腫瘤分子診斷服務(wù)介紹

腫瘤分子診斷服務(wù)介紹第一頁，共五十四頁。2標(biāo)準(zhǔn)化用藥個體化用藥標(biāo)準(zhǔn)化用藥個體化用藥標(biāo)準(zhǔn)療法1標(biāo)準(zhǔn)療法2標(biāo)準(zhǔn)療法3第二頁，共五十四頁。腫瘤藥物與相關(guān)靶標(biāo)第三頁，共五十四頁。4如何實現(xiàn)個體化用藥？分子分型藥物療效第四頁，共五十四頁。目前的服務(wù)目前的平臺目前的客戶腫瘤TaqMan-ARMs醫(yī)院感染性疾病測序健康管理公司新生兒篩查實時定量PCR研究所qPCR-HRM藥廠循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）保險公司第五頁，共五十四頁。體細(xì)胞基因突變檢測mRNA表達(dá)檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)檢測基因多態(tài)性檢測第六頁，共五十四頁。體細(xì)胞基因突變檢測EGFR,K-RAS,B-RAF，C-KIT第七頁，共五十四頁。1、基因突變檢測技術(shù)

8——qPCR-HRM（可用于血漿標(biāo)本檢測）——Taqman-ARMS（與國際獲批的技術(shù)相當(dāng)）——DNA測序（基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)）第八頁，共五十四頁。突變檢測技術(shù)之一TAQMAN-ARMS9所有定量PCR儀均可使用。

主要用于各類組織，包括手術(shù)、穿刺或鏡檢組織類。2小時即可完成檢測試劑盒商業(yè)化程度高，臨床認(rèn)可程度高

國內(nèi)已有試劑盒獲批SFDA第九頁，共五十四頁。突變檢測技術(shù)之一

QPCR-HRM10qPCR-HRM技術(shù)是基于高效穩(wěn)健的PCR上的高分辨熔解曲線分析（High-ResolutionMelting）技術(shù)，靈敏度可以達(dá)到1%-0.1%，既能檢測已知突變，也能檢測未知突變。

qPCR-HRM的突變檢測已獲國際多中心雙盲實驗驗證（JournalofMolecularDiagnostics,Vol.11,No.6,November2009）。實例圖：利用HRM技術(shù)對7個樣本分別進(jìn)行EGFR（左圖）、KRAS（右圖）突變檢測，紅色表示該樣本發(fā)生突變，藍(lán)色表示未突變，藍(lán)色橫直線為陰性對照。左圖顯示2個樣本發(fā)生了EGFR突變；右圖顯示4個樣本發(fā)生了KRAS突變。EGFRKRAS第十頁，共五十四頁。11血漿EGFR突變檢測：18號外顯子：無突變19號外顯子：突變20號外顯子：無突變21號外顯子：無突變附圖主要特點：

實現(xiàn)血漿中來自腫瘤的微量DNA的突變檢測。

目前所做的臨床實驗中，血漿EGFR檢測結(jié)果與其手術(shù)標(biāo)本之間的整體符合率符合率達(dá)到91.25%。

是臨床上不能手術(shù)、也同時不愿穿刺患者的替代檢測方案；也可獲得性耐藥進(jìn)行預(yù)先檢測。qPCR-HRM用于血漿微量突變檢測第十一頁，共五十四頁。國際公認(rèn)的分子檢測金標(biāo)準(zhǔn)有明確的物價收費實驗流程較復(fù)雜，需要大型儀器突變檢測技術(shù)之一

DNA測序第十二頁，共五十四頁。腫瘤類型靶向藥物基因療效佳的情況非小細(xì)胞肺癌易瑞沙（Iressa）特羅凱（Tarceva）EGFRKRASEGFR突變/KRAS野生胃腸間質(zhì)瘤格列衛(wèi)（Gleevec）C-KitC-kit第11外顯子突變/PDGFR突變結(jié)直腸癌愛必妥KRASBRAF野生型突變檢測項目列舉第十三頁，共五十四頁。EGFR突變檢測EGFRE19/E21敏感突變

適合使用TKI藥物治療耐藥位點檢測T790M第十四頁，共五十四頁。K-RAS突變檢測第十五頁，共五十四頁。BRAFNCCN2010年NCCN《結(jié)直腸癌臨床實踐指南》指出：K-ras基因為野生型而同時具有BRAFV600E突變的患者，靶向EGFR抗體治療無效。BRAF-V600E檢測腫瘤學(xué)臨床實踐指南（中國版）2010第一版第十六頁，共五十四頁。指導(dǎo)腫瘤靶向治療的靶標(biāo)藥物名稱檢測靶標(biāo)檢測內(nèi)容檢測結(jié)果預(yù)測內(nèi)容吉非替尼/厄洛替尼EGFR基因突變野生型耐藥突變型敏感西妥昔單抗K-ras，B-raf基因突變野生型敏感突變型耐藥伊馬替尼C-Kit基因突變野生型耐藥突變型敏感第十七頁，共五十四頁?；蚨鄳B(tài)性檢測與藥物代謝毒性(UGT1A1,CYP,DPD)第十八頁，共五十四頁。2023/5/519單核苷酸多態(tài)性（SNP）是最常見的基因變異至少1%的人群絕大多數(shù)人群共有序列GtoCSNP

位點變異的序列最常見的基因多態(tài)性SNP第十九頁，共五十四頁。2023/5/520為什么

SNPs重要?個體1個體2=SNPvariationsinDNASNP標(biāo)志基因A基因B基因ASNP可能使基因B產(chǎn)生變異的蛋白質(zhì)分子第二十頁，共五十四頁。2023/5/521個體的SNP譜SNP譜ASNP譜BSNP譜CSNP譜FSNP譜ESNP譜D第二十一頁，共五十四頁。2023/5/522SNP譜有助于確定藥物的療效和副作用乳腺癌病人個體的SNP譜可以分成不同的類型SNP譜A對藥物有期望的反應(yīng)對藥物沒有期望的反應(yīng)SNP譜A的人對藥物有期望的反應(yīng)SNP譜ESNP譜BSNP譜CSNP譜D第二十二頁，共五十四頁。藥物代謝與SNP檢測化療藥物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、代謝、分布和清除，通過其活性物質(zhì)對治療靶點的直接攻擊而發(fā)揮作用，整個過程需要多種蛋白質(zhì)/酶的共同參與和協(xié)同作用。SNP主要是指在基因組水平上變異頻率大于1%的單核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，多態(tài)性會導(dǎo)致不同個體體內(nèi)各種蛋白，酶活性的差異，因此導(dǎo)致藥物使用情況的不同。第二十三頁，共五十四頁。膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因（UGT1A1）UGT1A1*27(C686A)或UGT1A1*28[(TA)7TAA]:

野生型：6個TA

UGT1A1*6(G211A)：使UGT1A1的轉(zhuǎn)錄活性下降了三分之二。導(dǎo)致對伊立替康的毒性增加。FDA提示：UGT1A1的多態(tài)性-伊立替康的毒性增加(6TA)此型的酶活性是野生型的49％

。第二十四頁，共五十四頁。CYP19A1多態(tài)性影響芳香化酶抑制劑療效25CYP19A1是芳香化酶的編碼基因，臨床研究已證實有著很大的影響作用。在接受芳香化酶抑制劑治療的乳腺癌患者中，攜帶CYP19A1基因rs4646（G>T）突變患者的治療效果較無此突變的患者顯著2-4（下圖）。CYP19A1rs4646（G>T）SNP是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制劑治療療效的有效預(yù)測指標(biāo)。

如圖一項對乳腺癌患者的臨床研究顯示：CYP19A1基因rs4646突變的患者使用芳香化酶抑制劑藥物療效明顯優(yōu)于野生型患者（p<0.0001）1。參考文獻(xiàn)

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4.FaschingPAetal.BreastCancerResTr.2008;112:89-98.第二十五頁，共五十四頁。基因表達(dá)檢測（mRNA表達(dá)）(ERCC1\BRCA1\TUBB3\TS)第二十六頁，共五十四頁?；虮磉_(dá)檢測指標(biāo)（靶向藥物）相關(guān)腫瘤藥物名稱檢測靶標(biāo)檢測內(nèi)容檢測結(jié)果預(yù)測內(nèi)容結(jié)直腸癌貝伐單抗VEGFRmRNA表達(dá)水平高療效好低療效差乳腺癌曲妥珠單抗HER-2FISH/mRNA表達(dá)水平高療效好低療效差肝癌索拉非尼pDGFRmRNA表達(dá)水平低療效好高療效差第二十七頁，共五十四頁。28靶向藥物項目名稱樣本結(jié)果療效關(guān)系曲妥珠單抗HER2乳腺癌（手術(shù)/穿刺）+陽性療效好↑-↓HER2基因表達(dá)檢測采用RT-PCR方法替代FISH或免疫組化方法，臨床準(zhǔn)確率達(dá)97%以上。主要特點：客觀，不用人為觀察。時間短，整個檢測60分鐘左右完成。高通量，一次可以檢測6人份。第二十八頁，共五十四頁。PDGFRα低表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期和總生存期明顯長于高表達(dá)患者索拉菲尼檢測基因-PDGFR第二十九頁，共五十四頁。貝伐單抗檢測基因-VEGFR第三十頁，共五十四頁。化療藥物與檢測靶標(biāo)藥物名稱檢測靶標(biāo)檢測內(nèi)容奧沙利鉑/卡鉑/順鉑ERCC1/BRCA1mRNA表達(dá)水平

5-FU/培美曲賽TSmRNA表達(dá)水平紫杉醇/多西紫杉醇/長春瑞濱STUBB3,STMN1mRNA表達(dá)水平替莫唑胺MGMTmRNA表達(dá)水平阿霉素/表柔比星TOPOⅡamRNA表達(dá)水平吉西他濱RRM1mRNA表達(dá)水平第三十一頁，共五十四頁。ERCC1表達(dá)與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)ERCC1陰性患者，能從鉑類輔助化療中獲益.第三十二頁，共五十四頁。BRCA1/2表達(dá)與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)BRCA1過度表達(dá)鉑類耐藥的預(yù)測因子抗微管類藥物的敏感因子第三十三頁，共五十四頁。34低TSmRNA水平的腫瘤患者接受氟類化療的效果較好，中位生存期較長。

TS低表達(dá)的患者對培美曲賽的療效好。TS高表達(dá)影響氟類和培美曲塞藥效ShirotaYetal.JClinOncol.2001;19:4298-304第三十四頁，共五十四頁?；熕幬锱c檢測靶標(biāo)藥物名稱檢測靶標(biāo)檢測內(nèi)容檢測結(jié)果預(yù)測內(nèi)容奧沙利鉑/卡鉑/順鉑ERCC1/BRCA1mRNA表達(dá)水平

高療效差低療效好5-FU/培美曲賽TSmRNA表達(dá)水平高療效差低療效好紫杉醇/多西紫杉醇/長春瑞濱STUBB3,STMN1mRNA表達(dá)水平高療效差低療效好替莫唑胺MGMTmRNA表達(dá)水平高療效差低療效好阿霉素/表柔比星TOPOⅡamRNA表達(dá)水平高療效好低療效差吉西他濱RRM1mRNA表達(dá)水平高療效差低療效好第三十五頁，共五十四頁。小結(jié)分子靶標(biāo)分類靶向藥物靶標(biāo)基因突變EGFR突變K-RAS突變B-RAF突變基因表達(dá)VEGFR表達(dá)pDGFR表達(dá)HER-2表達(dá)化療藥物靶標(biāo)基因表達(dá)ERCC1表達(dá)TS表達(dá)RRM1表達(dá)基因多態(tài)性UGT1A1多態(tài)性CYP19A1多態(tài)性DPD多態(tài)性第三十六頁，共五十四頁。藥物名稱靶標(biāo)檢測內(nèi)容化療藥物鉑類ERCC1，BRCA1mRNA水平，2項XRCC1，

GSTP1，

MRP2基因多態(tài)性，4項（女，6項）BRCA1(女)異環(huán)磷酰胺CYP2C9*3基因多態(tài)性，1項絲裂霉素NQO1基因多態(tài)性，1項依托泊苷TopoⅡαmRNA水平，1項CYP3A4*4,MDR1基因多態(tài)性，2項紫杉醇/多西紫杉醇/長春瑞濱TUBB3,STMN1mRNA水平，2項CYP8*3基因多態(tài)性，1項伊立替康UGT1A1*6,

UGT1A1*28基因多態(tài)性，2項吉西他濱RRM1mRNA水平，1項CDA基因多態(tài)性，1項培美曲賽TSmRNA水平，1項靶向藥物吉非替尼/厄洛替尼EGFR(Exon19/20/21)基因突變，3項西妥昔單抗K-ras,B-raf基因突變，3項EGFRmRNA水平，1項貝伐單抗VEGFRmRNA水平，1項NSCLC個體化用藥系統(tǒng)方案第三十七頁，共五十四頁。

遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC)是由DNA錯配修復(fù)基因（MMR)發(fā)生基因突變導(dǎo)致的一種單基因的顯性遺傳疾病，又稱lynch綜合癥，發(fā)生基因異常的個體其患發(fā)結(jié)直腸癌的風(fēng)險約為60%。HNPCC實驗室檢測流程

第三十八頁，共五十四頁。1背景介紹之HNPCC與MMRMSI目前已發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致人類HNPCC發(fā)生的MMR有MSH2、MLH1、MSH6、PMS1、PMS2，其中MSH2和MLH1基因的功能最重要，其突變占已發(fā)現(xiàn)突變的90%左右。39第三十九頁，共五十四頁。1背景介紹之HNPCC與MMRMSI研究顯示，

約有86%-95%的HNPCC具有MSI特征，

而散發(fā)型大腸癌中只有16%。MSI所產(chǎn)生的遺傳不穩(wěn)定性將加速惡性腫瘤的發(fā)生。1997年美國NCI(nationalcancerinstitution)將MSI確定為檢測和篩選HNPCC的重要方法之一，并推薦將BAT26、BAT25、D2S123、D5S346和D17S2505個位點作為檢測HNPCC的位點。40第四十頁，共五十四頁。實驗室檢測流程MSI檢測MLH1，MSH2，MSH6突變篩查MLH1，MSH2，MSH6熱點突變檢測第四十一頁，共五十四頁。HNPCC檢測項目檢測名稱檢測技術(shù)臨床意義MSI（5個位點）PCR+片段分析法HNPCC風(fēng)險評估明確是否檢測MMR突變MLH1,MSH2,MSH6基因突變檢測（35個外顯子）DNA測序HNPCC鑒別診斷確定突變位點，評估家族中高危個體風(fēng)險熱點突變檢測DNA測序確定家族中是否存在已知的突變第四十二頁，共五十四頁。標(biāo)本要求檢測名稱標(biāo)本要求MSI檢測病理蠟塊一份（或白片10片），外加5ml抗凝外周血，4度運(yùn)達(dá)MLH1,MSH2,MSH6基因突變檢測病理蠟塊一份（或白片10片），常溫運(yùn)達(dá)熱點突變檢測5ml抗凝外周血，4度運(yùn)達(dá)第四十三頁，共五十四頁。腫瘤在變"WecanlookattumorsforchangesattheDNA,RNAandproteinlevels.Itcertainlygivesusawayoflookingatwhatishappeninginsideatumor,andthat'sveryexciting."

Dr.GordonMillsChairSystemsBiologyMDAndersonCancerCenterHouston,TxAsreportedin“TheCancerTest”–TIME

(June

14,2007)第四十四頁，共五十四頁。循環(huán)腫瘤細(xì)胞1869年AustMedJ，Ashworth最早在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀察到。2005年NEnglJMed，Cristofanilli證實治療前CTC數(shù)目是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無進(jìn)展生存期和總生存期的獨立預(yù)測因子。循環(huán)腫瘤細(xì)胞指從實體瘤中脫離出來并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。原發(fā)腫瘤血管生成侵潤侵入血管內(nèi)侵入血管外

(CTC)血管內(nèi)增殖

(CTM)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移播散腫瘤細(xì)胞（DTC）微轉(zhuǎn)移休眠灶循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）循環(huán)腫瘤

微栓（CTM）凋亡的CTC侵潤腫瘤細(xì)胞

擴(kuò)增血管生成上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）間質(zhì)－上皮轉(zhuǎn)化（MET）轉(zhuǎn)移到骨髓和其他器官第四十五頁，共五十四頁。獲取CTC需要解決的技術(shù)問題從紅細(xì)胞和白細(xì)胞中富集惡性腫瘤細(xì)胞

將惡性腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞、白細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等區(qū)分開來每10mL血液中可能僅含有幾個到幾十個循環(huán)腫瘤細(xì)胞，而10mL血液中含有的白細(xì)胞約有1億個，紅細(xì)胞有500億個。第四十六頁，共五十四頁。三種技術(shù)過濾法ISET:

IsolationbySizeofEpithelialTumorcells8μm孔徑過濾膜，漏檢體積較小的腫瘤細(xì)胞敏感性低梯度密度法腫瘤細(xì)胞和單核細(xì)胞密度小于1.077g/mlCTC純度低，混入較多白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞會遷移至血漿層，而聚集后容易下沉聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)對細(xì)胞有毒性免疫磁珠法腫瘤細(xì)胞表面抗原EpCAM與包繞著磁珠的特異性單抗相結(jié)合CellSearch細(xì)胞保存方法長達(dá)96小時實驗室室間差異小EpCAM的假陽性和假陰性第四十七頁，共五十四頁。90年代中期開始摸索捕獲、分析CTC的方法1999-2003大量臨床實驗建立CellSearch與CTC的臨床相關(guān)數(shù)據(jù)2004獲得美國FDA批準(zhǔn)用于臨床2009ClevelandClinic十大醫(yī)學(xué)突破第一名

2009PrixGalienUSA最佳醫(yī)學(xué)技術(shù)獎2010.1中國CTC在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌上的應(yīng)用注冊實驗

2011.5

CTC在小細(xì)胞肺癌上的應(yīng)用實驗研究

……CELLSEARCH是全球第一也是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于臨床的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）產(chǎn)品1983磁流體第四十八頁，共五十四頁。白細(xì)胞Anti-CD45CD45NucleusDAPI如何鑒別出CTC?藻紅蛋白

(PE)變藻藍(lán)蛋白(APC)CTCAnti-EpCAM磁珠Anti-CK-PENucleusDAPICKEpCAM在CellSearch?檢測中，CTC被設(shè)定為：EpCamC