)發(fā)生性狀分離，但事實(shí)恰恰相反，原養(yǎng)型菌落的基因型是穩(wěn)定的，證明是單倍重組體。第11頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（三）接合的機(jī)制1、接合作用中兩菌株性別的存在Lederberg和Tatum認(rèn)為在兩個(gè)細(xì)菌的親本細(xì)胞在接合過(guò)程中起同等作用—即E.coli的性系統(tǒng)被認(rèn)為是同宗配合。1952年，W.Hayes利用Lederberg和Tatum所做的雜交實(shí)驗(yàn)，對(duì)（A）Met－Bio－（Sms或Smr）×（B）Thr－Leu－B1－（Smr或Sms）進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在雜交期間，兩品系所起的作用是不同的，是一種單向異宗配合過(guò)程，兩品系在獲得的同時(shí)發(fā)生了性別的變化。其中，供體品系相當(dāng)于雄性，而受體品系相當(dāng)于雌性。第12頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、F因子的存在（1）E.coli的某些種（如品系A(chǔ)）記為F＋，帶有一個(gè)性因子，或致育因子F（fertilityfactor），而另一個(gè)不育型品系記作F－，記不帶有性因子；（2）雜交F＋×

F－是可育的，雜交F－×

F－是不育的；（3）F因子可以傳遞，從F＋到F－細(xì)菌，但必須通過(guò)細(xì)胞接觸；（4）F因子能夠自發(fā)喪失，一旦喪失就不再恢復(fù)，除非通過(guò)另一個(gè)F＋細(xì)胞在傳遞過(guò)來(lái)。F＋細(xì)胞經(jīng)低濃度的吖啶橙處理后喪失F因子，也會(huì)偶爾自發(fā)地或經(jīng)紫外線處理喪失。第13頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、F因子及F＋細(xì)胞的特性F＋是一種可遺傳性狀，能夠自我復(fù)制，類(lèi)似于染色體基因，但不是染色體基因，其轉(zhuǎn)移的頻率可高達(dá)70％以上。

F因子是獨(dú)立于染色體外的小型環(huán)狀DNA分子，具有自體復(fù)制及轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中去的能力。大小約是細(xì)菌基因組DNA的2％，分子量為6.3×106d、94.5kb。整個(gè)基因組編碼94個(gè)蛋白質(zhì)，其中1／3的基因與接合作用有關(guān)。第14頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

F因子基因組有三個(gè)主要的基因叢，分別負(fù)責(zé)插入、復(fù)制和轉(zhuǎn)移的功能。A.轉(zhuǎn)移區(qū)（Transfer-region）：是一個(gè)操縱子，由22個(gè)基因組成，33kb，位于F因子結(jié)構(gòu)圖的60～93kb之間。其中，traJ、A、L、E、N、B、W、V、C、U、F、H這些基因與性菌毛的合成與裝配有關(guān)；traY、Z、M、I、G、D等基因產(chǎn)物與DNA的轉(zhuǎn)移有關(guān)；traG和traN的基因產(chǎn)物與細(xì)菌結(jié)合有關(guān)；traS和traT的基因產(chǎn)物與表面排斥有關(guān)。第15頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六B.復(fù)制區(qū)（replication-region）：位于F因子結(jié)構(gòu)圖譜的40～49kb，包含一個(gè)特異的復(fù)制蛋白基因frp（Freplicationproteins）、決定不相容性基因inc（incompatibility）和一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)oriV（vegetativeoriginofreplication）。C.插入?yún)^(qū)（insertionregion）：位于F因子結(jié)構(gòu)圖譜的93～17.6kb，包含四個(gè)插入序列，IS3有直接重復(fù)的兩個(gè)，另外兩個(gè)是IS2和，它們主要與F因子的整合、切除、易位有關(guān)。γδ第16頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六F因子的主要表現(xiàn)型是細(xì)胞表面有性菌毛，即F＋細(xì)胞表面都有性菌毛。F性菌毛分布在大腸桿菌的表面，數(shù)目與F因子相當(dāng)，長(zhǎng)度為1～20um。

性菌毛的功能：A.是兩性細(xì)胞接合時(shí)轉(zhuǎn)移DNA的通道，又叫性纖毛橋（sexpilibridge）；B.又是特異phage吸附的部位。第17頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4、接合時(shí)DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制接合時(shí)DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前不詳，但可以確定的是：在接合時(shí)，性菌毛的存在是必需的。第18頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（四）F因子的三種存在形式1、F＋：F因子在細(xì)胞中以游離狀態(tài)存在。2、Hfr（highfrequencyofrecombination）:F因子在細(xì)胞中以整合狀態(tài)存在。Hfr與F＋的異同：（1）F＋與Hfr均能與F－菌株雜交；（2）F＋與Hfr均能合成細(xì)胞表面附屬物—性菌毛；（3）Hfr菌株總是從F＋菌株中得到，而F＋卻從未在Hfr菌株中得到過(guò)；（4）Hfr經(jīng)吖啶橙處理后性質(zhì)不變，而F＋經(jīng)吖啶橙處理后失去F因子；（5）Hfr與F－雜交后，F(xiàn)－性質(zhì)一般不會(huì)變；而F＋與F－雜交后，F(xiàn)－變?yōu)镕＋。第19頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、F′：攜帶有部分核染色體基因的F′因子，含有F′因子的菌株稱(chēng)為F′菌株。第20頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（五）三種“雄性”菌株與F－接合后的結(jié)果1、F＋

×F－2F＋由性菌毛將不同接合型的的細(xì)菌連在一起，并且在細(xì)胞間形成胞質(zhì)橋（也稱(chēng)接合管）。在形成接合對(duì)以后，F(xiàn)＋菌的F因子進(jìn)行DNA滾環(huán)復(fù)制。單鏈轉(zhuǎn)入F－菌，并合成新的互補(bǔ)鏈。第21頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、Hfr

×F－Hfr＋F－Hfr的染色體雙鏈中的一條鏈在F因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變?yōu)榫€狀，F(xiàn)因子則位于線狀單鏈DNA的末端，整段線狀染色體（單鏈）也以5′－末端引導(dǎo)，等速地轉(zhuǎn)移至F－細(xì)胞。通過(guò)接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞稱(chēng)為接合子。（conjugant）第22頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第23頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、F′

×F－2F′Hfr菌株的F因子的反常切除所形成的F因子有兩種類(lèi)型：I型：包含了染色體一個(gè)區(qū)域和不完全的F′因子。II型：帶有完整的F因子DNA和位于F因子插入兩端的染色體基因。第24頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第25頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六F′菌的共同特征（1）I型F′一般攜帶的基因是Hfr上的末端，這部分基因在Hfr×

F－時(shí)是低頻轉(zhuǎn)移的，而在F′×

F－時(shí)卻是高頻轉(zhuǎn)移的。（2）II型F′菌使本來(lái)轉(zhuǎn)移頻率差異懸殊的兩部分基因具有相同的頻率。（3）F′菌的最大特點(diǎn)是能構(gòu)建穩(wěn)定的部分二倍體。第26頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過(guò)F′因子的轉(zhuǎn)移而使受體菌改變它的遺傳性狀的現(xiàn)象稱(chēng)為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)或或性因子轉(zhuǎn)導(dǎo)或簡(jiǎn)稱(chēng)性導(dǎo)（Fduction或sexduction）擬表型菌：指表型上屬于F′而遺傳性上仍是F＋

的菌，也就是說(shuō)表面沒(méi)有性菌毛，因而喪失了表面排斥性。第27頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第28頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（六）中斷雜交實(shí)驗(yàn)原理：

如果人為地中斷正在基因轉(zhuǎn)移的雜交對(duì)，然后測(cè)定受體菌里遺傳標(biāo)記重組頻率，就能知道基因連鎖情況。第29頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1957年，E.L.Wollman和F.Jocob設(shè)計(jì)了中斷雜交實(shí)驗(yàn)。供體菌Hfr，受體菌F－thr－leu－lac－gal－azirtonrstrr，將大約10倍的F－菌和Hfr對(duì)數(shù)期菌混合，輕輕振蕩培養(yǎng)，在不同時(shí)間間隔取樣，在組織攪拌器中劇烈振蕩后，將培養(yǎng)物經(jīng)適當(dāng)稀釋后，涂布在含鏈霉素且以葡萄糖作為碳源的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。第30頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六中斷雜交實(shí)驗(yàn)第31頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六中斷雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：基因是以ori、thr、leu、azi、ton、lac、gal的順序連續(xù)轉(zhuǎn)移的。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)Hfr菌的條件是，str基因在整個(gè)待測(cè)順序的后端，如果strs基因率先進(jìn)入受體，獲得的重組體將在第一次選擇性培養(yǎng)基上被str殺死。另外，thr、leu選擇性標(biāo)記應(yīng)位于前端，如位于后端則無(wú)法測(cè)序。第32頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、放線菌的接合作用（一）放線菌基因重組的發(fā)現(xiàn)1955年，Sermonti夫婦在天蘭色鏈霉菌（streptomycescoelicoler）ISS株中首次發(fā)現(xiàn)通過(guò)遺傳性交換而產(chǎn)生的重組，接著，Hopwood也用S.coelicolerA3(2)發(fā)現(xiàn)了同樣的重組。第33頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）放線菌的性別1、三種性別原始致育型（IF，initialfertility）：相當(dāng)于E.coli的F＋正常致育型（NF，normalfertility）：相當(dāng)于E.coli的Hfr超致育型（UF，ultrafertility）：相當(dāng)于E.coli的F－第34頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、認(rèn)為IF相當(dāng)于E.coli的F＋、UF相當(dāng)于E.coli的F－的理由（1）IF以0.3％的頻率轉(zhuǎn)變?yōu)閁F，在經(jīng)uv處理的IF群體中曾經(jīng)得到作為受體高度可育的UF菌株，這種情況類(lèi)似于從F＋菌株中得到F－菌株；（2）IF×UF雜交中，UF受體菌株全部轉(zhuǎn)變?yōu)镮F，而染色體基因重組頻率大約為10－4，兩者相差萬(wàn)倍。這種情況與F＋×

F－相似。第35頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、認(rèn)為NF相當(dāng)于Hfr的理由（1）IF和NF都產(chǎn)生對(duì)于UF菌株具有抑制作用的次甲霉素，而UF菌株則不產(chǎn)生這一抗菌素；（2）IF×UF雜交子代全部都是IF，這種轉(zhuǎn)變和染色體基因轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，但是NF×UF雜交則不同，UF轉(zhuǎn)變?yōu)镹F都伴隨著染色體重組；（3）NF菌株來(lái)自IF或是IF的雜交子代，與E.coli中的一樣。第36頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（三）放線菌的致育因子經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在S.coelicoler中存在著一種稱(chēng)為Scp1的致育因子。Scp1和F因子一樣也是一種質(zhì)粒，具有轉(zhuǎn)移性，在自身轉(zhuǎn)移的同時(shí)還能夠帶動(dòng)染色體進(jìn)行轉(zhuǎn)移。此外Scp1還帶有與產(chǎn)生次甲霉素有關(guān)的基因，Scp1屬于附加體質(zhì)粒。第37頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（四）天蘭色鏈霉菌三種致育類(lèi)型與大腸桿菌的三種致育類(lèi)型之間的區(qū)別1、大腸桿菌中F－×

F－是不育的，但在天蘭色鏈霉菌中UF

×

UF是可育的，只是頻率較低，說(shuō)明還有另外一種致育因子的存在；2、大腸桿菌中F＋×

F＋或Hfr×Hfr雜交的可育性很低，除非使其中一個(gè)成為

F－的擬表型，但在天蘭色鏈霉菌中NF×NF和IF×IF雜交中一部分是高度可育的；3、大腸桿菌中F＋×

F－的子代都是F－而Hfr×

F－的子代都是F－，但在天蘭色鏈霉菌中IF×UF的子代是IF，NF×UF的子代也是NF。第38頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三、采用接合技術(shù)育種Hfr細(xì)菌和F－細(xì)菌接觸帶來(lái)兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的接合和染色體從Hfr細(xì)菌向F－細(xì)菌轉(zhuǎn)移。因此，接合雜交是確定特定基因的粗略位置的有效方法，也是育種的一種手段。一般采用液體接合培養(yǎng)法，在接合時(shí)注意通氣和選擇標(biāo)記。選擇性標(biāo)記可以用抗性標(biāo)記，也可以用營(yíng)養(yǎng)缺陷型。第39頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第二節(jié)轉(zhuǎn)化與育種轉(zhuǎn)化（transformation）：受體細(xì)胞直接吸收來(lái)自供體細(xì)胞的離體DNA片段，并通過(guò)交換把它整合到自己的基因組中，從而獲得了供體細(xì)胞的某些遺傳性狀的現(xiàn)象。獲得新性狀的受體稱(chēng)為轉(zhuǎn)化子（transformant）。＊轉(zhuǎn)化不是兩個(gè)細(xì)胞的直接接觸，而是供體細(xì)胞的離體DNA與受體細(xì)胞直接接觸而轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)。第40頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六一、轉(zhuǎn)化過(guò)程轉(zhuǎn)化包括兩個(gè)基本過(guò)程（1）從供體菌中提取遺傳物質(zhì)DNA并轉(zhuǎn)移到受體中；（2）供體的遺傳物質(zhì)在受體中的作用。第41頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第42頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第43頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第44頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第45頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（一）轉(zhuǎn)化DNA的特點(diǎn)1、轉(zhuǎn)化子的數(shù)目與DNA濃度的關(guān)系在一定條件下轉(zhuǎn)化子的數(shù)目與轉(zhuǎn)化DNA的濃度成正比。細(xì)菌生長(zhǎng)量每毫升中轉(zhuǎn)化子數(shù)1041051031021022040608010012010100培養(yǎng)時(shí)間每毫升中轉(zhuǎn)化子數(shù)10－310－210－1DNA轉(zhuǎn)化的飽和濃度第46頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、DNA片段的大小與轉(zhuǎn)化子數(shù)目的關(guān)系對(duì)于轉(zhuǎn)化作用來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)化DNA片段必須具有一定的大小。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)化DNA片段的大小沒(méi)有上限，但是在制備轉(zhuǎn)化子過(guò)程中，往往人工打斷供體DNA分子，獲得的片段約107dal（大約10個(gè)基因左右）。在受體細(xì)胞攝取DNA時(shí)，可能還會(huì)進(jìn)一步斷裂，所以僅僅有大約0.5％的供體基因組能夠進(jìn)入受體細(xì)胞。能發(fā)生轉(zhuǎn)化作用的核苷酸鏈至少不低于450bp。第47頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、單雙鏈DNA與轉(zhuǎn)化活性的關(guān)系單鏈DNA的轉(zhuǎn)化活性低，而雙鏈DNA的轉(zhuǎn)化活性高。因而，DNA完整的雙鏈結(jié)構(gòu)對(duì)于轉(zhuǎn)化活性來(lái)說(shuō)是必要的。第48頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4、轉(zhuǎn)化DNA的命運(yùn)大量的實(shí)驗(yàn)證明，在轉(zhuǎn)化作用中遺傳重組是由供體的單鏈序列取代了受體DNA的單鏈序列，使受體的DNA標(biāo)記變成了供體的遺傳標(biāo)記，并恒定表達(dá)，遺傳給它的后代。第49頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）受體細(xì)胞的特點(diǎn)1、受體細(xì)胞的感受態(tài)（1）概念

只有在某一特定條件下培養(yǎng)的部分細(xì)胞才有吸收DNA的能力，這種細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞。這種感受態(tài)細(xì)胞所處的狀態(tài)稱(chēng)為感受態(tài)（competence）。第50頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（2）感受態(tài)的特點(diǎn)和影響因素特點(diǎn)：感受態(tài)不是一種透性特征，而是在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)條件下獲得的一種生理特征影響因素：受菌齡的影響：一般認(rèn)為感受態(tài)出現(xiàn)在細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的后期；受遺傳因素的影響；受環(huán)境條件的影響。第51頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、感受態(tài)的比例不同的細(xì)菌的感受態(tài)的比例是不同的，一般為10％～20％。3、感受態(tài)可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移第52頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4、感受態(tài)因子（CF）1963年，R.Pakula和W.Walczak首次從鏈球菌中分離得到；1972年，Leonard和Cale純化的一種蛋白質(zhì)，稱(chēng)為CF。該蛋白質(zhì)在感受態(tài)轉(zhuǎn)移中起作用。在感受態(tài)細(xì)胞表面存在著一種特定的抗原，而非感受態(tài)細(xì)胞則沒(méi)有這種抗原。細(xì)菌細(xì)胞在特定的時(shí)期產(chǎn)生一種感受態(tài)因子（CF），CF與膜上的受體結(jié)合，刺激核內(nèi)DNA產(chǎn)生另一個(gè)蛋白——自溶素（Autolysin），自溶素轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)內(nèi)作用于細(xì)胞膜，并改變膜的成分，使細(xì)胞膜便于DNA的吸收。第53頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、轉(zhuǎn)化過(guò)程的基因重組及育種（一）轉(zhuǎn)化技術(shù)用于基因定位在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，兩個(gè)連鎖的基因可以同時(shí)轉(zhuǎn)化，但能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化的基因卻不一定是連鎖的，因?yàn)榘@兩個(gè)基因的DNA片段可以同時(shí)被受體細(xì)菌所吸收。第54頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六如果a+和b+是連鎖的，那么當(dāng)DNA濃度下降時(shí)，a+b+轉(zhuǎn)化頻率的下降與a+或b+的轉(zhuǎn)化頻率下降相同；相反，如果a+和b+并不連鎖，那么a+b+轉(zhuǎn)化頻率下降將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)a+或b+的轉(zhuǎn)化頻率。這是因?yàn)樵贒NA低濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生與DNA的濃度成正比。當(dāng)a+、

b+兩個(gè)基因位于同一DNA片段上是，a+b+轉(zhuǎn)化子與DNA濃度成正比的增加；當(dāng)a+b+基因分別位于不同的DNA片段上是，在一定的DNA濃度內(nèi)，a+b+轉(zhuǎn)化子與DNA濃度的平方成正比。通過(guò)這樣的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)化基因的連鎖情況可以方便的繪制出遺傳圖譜。第55頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六以trp+和tyr+DNA作為供體q＝trp+tyr—＋trp—tyr+trp+tyr—trp+tyr+trp—tyr+＋＋第56頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六共轉(zhuǎn)指數(shù)：如將DNA加入到受體菌中，會(huì)產(chǎn)生、和三種轉(zhuǎn)化子，將型轉(zhuǎn)化子在其中所占的比例稱(chēng)為共轉(zhuǎn)指數(shù)（cotransferindex）共轉(zhuǎn)指數(shù)＝a+b+＋＋a+b+a－b+a+b－第57頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）轉(zhuǎn)化育種利用在轉(zhuǎn)化過(guò)程中供體菌可將遺傳性狀傳遞給受體菌的這種特性，育種工作者可以采用轉(zhuǎn)化的方法達(dá)到育種的目的。第58頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第三節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)與育種一、轉(zhuǎn)導(dǎo)的概念通過(guò)完全缺陷或部分缺陷的噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換和整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。獲得新性狀的受體細(xì)胞就稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。轉(zhuǎn)導(dǎo)有兩種類(lèi)型，即普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限轉(zhuǎn)導(dǎo)。第59頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及證明1952年，N.Zinder和Lederberg在研究鼠傷寒沙門(mén)氏菌遺傳重組時(shí)，采用兩種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌：LA2:phe+trp+met－h(huán)is－LA22:phe－trp－met+his+在將兩者混合培養(yǎng)后獲得了原養(yǎng)型。同時(shí)，再將兩者放入Davis管中培養(yǎng)時(shí)仍出現(xiàn)重組體，這就證明在兩株菌之間有一種過(guò)濾性因子起作用。第60頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六過(guò)濾性因子是噬菌體（phage）的證明：過(guò)濾性因子不會(huì)因DNase處理而失去活性，說(shuō)明它不是裸露在溶液中的DNA，故可以排除轉(zhuǎn)化作用，另外由于兩個(gè)菌是隔離培養(yǎng)的因而也可以排除接合作用；過(guò)濾性因子與從溶源性菌分離到的噬菌體P22具有相同大小的質(zhì)量；用抗P22的血清或加熱處理，使P22的感染性和過(guò)濾性因子的功能失活的速率相同；抗P22的沙門(mén)氏菌菌株同時(shí)也對(duì)過(guò)濾性因子表現(xiàn)為抗性。因此可以證明：過(guò)濾性因子就是溫和型噬菌體P22。第61頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）

通過(guò)完全缺陷的phage對(duì)供體菌任何DNA小片段的“誤包”，而實(shí)現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象，稱(chēng)為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。第62頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第63頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第64頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（一）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體在進(jìn)行包裝時(shí)，有極少數(shù)phage（10－6～10－8）的衣殼將與頭部DNA相仿的一小段供體DNA片段誤包在內(nèi)，形成完全不含phage自身DNA的假噬菌體，這種假噬菌體稱(chēng)為完全缺陷噬菌體。由完全缺陷噬菌體介導(dǎo)的普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)稱(chēng)為完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。第65頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)簡(jiǎn)稱(chēng)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，如果其外源DNA在體內(nèi)既不進(jìn)行交換、整合、復(fù)制，也不迅速消失，而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及性狀表達(dá)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體菌可以在選擇性培養(yǎng)基上形成微小的菌落。第66頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六四、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction）指通過(guò)部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。特點(diǎn)：1、只能是個(gè)別特定基因；2、該特定基因由部分缺陷噬菌體攜帶；3、缺陷噬菌體是由于在其形成過(guò)程中所發(fā)生的低頻率“誤切”或由于雙重溶源菌的裂解而形成。

第67頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第68頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六局限轉(zhuǎn)導(dǎo)第69頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第70頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（一）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT，lowfrequencytransduction）由于宿主染色體上進(jìn)行不正常的切離的頻率極低，因此在裂解物中所含的部分缺陷phage的比例也極低。這種裂解物稱(chēng)為L(zhǎng)FT裂解物。LFT裂解物在低m.o.i.情況下感染宿主，可獲得極少量的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)，這就是低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。m.o.i.：稱(chēng)作感染復(fù)數(shù)，是指每一個(gè)敏感細(xì)胞所能吸附的相應(yīng)phage的數(shù)量。第71頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT，highfrequencytransduction）雙重溶源菌：在高m.o.i.情況下，受體菌會(huì)同時(shí)吸附缺陷型phage和完整phage，并且可以同時(shí)整合在受體菌的核染色體組上，這時(shí)的受體菌稱(chēng)為雙重溶源菌。此時(shí)，正常的phage稱(chēng)為助體phage。由雙重溶源菌形成的裂解物稱(chēng)為HFT裂解物。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：用低m.o.i.的HFT裂解物去感染受體細(xì)胞，則可高頻率的發(fā)生局限轉(zhuǎn)導(dǎo)，這就是高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。第72頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六五、轉(zhuǎn)導(dǎo)用于基因定位普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體通?？梢杂糜诶L制供體菌遺傳圖譜。應(yīng)用于基因定位的共轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象：

P1噬菌體的基因組約為染色體長(zhǎng)度的2.4％，P1噬菌體感染E.coli后可以隨意包裹寄主DNA片段，只要這個(gè)片段包含的基因座位不超過(guò)E.coli遺傳圖譜的兩分鐘距離，均可一起被轉(zhuǎn)導(dǎo)，這是一般用接合和轉(zhuǎn)化作用來(lái)進(jìn)行基因定位所難以實(shí)現(xiàn)的，對(duì)細(xì)菌染色體小片段的精細(xì)結(jié)構(gòu)十分有用。兩個(gè)鄰近的基因一起被轉(zhuǎn)導(dǎo)的現(xiàn)象稱(chēng)為共轉(zhuǎn)導(dǎo)（co－transduction)。第73頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA片段進(jìn)入受體后，與受體同源分子進(jìn)行重組，當(dāng)另一個(gè)基因的標(biāo)記被選擇時(shí)，那么另一個(gè)鄰近基因的發(fā)現(xiàn)頻率隨著它們二者之間距離的減少而增大，這個(gè)頻率稱(chēng)為共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率（cotransductionfrequency）。用下式表示：

F＝（1－d／L）3

d為兩個(gè)基因之間的距離，L是P1基因組或轉(zhuǎn)導(dǎo)片段長(zhǎng)度（在遺傳圖譜上用分鐘表示）。比如：有兩個(gè)基因的共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率是65％，L為2分鐘（約76kb）。這兩個(gè)基因之間的距離為0.26分鐘（約10kb）。第74頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六六、轉(zhuǎn)導(dǎo)育種利用轉(zhuǎn)導(dǎo)法選育目的菌，首要的任務(wù)是要獲得轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的獲得：噬菌體侵染供體菌后，在感染末期，少數(shù)噬菌體會(huì)將供體菌的DNA誤認(rèn)為是它們自己的DNA，并以其外殼蛋白將細(xì)菌DNA包圍起來(lái)，從而形成轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。由于細(xì)菌DNA的任何部分都可以被包裝，因此，要獲得目的轉(zhuǎn)導(dǎo)子必須要通過(guò)那些選擇性標(biāo)記。第75頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六轉(zhuǎn)導(dǎo)育種的過(guò)程操作過(guò)程如下：

先將供體菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后向其中加入噬菌體，繼續(xù)培養(yǎng)是一部分供體菌發(fā)生裂解反應(yīng)而釋放出轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。加入氯仿以殺死仍活著的供體菌，待完全溶菌后低速離心以除去菌體殘?jiān)?，上清液?jīng)Dnase處理和微孔濾膜除菌后，即制成供體菌裂解液。將受體菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，向其中加入供體菌裂解液，待轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體吸附后，低速離心收集菌體。將該菌體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)即可從中獲得目的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。首先要進(jìn)行噬菌體效價(jià)的測(cè)定。所謂噬菌體效價(jià)就是1ml培養(yǎng)液中含有活噬菌體的數(shù)目。第76頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第四節(jié)微生物原生質(zhì)體融合和育種一、原生質(zhì)體融合的概念所謂原生質(zhì)體融合，就是將雙親株的微生物細(xì)胞分別通過(guò)酶解脫壁，使之成為原生質(zhì)體。然后在高滲的條件下混合，并加入物理的、化學(xué)的、生物的助融條件，使雙親株的原生質(zhì)體間發(fā)生相互凝集。通過(guò)細(xì)胞質(zhì)融合、核融合，而后發(fā)生基因組間的交換、重組，進(jìn)而可以在適宜的條件下再生出微生物的細(xì)胞壁來(lái)，從而獲得重組子的過(guò)程。第77頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

狹義的原生質(zhì)體（protoplast）即細(xì)胞壁被徹底酶解完全脫壁后形成的

1、原生質(zhì)體

廣義的原生質(zhì)體既包括狹義的原生質(zhì)體也包括不完全脫壁后形成的圓球體（spheroplast）

物理的：瞬時(shí)高壓的交變電場(chǎng)或激光等2、助融條件化學(xué)的：聚乙二醇、二甲亞砜、伴刀豆球蛋白A、磷脂酰絲氨酸、溶血卵磷脂等

生物的：仙臺(tái)病毒、雞新城疫病毒、等關(guān)于原生質(zhì)體概念的解釋?zhuān)旱?8頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、原生質(zhì)體融合在生物工程中的地位生物工程（biotechnology）細(xì)胞工程基因工程酶工程發(fā)酵工程固定化細(xì)胞基因體外重組染色體移植或引入細(xì)胞器移植核移植固定化酶酶分子的改造和修飾發(fā)酵自動(dòng)化產(chǎn)品后處理泛指遺傳工程組織培養(yǎng)原生質(zhì)體融合第79頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1、原生質(zhì)體融合是一種更為廣泛，更為隨機(jī)的基因重組方式；2、原生質(zhì)體融合方式，可以打破微生物的種屬界限，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株間的基因重組；3、原生質(zhì)體融合可以使遺傳物質(zhì)傳遞更為完全，可以獲得更多基因重組的機(jī)會(huì)，有利于提高育種速度；4、借助融合劑可同時(shí)將幾個(gè)親本的原生質(zhì)體隨即融合在一起，從而獲得綜合幾個(gè)親本性狀的重組體，加速育種進(jìn)程；5、原生質(zhì)體融合可以和其它育種方法相結(jié)合，把從其它方法得到的優(yōu)良性狀通過(guò)原生質(zhì)體融合在組合到一個(gè)單株中，提高菌株產(chǎn)量的幾率增大；三、原生質(zhì)體融合及原生質(zhì)體技術(shù)的理論與實(shí)踐意義第80頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六6、原生質(zhì)體融合可以大大提高遺傳重組的頻率；7、在生產(chǎn)菌種的選育中，可以應(yīng)用具有較高產(chǎn)量性狀的菌株作為融合時(shí)出發(fā)菌株，以期達(dá)到理想育種的目的；8、可以應(yīng)用滅活的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，從而提高篩選效率，省去育種過(guò)程中對(duì)親株的遺傳標(biāo)記，省去人力、物力和時(shí)間，也可防止因增加標(biāo)記而降低出發(fā)菌株的產(chǎn)量；9、原生質(zhì)體技術(shù)有助于建立工業(yè)微生物的轉(zhuǎn)化體系，開(kāi)辟新的育種途徑；10、對(duì)微生物制備原生質(zhì)體后直接再生育種、原生質(zhì)體誘變后再生育種、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)育種、原生質(zhì)體固定化等原生質(zhì)體技術(shù)在微生物育種與工業(yè)生產(chǎn)中近年來(lái)已日趨廣泛開(kāi)展；11、在理論上，微生物的原生質(zhì)體融合可用于研究噬菌體與寄主間的關(guān)系，深入了解溶源機(jī)理及免疫因子和存在部位；研究原噬菌體的DNA在寄主染色體上的結(jié)合位點(diǎn)；第81頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六12、在細(xì)胞學(xué)研究方面，通過(guò)原生質(zhì)體融合，有助于研究核質(zhì)關(guān)系及細(xì)胞質(zhì)遺傳問(wèn)題；13、微生物原生質(zhì)體融合，可用于遺傳性分析等理論研究。第82頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

（1）標(biāo)記菌株的篩選；（2）原生質(zhì)體的制備；（3）原生質(zhì)體的再生；（4）原生質(zhì)體的融合；（5）融合子的選擇；（6）實(shí)用型菌株的篩選。四、原生質(zhì)體融合育種的基本程序原生質(zhì)體融合一般包括如下步驟：第83頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六BAABa+b-a-b+菌株標(biāo)記細(xì)胞壁溶菌酶AB細(xì)胞膜加PEG混合融合的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)再生平皿2BA134篩選融合子溫浴穩(wěn)定高產(chǎn)重組子標(biāo)記的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞原生質(zhì)體1－a+b-2－a+b+3－a-b-4－a-b+原生質(zhì)體的形成融合CW再生穩(wěn)定正變株的篩選細(xì)胞原生質(zhì)體融合程序示意圖第84頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（一）標(biāo)記菌株的篩選在原生質(zhì)體融合過(guò)程中，為了便于篩選，通常對(duì)于所用的親株都要進(jìn)行一定的遺傳標(biāo)記。

一般可以采用營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記和抗藥性標(biāo)記。第85頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）原生質(zhì)體的制備

在細(xì)菌和放線菌中主要采用溶菌酶；在酵母菌和霉菌中一般可用蝸牛酶和纖維素酶。第86頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響原生質(zhì)體制備的因素1、菌體的預(yù)處理為了使酶的作用效果更好一些，可對(duì)菌體進(jìn)行預(yù)處理，包括菌體培養(yǎng)階段的預(yù)處理和酶解前的預(yù)處理。對(duì)于細(xì)菌可加入甘氨酸、青霉素和D－環(huán)絲氨酸等，對(duì)于放線菌可以使用甘氨酸（1－4％）等，在酵母菌中加入EDTA和巰基乙醇等。

第87頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、菌體的培養(yǎng)時(shí)間

為了使菌體易于原生質(zhì)體化，一般選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體。一般對(duì)于細(xì)菌采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期為好，對(duì)于放線菌采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期之間的轉(zhuǎn)換期最為合適。第88頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、酶濃度一般來(lái)講，酶濃度增加，原生質(zhì)體形成率增加，但是超過(guò)一定范圍，則原生質(zhì)體形成率增加的效果不明顯；酶濃度過(guò)低，則導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率下降。通常，采用當(dāng)原生質(zhì)體形成率和再生率之積達(dá)到最大時(shí)的酶濃度作為最佳酶濃度。第89頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4、酶解溫度

溫度對(duì)酶解作用有雙重影響。一方面，隨著溫度的提高，酶解反應(yīng)速度加快；另一方面，隨著溫度的增加，酶蛋白逐漸變性而失活。因此，最適溫度是這兩方面的共同結(jié)果。一般在選擇最佳溫度時(shí)，除了考慮酶的最適溫度外，還要以原生質(zhì)體再生率加以校正。第90頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六5、酶解時(shí)間原生質(zhì)體的制備質(zhì)量與酶解時(shí)間有密切的關(guān)系。酶解時(shí)間過(guò)短，原生質(zhì)體形成不完全，結(jié)果會(huì)影響到融合；酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，原生質(zhì)體脫壁太完全，原生質(zhì)體的質(zhì)膜也會(huì)受到損傷，從而會(huì)影響到再生，最終也不利于融合。因此，選擇一個(gè)最適的酶解時(shí)間對(duì)于原生質(zhì)體融合是非常重要的。第91頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六6、原生質(zhì)體制備液（滲透壓穩(wěn)定劑）

高滲透壓在原生質(zhì)體制備中不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨脹作用，而且有助于酶與底物的結(jié)合。滲透壓穩(wěn)定劑的選擇：細(xì)菌－蔗糖、丁二酸鈉、NaCl等酵母菌－山梨醇、甘露醇等霉菌－KCL、NaCl等

滲透壓穩(wěn)定劑的濃度一般采用0.3～0.8％mol/L。第92頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六原生質(zhì)體形成率＝破壁前菌數(shù)－剩余菌數(shù)破壁前菌數(shù)×100％原生質(zhì)體形成率的計(jì)算第93頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（三）原生質(zhì)體的再生

一般在進(jìn)行原生質(zhì)體再生時(shí)，采用含有滲透壓穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。滲透壓穩(wěn)定劑的選擇同制備時(shí)是一樣的。原生質(zhì)體的再生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其影響因素有很多，包括菌體本身的再生特性、原生質(zhì)體制備的條件、再生培養(yǎng)基的成分、再生培養(yǎng)條件等等。第94頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期