基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞

基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第1頁(yè)載體與目標(biāo)基因連接后，體系中可能存在以下分子：

a.未連接載體分子

b.未連接DNA片段

c.載體自連

d.含有錯(cuò)誤插入片段重組DNA分子

e.重組DNA分子基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第2頁(yè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，這些分子同時(shí)被轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)。未連接分子即使被細(xì)菌攝取，寄主酶可降解這些DNA片段。自連載體和錯(cuò)誤插入重組質(zhì)粒能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行正常復(fù)制基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第3頁(yè)重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為

分分離目標(biāo)基因切限制酶切目標(biāo)基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體

基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第4頁(yè)第六章重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞一、受體細(xì)胞二、選擇受體細(xì)胞基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)三、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞方法2023/4/255基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第5頁(yè)一、受體細(xì)胞受體細(xì)胞(receptorcell)又稱為宿主細(xì)胞(hostcell)，是指能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持細(xì)胞。

感受態(tài)(competence)是指細(xì)菌吸收外源DNA生理狀態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞(competencecell)是指含有接收外源DNA能力細(xì)胞。2023/4/256基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第6頁(yè)基因工程常見(jiàn)受體細(xì)胞有:大腸桿菌枯草桿菌土壤農(nóng)桿菌酵母菌植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第7頁(yè)大腸桿菌基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第8頁(yè)1、原核生物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)①大個(gè)別原核生物細(xì)胞沒(méi)有纖維素組成堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源DNA進(jìn)入。②沒(méi)有核膜，染色體DNA沒(méi)有固定結(jié)合蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸露染色體DNA重組降低了麻煩。③基因組簡(jiǎn)單，不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于對(duì)引入外源基因進(jìn)行遺傳分析。④原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物，輕易取得一致性試驗(yàn)材料，而且培養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖快速，試驗(yàn)周期短，重復(fù)試驗(yàn)快。2023/4/259基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第9頁(yè)原核生物細(xì)胞表示真核生物基因存在缺點(diǎn)：①原核生物細(xì)胞不具備真核生物蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)，即使許多真核生物基因得以表示，得到也多是無(wú)特異性空間結(jié)構(gòu)多肽鏈。②原核生物細(xì)胞缺乏真核生物蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)生物活性正是依賴于其側(cè)鏈糖基化或磷酸化等修飾作用。③原核生物細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確異源蛋白，造成表示產(chǎn)物不穩(wěn)定等。2023/4/2510基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第10頁(yè)酵母菌基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第11頁(yè)2、酵母菌酵母菌作為外源真核基因表示系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)①酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單真核生物之一,其基因表示調(diào)控機(jī)理比較清楚,遺傳操作相對(duì)較為簡(jiǎn)單。②含有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。③不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素，有些酵母菌屬(如釀酒酵母)有著幾百年應(yīng)用歷史，屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)。④培養(yǎng)簡(jiǎn)單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。⑤能將外源基因表示產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物提取和加工等。2023/4/2512基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第12頁(yè)3、動(dòng)物細(xì)胞常見(jiàn)動(dòng)物受體細(xì)胞有Hela細(xì)胞、猴腎細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠巢細(xì)胞(CHO)等。2023/4/2513MCF-7基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第13頁(yè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)是：①能識(shí)別和除去外源真核基因中內(nèi)含子，剪接加工成成熟RNA。②真核基因表示蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾,產(chǎn)物含有很好蛋白質(zhì)免疫原性,約為酵母細(xì)胞16-20倍。③易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,含有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性。④經(jīng)轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞可將表示產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。缺點(diǎn)是:組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，如培養(yǎng)和篩選一個(gè)高度擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子CHO細(xì)胞，通常需要數(shù)月之久,難度較大?；蚬こ讨亟Mdna導(dǎo)入受體細(xì)胞第14頁(yè)二、選擇受體細(xì)胞基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)①便于重組DNA分子導(dǎo)入。②便于重組體篩選。③遺傳穩(wěn)定性高，易于進(jìn)行擴(kuò)充培養(yǎng)或易于進(jìn)行高密度發(fā)酵而不影響外源基因表示效率。對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言，所選取受體細(xì)胞含有對(duì)培養(yǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，能夠進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

2023/4/2515基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第15頁(yè)④受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表示產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表示。⑤安全性高，無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染。普通選取致病缺點(diǎn)型細(xì)胞或營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型細(xì)胞作為受體細(xì)胞。2023/4/2516基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第16頁(yè)⑥能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。⑦受體細(xì)胞在遺傳密碼子應(yīng)用上無(wú)顯著偏倚性。⑧含有很好轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制等，便于真核目標(biāo)基因高效表示。⑨在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高應(yīng)用價(jià)值。2023/4/2517基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第17頁(yè)AminoacidRarecodonUrchinHMG1LampreyHMGB1LampreyHMGB2LampreyHMGBXtroutHMG1FrogHMG1TurtleHMGB1ChickHMGB1MouseHMGB1HumanHMGB1HumanHMGB2HumanHMGB3LeuCTA001000001020IleATA100112100000ProCCC367741126334ArgCGG023410121122AGA610044013211AGG542033212232GlyGGA315523223625Total1814181715137816141314稀有密碼子：基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第18頁(yè)三、基因?qū)胧荏w細(xì)胞方法轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)轉(zhuǎn)染(transfection)微注射技術(shù)(microinjection)電轉(zhuǎn)化法(electroporation)基因槍技術(shù)(geneblaster)脂質(zhì)體介導(dǎo)法(liposomemediatedtransfer)其它方法：快速冷凍法、碳化硅纖維介導(dǎo)法等。2023/4/2519基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第19頁(yè)依據(jù)轉(zhuǎn)移基因載體與受體特征可分為：質(zhì)粒載體導(dǎo)入受體細(xì)胞方法：CaCl2、電轉(zhuǎn)化法；噬菌體轉(zhuǎn)染細(xì)胞方法：體外包裝感染法；DNA導(dǎo)入酵母菌方法：電穿孔轉(zhuǎn)化法；DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞方法：Ti質(zhì)粒葉盤(pán)法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、基因槍法；DNA導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞方法：桿狀病毒感染法；DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞方法：磷酸鈣共沉淀法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、基因槍法；2023/4/2520基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第20頁(yè)轉(zhuǎn)化(transformation):指感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞捕捉質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA分子過(guò)程。轉(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化取得外源遺傳物質(zhì)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染(transfection):指感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞捕捉噬菌體或以它為載體構(gòu)建重組DNA分子過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指病毒轉(zhuǎn)移真核細(xì)胞DNA過(guò)程或噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞之間基因轉(zhuǎn)移過(guò)程。2023/4/2521基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第21頁(yè)1、氯化鈣轉(zhuǎn)化法（大腸桿菌）●

1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)覺(jué),大腸桿菌經(jīng)過(guò)氯化鈣適當(dāng)處理及短暫熱休克之后,便能吸收λ噬菌體DNA。1972年美國(guó)斯坦福大學(xué)S.Cohen報(bào)道,經(jīng)氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒DNA。2023/4/2522基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第22頁(yè)原理是：細(xì)菌處于0℃和低滲氯化鈣溶液中，細(xì)菌細(xì)胞壁和膜通透性增加,菌體膨脹成球形，此時(shí)轉(zhuǎn)化混合物中DNA形成抗DNA酶羥基-磷酸鈣復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng)短暫熱休克(42℃)后，細(xì)胞膜形成許多間隙，DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。假如感受態(tài)細(xì)胞做得好，每微克超螺旋質(zhì)粒DNA可得5×107～1×109個(gè)轉(zhuǎn)化子。2023/4/2523基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第23頁(yè)2023/4/2524基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第24頁(yè)CaCl2熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞附圖1附圖2基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第25頁(yè)2、磷酸鈣-DNA共沉淀法（動(dòng)物細(xì)胞）磷酸鈣-DNA共沉淀法是指外源基因與磷酸鈣混合形成磷酸鈣-DNA共沉淀物，可使DNA附在細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)細(xì)胞吞入攝取或經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開(kāi)空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這種轉(zhuǎn)染方法稱為磷酸鈣-DNA共沉淀法。此方法對(duì)于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是最常見(jiàn)并首選方法。

2023/4/2526基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第26頁(yè)磷酸鈣-DNA共沉淀法基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第27頁(yè)3、共轉(zhuǎn)化（植物細(xì)胞）共轉(zhuǎn)化(cotransformation)基因工程中將兩個(gè)以上基因同時(shí)導(dǎo)入感受態(tài)真核細(xì)胞方法，又稱共轉(zhuǎn)染。適合用于對(duì)不帶有可選擇標(biāo)識(shí)性狀目標(biāo)基因進(jìn)行研究。2023/4/2528基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第28頁(yè)將目標(biāo)基因表示載體DNA和標(biāo)識(shí)基因表示載體DNA混合后共同轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，分別使用標(biāo)識(shí)基因與目標(biāo)基因?qū)?yīng)選擇劑進(jìn)行兩次篩選，最終可得到復(fù)合轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化子。共轉(zhuǎn)化常見(jiàn)匯報(bào)基因:胸苷激酶基因(tk基因)、抗新霉素基因(neor)、鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(XGPRT)等。2023/4/2529基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第29頁(yè)4、電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化又稱電穿孔法(electroporation):是指在細(xì)胞上施加短暫、高壓電流脈沖，在質(zhì)膜上形成納米大小微孔，DNA直接經(jīng)過(guò)這些微孔或者作為微孔閉合時(shí)所伴隨發(fā)生膜組分重新分布經(jīng)過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，這種方法稱為電穿孔法。最早用于將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞,1988年,Dower等人成功應(yīng)用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化?；A(chǔ)原理是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆瞬間通道,從而促進(jìn)外源DNA有效吸收。

2023/4/2530基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第30頁(yè)電穿孔轉(zhuǎn)化法效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖時(shí)間和外源DNA濃度等參數(shù)影響，經(jīng)過(guò)優(yōu)化這些參數(shù)，每μgDNA能夠得到109～1010轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化效率將會(huì)有所提升，但同時(shí)造成受體細(xì)胞存活率降低，轉(zhuǎn)化效率提升也所以被抵消。2023/4/2531基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第31頁(yè)2023/4/2532基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第32頁(yè)電穿孔法基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第33頁(yè)2023/4/2534基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第34頁(yè)5、基因槍法基因槍法(又稱粒子轟擊法)用高壓氣體加速把粘有DNA細(xì)微金粉(或鎢粉顆粒)打向細(xì)胞，穿過(guò)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等層層結(jié)構(gòu)抵達(dá)細(xì)胞核，完成基因轉(zhuǎn)移方法?；驑尫ㄟm合用于動(dòng)植物組織或細(xì)胞、胚胎、細(xì)菌及小動(dòng)物等?；驑尫ㄌ攸c(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、安全、高效。

2023/4/2535基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第35頁(yè)2023/4/2536基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第36頁(yè)基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第37頁(yè)基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第38頁(yè)基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第39頁(yè)基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第40頁(yè)6、微注射技術(shù)微注射技術(shù)：普通是用微吸管吸收供體DNA溶液，在高倍倒置顯微鏡下準(zhǔn)確地插入受體細(xì)胞核中，并將DNA注射進(jìn)去。常見(jiàn)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。2023/4/2541基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第41頁(yè)7、脂質(zhì)體導(dǎo)入法脂質(zhì)體也稱人工細(xì)胞膜，是由脂質(zhì)雙分子層組成，磷脂分子在水中可自動(dòng)生成閉合雙層膜,從而形成一個(gè)囊狀物被稱為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體導(dǎo)入法:將DNA或RNA包囊于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合，經(jīng)過(guò)融合導(dǎo)入細(xì)胞,這種轉(zhuǎn)染方法稱為脂質(zhì)體導(dǎo)入法。2023/4/2542基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第42頁(yè)基因工程重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞第43頁(yè)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染機(jī)制陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸磷酸根經(jīng)過(guò)靜電作用將DNA分子包裹人內(nèi)，形成DNA一脂復(fù)合體，也能被表面帶負(fù)電荷細(xì)胞膜吸附，再經(jīng)過(guò)膜融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用，偶然也經(jīng)過(guò)直接滲透作用,將DNA傳遞進(jìn)入細(xì)胞，形成包涵體或進(jìn)入溶酶體,其中一小個(gè)別DNA能從包涵體內(nèi)