蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)組研究

蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)組研究第1頁/共74頁蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)組研究第2頁/共74頁1克隆基因的表達(dá)1.1中的外源基因在大腸桿菌表達(dá)載體1.2在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白存在的問題1.3真核細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)第3頁/共74頁圖1-1在大腸桿菌中基因表達(dá)的3個(gè)重要信號(hào)啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)基因終止子DNARNA轉(zhuǎn)錄核糖體結(jié)合mRNA位點(diǎn)第4頁/共74頁圖1-2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列的比較TTGACATATAATPu>Py-35區(qū)-30-70正調(diào)控區(qū)-20負(fù)調(diào)控區(qū)+1-10區(qū)GC區(qū)….CAAT區(qū)TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增強(qiáng)子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核第5頁/共74頁圖1-3通過表達(dá)載體在大腸桿菌中被表達(dá)PRTTPRTPRmRNA蛋白質(zhì)表達(dá)載體外源基因?qū)⑼庠椿虿迦胂拗菩悦盖形稽c(diǎn)轉(zhuǎn)化大腸桿菌第6頁/共74頁圖1-4雜交基因的構(gòu)建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因｝ATATTA正確融合N端C端不正確融合外源基因不被翻譯表達(dá)ATATTA

GGAGCTGGAGC融合蛋白親和層析法純化化學(xué)試劑除去大腸桿菌肽段第7頁/共74頁圖1-5在大腸桿菌中表達(dá)外源基因長遇到的問題翻譯轉(zhuǎn)錄PRTT轉(zhuǎn)錄大腸桿菌不能切除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄提前終止第8頁/共74頁在真核細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白用酵母和絲狀真菌表達(dá)重組蛋白（釀酒酵母）動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白（哺乳動(dòng)物、昆蟲）利用活的動(dòng)物和植物生產(chǎn)重組蛋白（生物體制藥）第9頁/共74頁圖1-6真核細(xì)胞表達(dá)載體常用的4種啟動(dòng)子P半乳糖轉(zhuǎn)錄GAL10P甲醇轉(zhuǎn)錄乙醇氧化酶基因（a）GAL啟動(dòng)子（b）AOX啟動(dòng)子（c）葡萄糖水解酶啟動(dòng)子（d）纖維二糖水解酶啟動(dòng)子P纖維素轉(zhuǎn)錄纖維素二糖水解酶基因P淀粉轉(zhuǎn)錄葡萄糖淀粉酶基因木糖不轉(zhuǎn)錄第10頁/共74頁圖1-7將轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入卵母細(xì)胞卵母細(xì)胞體細(xì)胞DNA溶液移去細(xì)胞核移出細(xì)胞核植入代孕母親體內(nèi)第11頁/共74頁攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀钡?2頁/共74頁從

植

物

中

獲

得

重

組

蛋

白煙草葉片表達(dá)B型肝炎抗原第13頁/共74頁2蛋白質(zhì)工程2.1什么叫蛋白質(zhì)工程指通過改造與蛋白質(zhì)相應(yīng)的基因中的堿基順序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆至受體細(xì)胞中，通過基因表達(dá)而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)（酶）技術(shù)。這是一門從改變基因入手，定做新的蛋白質(zhì)的技術(shù)。故有人將其稱為“第二代基因工程”

1983年，美國生物學(xué)家額爾默首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念。第14頁/共74頁根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系；從氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新蛋白質(zhì)。

2.2蛋白質(zhì)工程研究的主要內(nèi)容第15頁/共74頁

1、蛋白質(zhì)工程的理論設(shè)計(jì)：包括活性設(shè)計(jì)、專一性設(shè)計(jì)、框架（構(gòu)象）設(shè)計(jì)等。

由于對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系認(rèn)識(shí)還不系統(tǒng)，目前的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)僅僅是對天然蛋白質(zhì)的修飾。

如：異常血紅蛋白的氨基酸取代去羧基端胰島素等。

2.3蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)第16頁/共74頁不同動(dòng)物胰島素在A鏈中的差異

羧基端第17頁/共74頁2、基因修飾——點(diǎn)突變法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變通過基因修飾來完成基因修飾的方法：⑴基因的全化學(xué)合成按照所需蛋白質(zhì)的氨基酸順序，先后合成結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄的起始信號(hào)及終止信號(hào)、限制酶切位點(diǎn)等核酸片段，然后用連接酶將各片段連接起來，通過基因工程轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。目前用此法已合成了：人血細(xì)胞干擾素、胰島素、生長激素釋放抑制激素等基因。

第18頁/共74頁調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)基因結(jié)構(gòu)基因終止基因連接酶完整基因第19頁/共74頁⑵基因直接修飾法將連接于質(zhì)粒上的某一蛋白質(zhì)的基因用酶法去除一小段，然后用合成的核苷酸片段接上，從而獲得新的突變體。

已修飾過的酶有：內(nèi)酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氫葉酸還原酶等酶蛋白。第20頁/共74頁限制性內(nèi)切酶外源DNA限制性內(nèi)切酶退火重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選表達(dá)帶重組體的細(xì)胞目的產(chǎn)物質(zhì)粒目的基因酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質(zhì)粒第21頁/共74頁⑶盒式突變

1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)，一次可以在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進(jìn)行“飽和性”分析。

第22頁/共74頁酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質(zhì)粒同時(shí)獲得多個(gè)突變體第23頁/共74頁2.4蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用酶特性的改造包括酶催化活性、專一性、穩(wěn)定性等的改造。蛋白質(zhì)或肽類藥物的改造和新藥的研制第24頁/共74頁1、酶特性的改造⑴改變酶的催化活性酪氨酰tRNA合成酶Thr5151Pro改造活力25倍⑵改變酶的專一性枯草桿菌蛋白酶活性中心枯草桿菌蛋白酶活性中心SerCys（水解蛋白質(zhì)）改造水解硝基苯酯專一性改變第25頁/共74頁2、藥物設(shè)計(jì)如抗病毒藥β-干擾素穩(wěn)定性的改進(jìn)。-SH17形成二聚體失去活性-OH17氨基酸取代×二聚體二硫鍵第26頁/共74頁

由于蛋白質(zhì)工程可以按照人的意愿定向改造蛋白質(zhì)和酶，必然有著廣泛的前景！第27頁/共74頁第14章

主講人：冉秀芝化學(xué)與生物工程學(xué)院E-mail:ranxiuzhi2006@第28頁/共74頁3基因克隆和DNA分析在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用重組藥物的生產(chǎn)人類疾病相關(guān)基因的識(shí)別和鑒定基因治療第29頁/共74頁3.1重組藥物的生產(chǎn)3.1.1重組胰島素3.1.2在大腸桿菌中合成人生長素3.1.3重組凝血因子Ⅷ3.1.4其他人類蛋白質(zhì)的合成3.1.5重組疫苗第30頁/共74頁圖3-1胰島素的分子結(jié)構(gòu)和從前胰島素原合成胰島素的簡要過程30個(gè)氨基酸B鏈21個(gè)氨基酸A鏈胰島素利于重組生產(chǎn)的特點(diǎn)前導(dǎo)序列BCA前胰島素原（胰島素原=BCA——無前導(dǎo)序列）胰島素∣S∣S∣∣S∣S∣BA剪切-S-S--S-S-LBAC自發(fā)折疊第31頁/共74頁圖3-2由人工合成的A,B鏈的基因合成重組胰島素lac啟動(dòng)子lacZ’A基因運(yùn)載人工合成的A基因的載體B基因運(yùn)載人工合成的B基因的載體(a)人工合成的基因(b)合成胰島素蛋白ABmetβ-半乳糖苷酶片段A鏈胰島素純化A鏈和B鏈二硫鍵連接metB鏈溴化氰處理pBR322pBR322轉(zhuǎn)化的大腸桿菌合成AB融合蛋白第32頁/共74頁圖3-3重組促生長素抑制素的合成lac啟動(dòng)子lacZ’人工促生長素抑制素基因metβ-半乳糖苷酶片段促生長素抑制素融合蛋白轉(zhuǎn)化大腸桿菌促生長素抑制素（14氨基酸）溴化氰第33頁/共74頁圖3-4重組生長素的合成密碼子01911912424024HaeⅢ保留除去（a）生長素cDNA片段的準(zhǔn)備過程（b）表達(dá)024合成前導(dǎo)序列191cDNAlac啟動(dòng)子插入表達(dá)載體合成生長素轉(zhuǎn)化大腸桿菌第34頁/共74頁圖3-5凝血因子Ⅷ基因及其翻譯產(chǎn)物外顯子（26）內(nèi)含子（25）（a）凝血因子Ⅷ基因（b）凝血因子Ⅷ的翻譯后的加工初級(jí)翻譯產(chǎn)物（2351個(gè)氨基酸）ABCAC成熟的凝血因子Ⅷ蛋白加工第35頁/共74頁重組凝血因子Ⅷ合成的幾種方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成（倉鼠細(xì)胞）利用活體動(dòng)物生產(chǎn)（豬）利用表達(dá)載體Ag啟動(dòng)子SV40聚腺甘酸化序列凝血因子Ⅷ的cDNA導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞重組蛋白第36頁/共74頁干擾素的合成干擾素分子結(jié)構(gòu)干擾素生產(chǎn)車間第37頁/共74頁圖3-7利用分離的病毒殼體蛋白作疫苗的原理分離的病毒殼體蛋白殼體蛋白的特異抗體注射到血液循環(huán)抗體包圍整個(gè)病毒被完整病毒感染第38頁/共74頁轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)重組蛋白疫苗HbsAg麻疹病毒呼吸道合胞病毒集幾種疫苗于一體第39頁/共74頁圖3-8重組牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因牛痘病毒啟動(dòng)子重組牛痘病毒基因組牛痘病毒乙型肝炎病毒抗乙型肝炎抗體抗牛痘病毒抗體注射重組牛痘病毒顆粒到血液循環(huán)免疫系統(tǒng)合成抗牛痘病毒和乙型肝炎病毒的抗體第40頁/共74頁表3-2在重組牛痘病毒中表達(dá)的外源基因

基因惡性瘧原蟲表面抗原流行性感冒病毒衣殼蛋白狂犬病病毒G蛋白乙型肝炎主要表面抗原單純皰疹糖蛋白人類免疫缺陷病毒（HIV）表面蛋白水泡性口炎衣殼蛋白仙臺(tái)病毒蛋白BACK第41頁/共74頁3.2人類疾病相關(guān)基因的識(shí)別和鑒定3.2.1遺傳性疾病基因識(shí)別的重要3.2.2如何識(shí)別遺傳病基因第42頁/共74頁Φ基因的識(shí)別為治療遺傳性疾病提供生物化學(xué)基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步設(shè)計(jì)藥物提供依據(jù)Φ識(shí)別缺陷基因中發(fā)生的突變，用來設(shè)計(jì)篩選程序，檢測缺陷基因攜帶者的突變基因Φ遺傳疾病相關(guān)基因的識(shí)別是進(jìn)行基因治療的先決條件第43頁/共74頁兩個(gè)緊密連鎖的基因幾乎總是一起傳給下一代圖3-9連鎖和非連鎖基因的遺傳形式ABABABabababABabABAbabab重組產(chǎn)物ABababABAbaB（a）連鎖基因（c）在不同染色體上的基因（b）在同一染色體上相距很遠(yuǎn)的基因在同一條染色體上，相距很遠(yuǎn)的兩基因常常同時(shí)遺傳，但重組會(huì)使它們分開在不同染色體上的兩個(gè)基因隨機(jī)分離如圖所示為3個(gè)家族代表男性代表女性第44頁/共74頁圖3-10乳腺癌基因圖譜分析D17S7417號(hào)染色體（80Mb）D17S1325D17S1321BRCA1第45頁/共74頁×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第46頁/共74頁+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第47頁/共74頁RLFP分析法第48頁/共74頁甲型血友病的基因診斷（連鎖分析1）5’3’引物1引物299bp43bpBclI因子VIII基因142bp片段第49頁/共74頁甲型血友病的基因診斷（連鎖分析2）142bp99bp43bp異常帶先癥者胎兒BACK第50頁/共74頁3.3基因治療3.3.1遺傳病的基因治療3.3.2基因治療與癌癥3.3.3基因治療帶來的倫理問題第51頁/共74頁圖3-11轉(zhuǎn)染干細(xì)胞的分化，使所有成熟血細(xì)胞都含有新的基因分離的干細(xì)胞新基因感染重新植入分化T細(xì)胞B細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞中性性粒細(xì)胞單核細(xì)胞第52頁/共74頁4植物基因工程的研究——基因克隆和DNA分析在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用化學(xué)與生物工程學(xué)院冉秀芝第53頁/共74頁‘83‘84‘85‘86‘87‘88‘89‘90‘91‘92‘93‘94‘95‘96‘97‘98‘99‘00‘01‘02FirsttransgenicplantDelay-ripeningtomatoCommercializedintheUSFirst

field

testsHerbicideresistant,insectresistantplantscommercializedGMmaizeapprovedbyEUFirstBtcornplantsRottingresistanttomatoapprovedbyFDA圖4-1植物基因工程的發(fā)展迅速第54頁/共74頁植物基因工程研究植物基因組計(jì)劃植物分子育種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效和多抗性植物作為反應(yīng)器香蕉、馬鈴薯、番茄等玉米、棉花、大豆、高粱和番茄酒精、石油、工業(yè)酶等第55頁/共74頁主要研究應(yīng)用的領(lǐng)域4.1.1培育抗蟲植物4.1.2抗除草劑作物4.1.3其他利用基因添加的例子第56頁/共74頁傳統(tǒng)殺蟲劑與理想殺蟲劑常有殘留范圍局限性可生物降解范圍廣廣譜性選擇性第57頁/共74頁圖4-2δ-內(nèi)毒素的作用方式δ-內(nèi)毒素基因無活性的原毒素有活性的病毒在細(xì)菌中表達(dá)在昆蟲內(nèi)臟中被蛋白酶消化破壞內(nèi)臟上皮細(xì)胞第58頁/共74頁圖4-3基因工程改造玉米的重要步驟啟動(dòng)子聚腺苷酸化序列（b）連上啟動(dòng)子序列和聚腺苷酸化信號(hào)11155B.thuringiensis29607玉米偏好密碼子和GC含量（a）人工合成δ-內(nèi)毒素基因人工合成的基因(c)PCR分析成熟的植物第59頁/共74頁在葉綠體中合成δ-內(nèi)毒素基因阻止昆蟲對δ-內(nèi)毒素的抗性（三種策略，圖15.5）輔助蛋白CrtⅡA(a2)BACK第60頁/共74頁圖4-4草甘膦作用機(jī)制烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸（EPSP）色氨酸（Trp）酪氨酸（Tyr）苯丙氨酸（Phe）莽草酸EPSPS烯醇丙酮酸草甘膦競爭EPSPS改造，增強(qiáng)抗性草甘膦降解第61頁/共74頁“抗農(nóng)達(dá)”作物

——含抗草甘膦的EPSPS農(nóng)桿菌CP4株系的EPSPS葉綠體葉綠體轉(zhuǎn)移技術(shù)生物導(dǎo)彈克隆到Ti質(zhì)粒融合蛋白表達(dá)導(dǎo)入第62頁/共74頁新一代草甘膦抗性作物

——利用GAT降解草甘膦3個(gè)天然的GAT基因多基因改造（multigeneshuffling）新的GAT基因酶的活力增強(qiáng)10000倍BACK第63頁/共74頁表4-1植物基因添加的例子基因組織來源經(jīng)過改良的植物被賦予的特征葡聚糖酶紫花苜?？拐婢l(wèi)星RNAs各種病毒抗病毒乙酰乳酸合酶煙草抗除草劑DNA腺嘌呤甲基化酶大腸桿菌雄性不育富甲硫氨酸蛋白巴西堅(jiān)果改善硫含量奇異果甜蛋白西非竹竽甜味二氫黃烷醇還原酶矮牽牛調(diào)節(jié)花的顏色第64頁/共74頁4.2基因消減4.2.1反義技術(shù)的原理4.2.2反義RNA與耐貯藏轉(zhuǎn)基因番茄4.2.3在植物基因工程中利用反義RNA的其他例子第65頁/共74頁圖15.8反義RNA啟動(dòng)子反向基因反義RNA與原來的mRNA正好反向互補(bǔ)啟動(dòng)子正向基