魚(yú)骨鈣肽螯合物的制備和性質(zhì)

魚(yú)骨鈣肽螯合物的制備和性質(zhì).前言1.1鱈魚(yú)的基本成分及研究現(xiàn)狀 隨著我國(guó)漁業(yè)捕撈與養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，水產(chǎn)品的產(chǎn)量逐年增加。我國(guó)漁業(yè)養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全球養(yǎng)殖產(chǎn)量的70%，是世界上國(guó)家中唯一養(yǎng)殖產(chǎn)量超過(guò)捕撈量的國(guó)家。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2008年我國(guó)淡水產(chǎn)品的總產(chǎn)量就高達(dá)2000多萬(wàn)噸，較去年增長(zhǎng)了3.12%[1]。水產(chǎn)品產(chǎn)量逐年增加的同時(shí)產(chǎn)生的下腳料如魚(yú)頭、魚(yú)骨等也越來(lái)越多。目前我國(guó)對(duì)下腳料的利用方面主要集中于水解蛋白、魚(yú)露等方面，如何高效地利用水產(chǎn)品下腳料成為了當(dāng)今熱門(mén)研究的一個(gè)重要方面，也是推進(jìn)科學(xué)發(fā)展觀、建設(shè)高效節(jié)能社會(huì)的一項(xiàng)重要舉措。鱈形目魚(yú)類作為一種分布及其廣泛的魚(yú)類，在各大洋均有分布。這種魚(yú)類生活主要生活在深海中下層以及底層，屬于冷水性魚(yú)類的范疇[2]。其中鱈科和無(wú)須鱈科中有需要中重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鱈魚(yú)是我國(guó)遠(yuǎn)洋捕撈的重要捕撈魚(yú)種之一，每年的捕撈量超過(guò)10萬(wàn)噸，本研究以鱈魚(yú)骨為原料，對(duì)其進(jìn)行高效利用，有望開(kāi)發(fā)一種高效膠原蛋白提取工藝及高效鈣補(bǔ)充劑，推進(jìn)深海魚(yú)的綜合開(kāi)發(fā)利用。1.2膠原蛋白1.2.1膠原蛋白的概述膠原蛋白的定義是：一種結(jié)構(gòu)蛋白，主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），結(jié)構(gòu)中含有由α鏈組成的一個(gè)或數(shù)個(gè)三螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，即膠原域[3]。膠原蛋白作為一種生物組織結(jié)構(gòu)蛋白，是生物機(jī)體結(jié)締組織和間質(zhì)組織主要的纖維組織成分，也是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的一類功能性蛋白，占蛋白總量的25%左右。在許多海洋生物體內(nèi)，膠原蛋白占總蛋白含量高達(dá)80%以上。有支撐保護(hù)機(jī)體、結(jié)合及形成界隔等作用，還具有轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)、運(yùn)輸細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等功能。膠原蛋白作為在食品、醫(yī)藥、組織工程、化妝品等領(lǐng)域被廣泛研究的重要蛋白質(zhì)，具有優(yōu)良的生物相容性，易生物降解性，低抗原性的特性使得其在人體更易被人體吸收，同時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞的成活生長(zhǎng)，促進(jìn)血小板的凝結(jié)等[4]。1.2.2膠原蛋白的分類表1-1膠原蛋白的類別、組成及其在組織中的分布（Gelseetal.，2003）[3]Table1-1Compositionanddistributionofvariouscollagentypes其中成纖維膠原蛋白含量最豐富，分布最廣泛。占膠原蛋白家族的90%左右。但由于膠原蛋白的結(jié)構(gòu)組成、復(fù)雜程度各不相同，且存在著非螺旋結(jié)構(gòu)域、聚集特性和功能等的差異，因此被劃分為多種類型[21]。被發(fā)現(xiàn)且已報(bào)道的膠原蛋白就多達(dá)26種（Gelseetal.，2003）。1.2.3膠原蛋白的理化性質(zhì)凝膠特性膠原蛋白凝膠的形成，是膠原蛋白分子之間以及膠原蛋白與溶劑之間展開(kāi)相互作用的共同結(jié)果。凝膠過(guò)程主要包括蛋白分子結(jié)構(gòu)的變形、有序再排列，到最后三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成[5]。形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能固定較多的水分。但其凝膠強(qiáng)度依然有限，在改善膠原凝膠的凝膠強(qiáng)度和抗降解能力，目前主要研究的方法包括紫外線照射交聯(lián)、熱交聯(lián)、高壓處理以及化學(xué)交聯(lián)劑戊二醛等[6]，但是研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)交聯(lián)劑對(duì)人體具有一定的毒性，因此現(xiàn)階段尋找優(yōu)良的天然交聯(lián)劑成為新的研究熱點(diǎn)。熱穩(wěn)定性不同膠原蛋白的氨基酸組成存在差異。而亞氨酸（指脯氨酸和羥脯氨酸）的含量是膠原蛋白熱穩(wěn)定性的決定性因素之一[7]。研究發(fā)現(xiàn)，深海冷水魚(yú)類的亞氨酸含量低于哺乳類動(dòng)物。其它性質(zhì)膠原蛋白分子之間相互作用產(chǎn)生的性質(zhì)，如凝膠性、沉淀性等[8]；蛋白質(zhì)與水相互作用的性質(zhì)如持水性、吸水性、溶脹性和黏度等；已經(jīng)發(fā)泡性、乳化性等表面性質(zhì)等。1.2.4膠原蛋白的應(yīng)用化妝品中的應(yīng)用化妝品的組成、結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)決定了其具有美容、保濕、防皺、修復(fù)、減肥等功效。膠原蛋白作為脊椎動(dòng)物結(jié)締組織中的一類非水溶性纖維蛋白質(zhì)，對(duì)人體皮膚具有重要作用和意義[9]。因膠原蛋白的結(jié)構(gòu)與人體皮膚膠原的性質(zhì)相似，所以將其作為活性物質(zhì)用于化妝品中時(shí)，膠原蛋白可擴(kuò)散至深層皮膚，修復(fù)補(bǔ)充甚至增強(qiáng)皮膚本身的膠原蛋白活性，保持角質(zhì)層水分的穩(wěn)定性和纖維結(jié)構(gòu)的完整性[10]。促進(jìn)皮膚組織新陳代謝、皮膚除皺保濕等作用。生物材料中的應(yīng)用膠原蛋白具有較強(qiáng)的親和力、較弱的抗原性、良好的生物相容性和生物降解安全性等的特點(diǎn)，使得膠原蛋白可作為性能優(yōu)良的生物材料。目前應(yīng)用主要有：制作止血粉、皮膚移植材料、組織工程支架等[10]。飼料方面的應(yīng)用以制革的殘次皮料、皮角余料等為原料、主要運(yùn)用物理和化學(xué)的方法處理得到蛋白質(zhì)產(chǎn)品。水解膠原蛋白作為動(dòng)物源蛋白營(yíng)養(yǎng)添加劑之一，替代或部分替代魚(yú)粉，應(yīng)用于混合飼料中，具有良好的營(yíng)養(yǎng)效果和經(jīng)濟(jì)效益[11]。1.3生物活性肽1.3.1生物活性肽的概述生物活性肽（BioactivePeptides，BAP）是一類相對(duì)分子質(zhì)量不大于6000Da、對(duì)生物生命活動(dòng)具有多種生理學(xué)功能的肽類化合物的總稱[20]。天然存在的活性肽包括肽類化合物、激素等生物次級(jí)代謝產(chǎn)物以及各種組織生物系統(tǒng)如骨骼、肌肉、消化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的多肽[12]。目前研究較多的海洋活性肽主要來(lái)源于海鞘、海星、海藻、海膽、魚(yú)貝類等的活性肽以及海洋生物中分布廣泛的生物防御素[13]。1.3.2生物活性肽的結(jié)構(gòu)生物活性肽的結(jié)構(gòu)是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一種幾個(gè)或幾十個(gè)不同氨基酸組成，通過(guò)磷酸化、糖基化或?；恍揎椧约安煌呐帕许樞蚨纬傻囊环N復(fù)雜程度各異的多肽。多數(shù)生物活性肽通常情況下以非活性結(jié)構(gòu)形式存在于蛋白質(zhì)鏈中，在發(fā)揮作用之前會(huì)被特異的蛋白酶水解出來(lái)并轉(zhuǎn)運(yùn)至作用部位發(fā)揮功效。1.3.3生物活性肽的功能及利用生物活性肽具有廣泛的生理功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒甚至抗癌等優(yōu)良功效[14]。而這些功能是蛋白質(zhì)和分解后的氨基酸所不具備的，且許多生物活性肽的組成氨基酸是非必需氨基酸，為人們一直認(rèn)為生物效價(jià)不高的蛋白質(zhì)資源提供了光明的前景。生物活性肽不僅具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，同時(shí)易被人體消化吸收,由動(dòng)物蛋白水解后的多肽制成的補(bǔ)鈣劑，使得小腸對(duì)鈣的吸收增加，同時(shí)有利于鈣在骨骼中的沉積，且這種吸收方式不需要VD的參與[15]。而人體一般都是通過(guò)日常飲食攝入一定量的蛋白質(zhì)、脂肪等大分子高聚物，蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白酶水解為多肽，然后再經(jīng)過(guò)各種因子的激活才能轉(zhuǎn)化為生物活性肽發(fā)揮作用，糖類則通過(guò)糖酵解、三羧酸循環(huán)等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。如果在體外通過(guò)酶解等途徑先轉(zhuǎn)化為活性肽再攝入體內(nèi)，這樣不但降低了過(guò)敏性蛋白對(duì)特定人群的影響，有利于人體的消化吸收，同時(shí)減少了大分子蛋白質(zhì)在體內(nèi)的代謝過(guò)程，降低了代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)對(duì)人體帶來(lái)危害的風(fēng)險(xiǎn)。1.4鈣的介紹1.4.1鈣的分布及重要性鈣是人體代謝和各種生理活動(dòng)的重要元素之一，對(duì)人體的生命健康有著不可替代的作用[16]。人體質(zhì)量的1.4%都是鈣。總重約1200g至1300g[17]，無(wú)論在神經(jīng)、骨骼、血液中，都含有Ca2+結(jié)合的物質(zhì)。99%鈣以骨鹽形式存在于骨骼和牙齒中，骨骼中的鈣主要以非晶體的磷酸氫鈣（CaHPO4）和晶體形式的羥基磷灰石（Ca10（PO4）6（OH）2）兩種形式存在，同時(shí)骨骼又是鈣沉積的主要部位，因此素有“鈣庫(kù)”之稱。構(gòu)成人體的結(jié)構(gòu)骨架。剩下的1%參與人體的新陳代謝，神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮、激素釋放、血液的凝結(jié)等均缺少不了鈣的參與。而鈣代謝的平衡與否是衡量人體健康的重要因素之一[18]。營(yíng)養(yǎng)研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)居民人均鈣攝入量普遍較低，僅達(dá)到推薦用量的40%至50%左右。而鈣攝入量的缺少會(huì)導(dǎo)致多種疾病，同時(shí)也必將影響到人體的正常生理代謝和新陳代謝。1.4.2人體鈣吸收代謝機(jī)理人體的十二指腸和空腸是鈣吸收的主要場(chǎng)所。鈣的吸收主要包括兩個(gè)途徑：（1）飽和的跨細(xì)胞途徑，受鈣結(jié)合蛋白（CaBP）調(diào)節(jié)；（2）不飽和的旁細(xì)胞途徑，不直接受到營(yíng)養(yǎng)性或功能性因子的影響?？缂?xì)胞途徑主要在近端腸（主要是十二指腸），主要包括三個(gè)步驟；（1）剛進(jìn)入腸細(xì)胞的紋狀緣；（2）細(xì)胞自身的運(yùn)動(dòng)；（3）伸出基側(cè)膜。而旁細(xì)胞吸收途徑則存在于整個(gè)消化腸道。鈣進(jìn)入細(xì)胞是順電化學(xué)梯度的過(guò)程，并且會(huì)盡可能的利用鈣通道；而鈣從腸細(xì)胞內(nèi)“排出”是逆電化學(xué)梯度的一個(gè)過(guò)程，且受到Ca-ATP酶的調(diào)節(jié)，排出過(guò)程受到維生素D的調(diào)節(jié)，但不受速率的影響。鈣到達(dá)基側(cè)極與橫跨基側(cè)極的Ca-ATP酶結(jié)合，然后進(jìn)行磷酸化使得Ca-ATP酶構(gòu)象的改變。最終通過(guò)相應(yīng)的“通道”排出[19]。1.4.3居民補(bǔ)鈣情況表1-22002年中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況調(diào)查[23]Table1-2SurveyonnutritionandhealthofChineseresidentsin2002人群年齡推薦攝入量（RNI）（mg/日）實(shí)際攝入量（mg/日）＜6個(gè)月4003006個(gè)月~3歲6003003歲~11歲80030011歲~13歲100040013歲~16歲120040016歲~18歲1000400＞18歲800-1000500孕婦早期/孕婦晚期/乳母1000/1500/1500600/800/800老年人1000300通過(guò)表1-2我們不難發(fā)現(xiàn)，我國(guó)居民人均鈣攝入量普遍較低，僅達(dá)到推薦用量的40%至50%左右。而鈣攝入量的缺少會(huì)導(dǎo)致多種疾病，必將影響到人體的正常生理代謝和新陳代謝。鈣質(zhì)攝入不足不僅是我國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題，更是全球性的營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題。全球各個(gè)地區(qū)的營(yíng)養(yǎng)膳食結(jié)構(gòu)不同，我國(guó)居民主要以植物性膳食為主，而蔬菜谷物中的植酸、草酸等會(huì)與鈣形成不易被吸收的不溶性植酸鈣和草酸鈣，從而影響人體對(duì)鈣的吸收利用。因此較食用乳制品較多的歐美、澳大利亞等國(guó)家而言，缺鈣的現(xiàn)象尤為嚴(yán)重。這些表明，鈣攝入不足是我國(guó)各人群急需解決的問(wèn)題。2.實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備2.1主要試劑TCA（三氯乙酸)湖北興和化工有限公司高氯酸上海譜振生物科技有限公司氯胺-T上海建平化工有限公司4-二甲氨基苯甲醛Sigma公司丙烯酰胺Sigma公司酒石酸鉀鈉上海鶴善實(shí)業(yè)有限公司茚三酮博研(上海)生物技術(shù)有限公司Hyclone胎牛血清Sigma公司干酪素上海士鋒生物科技有限公司酪氨酸江蘇張家港市思普生化有限公司甘氨酸江蘇張家港市思普生化有限公司羥脯氨酸Sigma公司果糖湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司NaCO3，NaOH，CuSO4·5H2O，NaH2PO4·2H2O，KH2PO4，Na2HPO4·12H2O，無(wú)水乙醇，異丙醇，無(wú)水氯化鈣均為國(guó)產(chǎn)分析純。2.2主要酶制劑中性蛋白酶Sigma公司胰蛋白酶Sigma公司木瓜蛋白酶Sigma公司2.3主要儀器全自動(dòng)高溫高壓滅菌鍋上海茸研儀器公司小型高速粉碎機(jī)湖北振華醫(yī)療器械有限公司DS-1組織粉碎機(jī)上海比朗儀器有限公司普通天平（準(zhǔn)確至0.001g）上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司精密電子分析天平(準(zhǔn)確至0.000001g)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司SHA-B恒溫震蕩器國(guó)華電器有限公司冷凍干燥器德國(guó)MarinChrist公司LX-200微型離心機(jī)海門(mén)市其林貝爾儀器公司TG16MW臺(tái)式高速離心機(jī)湖南赫西儀器裝備有限公司電泳儀北京市六一儀器廠SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司W(wǎng)FZUV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)尼柯（上海）儀器有限公司PHS-3CpH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司移液槍賽默飛世爾科技有限公司XW-80A微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠有限公司HY-881-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱蘇州市豪悅電熱設(shè)備制造廠電磁爐美的集團(tuán)2.4主要試劑的配制2.4.1福林試劑（Folin試劑）清洗安裝2000mL磨口回流裝置，在裝置內(nèi)加入鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g，蒸餾水700mL，85%磷酸50mL，濃鹽酸100mL，小火微沸回流10h。卸下冷凝器，然后加入50g硫酸鋰（Li2SO4），50.0mL蒸餾水，震蕩搖勻，再想其中加滴入少許液溴，沸水浴15min，以驅(qū)逐殘溴除去顏色，使得溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需重復(fù)上述步驟，繼續(xù)加幾滴溴液，再煮沸除去之。室溫下冷卻后，定容至1000mL，用細(xì)菌漏斗（No4~5)過(guò)濾后置于棕色瓶中保存?zhèn)溆?。若此溶液稀釋濃度為原?lái)的三分之一時(shí)，即是后續(xù)使用的福林試劑使用液。2.4.2堿性銅試劑Folin-酚試劑甲液的配制是由A液與B液按50:1的比例混合即成。此試劑只能使用1天。A液的配制：4%碳酸鈉（Na2CO3）溶液與0.2mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液等比例混合；B液的配制：1%硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液進(jìn)行等比例混合。2.4.32%酪蛋白溶液使用分析天平準(zhǔn)確稱取干酪素2g，精確至0.002g，加入10mL的0.1mol/L氫氧化鈉溶液，在沸水浴中適當(dāng)加熱使其溶解，然后用pH7.2磷酸緩沖液定容至100mL，配制成的溶液即是2%酪蛋白溶液。配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入4℃冰箱保存。2.4.4100ug/mL酪氨酸溶液準(zhǔn)確稱取0.1000g在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸，逐滴加入6.0mL1mol/L鹽酸使其溶解，用0.2mol/LHCl定容至100mL，其濃度為1000ug/mL，再吸取此液10.0mL，以0.2mol/L鹽酸定容至100mL，即配成100ug/mL的酪氨酸溶液.配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入4℃冰箱保存。2.5.5pH7.5磷酸鹽緩沖液稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.50g以蒸餾水溶解定容至1000mL。3實(shí)驗(yàn)方法鱈魚(yú)樣品去除魚(yú)皮魚(yú)排人工取魚(yú)肉酶解魚(yú)排上的魚(yú)肉福林酚法測(cè)魚(yú)肉蛋白含量魚(yú)骨魚(yú)骨預(yù)處理酶解魚(yú)肉熱水抽提法提取魚(yú)骨蛋白茚三酮比色法測(cè)水解度福林酚法測(cè)魚(yú)骨蛋白含量魚(yú)骨蛋白中羥脯氨酸含量的測(cè)定魚(yú)骨蛋白SDS電泳冷凍干燥法制取干魚(yú)骨粉蛋白酶活力的測(cè)定魚(yú)骨蛋白酶解的酶用量實(shí)驗(yàn)酶解條件優(yōu)化試驗(yàn)茚三酮比色法測(cè)水解度SC-P-Ca（鈣肽螯合物）的制備SC-P-Ca的紅外光譜分析圖3-1實(shí)驗(yàn)工藝流程圖Figure3-1Experimentalprocesschart3.1鱈魚(yú)骨預(yù)處理將鱈魚(yú)從冷庫(kù)中取出并解凍，取出雜質(zhì)并用自來(lái)水沖洗干凈。采用適宜的酶解條件和酶解方法酶解，最后清洗收入封口袋置于冰箱凍藏備用。3.2熱水抽提魚(yú)骨明膠實(shí)驗(yàn)（膠原蛋白）3.2.1提取工藝流程取酶解處理后的魚(yú)骨→稱取30.0g干魚(yú)骨→魚(yú)骨粉碎（過(guò)200目篩）→高溫高壓滅菌鍋中處理30min→按料液比1:3的比例加水并于高速粉碎機(jī)中制成勻漿→70℃震蕩水浴鍋中熱水抽提膠原蛋白4h→高速離心機(jī)離心并取上清液→存于4℃冰箱備用。3.2.2提取率的測(cè)定（1）Folin-酚法測(cè)定蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 取7支試管，編號(hào)后，分別加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補(bǔ)足1.0mL，使每管含蛋白量分別為0ug、25ug、50ug、100ug、150ug、200ug、250ug。在每支試管中用移液槍分別加入5.0mL甲液，震蕩搖勻，在30℃恒溫水浴鍋中放置10min。再在每支試管中加入0.5mL乙液，立即震蕩混勻，30℃水浴鍋中保溫30min。準(zhǔn)確到30min后，以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白試管中的溶液為空白，在500nm下用1CM光徑的比色杯對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液進(jìn)行比色，測(cè)定吸光值。圖3-2牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure3-2Bovineserumproteinstandardcurve樣品的測(cè)定：將提取的上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?，?.0mL稀釋后的樣液于試管中，其他步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線一致，以標(biāo)準(zhǔn)曲線中的0mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液管為空白，測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中蛋白含量。η1=X1/Y1×100%η1：提取率（%）X1：提取上清液中蛋白含量Y1：原料中蛋白含量（2）羥脯氨酸含量的測(cè)定羥脯氨酸作為膠原蛋白的特征氨基酸，通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量可間接衡量膠原蛋白的含量。試劑的配制：緩沖液配制：分別稱取15.0g檸檬酸，45.0g醋酸鈉及7.5g氫氧化鈉，少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶。添加甘油145.0mL，最后蒸餾水定容溶液至刻度。高氯酸溶液：取70%高氯酸溶液27.0mL，定容至100mL。氯胺T試劑：稱取1.41g氯胺-T，使用上述緩沖液100mL進(jìn)行溶解（放置5℃冰箱中可保存一個(gè)月）發(fā)色劑配制：稱取4-二氨基苯甲醛10.0g，使用上述高氯酸溶液35.0mL進(jìn)行溶解，慢慢加入65.0mL異丙醇并不斷輕輕搖動(dòng)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取100mg烘干至恒重的羥脯氨酸粉末，蒸餾水溶解配制成濃度為1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)品貯備液稀釋至100mL，配制成濃度為10ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。分別取0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于各試管中，用蒸餾水補(bǔ)足到2.0mL。各試管中分別加入1.0mL氯胺-T溶液，25℃下放置20min。再各加入1.0mL發(fā)色劑，充分震蕩后放入60℃恒溫水浴鍋水浴15min，使用流動(dòng)的自來(lái)水對(duì)試管進(jìn)行冷卻3min至10min。在560nm處檢測(cè)吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3-3羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure3-3Hydroxyprolinestandardcurve樣品的測(cè)定：稱取2-3mg樣品，放于安培瓶中，依次加入6mol/LHCl（3mL），酒精噴燈封口，在130℃下進(jìn)行水解4h。取1.0mL水解液于100mL容量瓶中，滴入少許0.02%甲基紅指示劑，加入適量的NaOH溶液，調(diào)節(jié)溶液顏色直至淡黃色，之后用蒸餾水定容至100mL。取2.0mL上述溶液，用空白組樣品液進(jìn)行調(diào)零，在560nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中羥脯氨酸含量，然后進(jìn)行膠原蛋白含量的換算（×11.1）。η2=X2/Y2×100% η2：提取率（%）X2：提取上清液中羥脯氨酸含量Y2：原料中羥脯氨酸含量3.2.3工藝優(yōu)化試驗(yàn)（1）單因素試驗(yàn)表3-1抽提膠原蛋白優(yōu)化工藝參數(shù)Table3-1Collagenextractionprocessparametersoptimization12345高溫高壓軟化處理（min）1020304050料液比1：21：31：41：51：6提取溫度（℃）5060708090提取時(shí)間（h）246810采用4因素5水平單因素試驗(yàn)對(duì)熱水抽提膠原蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化。提取的膠原蛋白含量的多少作為該優(yōu)化試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。（2）響應(yīng)面試驗(yàn)選取料液比、高溫高壓軟化時(shí)間和水浴抽提溫度3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)如下：表3-2Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table3-2TestfactorsandlevelsandcodesinBox-Bchnkencentralcompositedesign自變量水平編碼編碼水平-101料液比X11：31：41：5高溫軟化時(shí)間（min）X2405060提取溫度（℃）X3708090表3-3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table3-3Responsesurfacetestdesigntable實(shí)驗(yàn)編號(hào)X1X4（min）X3（℃）110121-103-1104000500060-117-10-180009011100001101-11211013-1-10140-1-11500016-1011710-1采用羥脯氨酸法測(cè)定蛋白的提取率，測(cè)定的羥脯氨酸含量的多少作為該優(yōu)化試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。3.3魚(yú)骨膠原蛋白的SDS電泳實(shí)驗(yàn)采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）方法（LaemmLi1970）對(duì)魚(yú)骨蛋白樣品進(jìn)行分析。取干魚(yú)骨蛋白粉，用0.5mol/L醋酸溶液溶解，調(diào)節(jié)pH為中性，配制成濃度為1.0mg/mL的魚(yú)骨蛋白樣品溶液。取60ul樣品溶液，分別加入20ul4×樣品緩沖液，在沸水浴中煮沸2~10min，用微型離心機(jī)離心3~5min。取20ul上清液上樣。濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%，使用SDS-Tris-甘氨酸系統(tǒng)的電極緩沖液（含0.1%SDS，pH=8.3）進(jìn)行電泳。采用電壓為100V的直流恒壓電源，電泳2~3h。結(jié)束后放入平板中染色20min，后進(jìn)行脫色[21]。3.4蛋白酶活力測(cè)定（SB/T,10317-1999)3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的酪氨酸10mg，用蒸餾水定容至100mL，即成100ug/mL酪氨酸溶液。向6支試管中分別加入0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL的酪氨酸溶液，并補(bǔ)足至10.0mL，得到稀釋后的酪氨酸濃度分別為0ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、60ug/mL、80ug/mL、100ug/mL。取6支試管分別加入不同濃度酪氨酸溶液1.0mL，各加入0.4mol碳酸鈉5.0mL，再分別加入已稀釋的Folin試劑1.0mL。震蕩搖勻后，40℃水浴保溫發(fā)色20min，在波長(zhǎng)660nm下分別測(cè)定吸光值。一般測(cè)定3次，取平均值。以0ug/mL作為空白調(diào)零。表格如下：表3-4標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)表Table3-4Standardcurvetesttable試劑管號(hào)123456不同濃度酪氨酸(mL)1.01.01.01.01.01.00.4mol/LNa2CO3(mL)5.05.05.05.05.05.0Folin試劑(mL)1.01.01.01.01.01.0OD值102030平均0以酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3-4酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure3-4Standardcurveofthetyrosine3.4.2樣品稀釋液的制備準(zhǔn)確稱取酶粉50.00mg，加入pH7.2磷酸緩沖液定容至50mL，吸取此液5.0mL，再用緩沖液稀釋至25mL，即成5000倍酶粉稀釋液。3.4.3樣品的測(cè)定各取1.0mL樣品稀釋液，在40℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱2min，各加入1.0mL同樣40℃預(yù)熱的酪蛋白，精確保溫10min，保溫結(jié)束后立即加入2.0mL0.4mol/L三氯乙酸溶液以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于40℃恒溫水浴鍋中保溫20min，使不溶性蛋白質(zhì)沉降，于6000r/min高速離心機(jī)中離心5-10min，取上清液。取各濾液1.0mL，加0.4mol/L碳酸鈉5.0mL和已稀釋的Folin試劑1.0mL，搖勻，40℃保溫發(fā)色20min，后進(jìn)行吸光值測(cè)定。同時(shí)做空白試驗(yàn)和平行試驗(yàn)。3.4.4計(jì)算在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1ug酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。蛋白酶活力單位（干基）=A/10×4×N×1/（1-W）式中：A-樣品的OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)4-4mL反應(yīng)液取出1.0mL測(cè)定；N-酶液稀釋的倍數(shù)；10-反應(yīng)10分鐘；W-樣品水分百分含量。3.5鱈魚(yú)魚(yú)肉的酶解工藝3.5.1預(yù)處理首先取冷凍鱈魚(yú)樣品，用自來(lái)水沖洗30min至60min進(jìn)行化凍處理。人工去除魚(yú)皮并采取一定量魚(yú)肉，按1:1的比例加入蒸餾水，組織勻漿器以一定的轉(zhuǎn)速對(duì)魚(yú)肉進(jìn)行勻漿處理，處理后置于4℃冰箱保存。3.5.2操作步驟（1）酶解魚(yú)肉勻漿液取魚(yú)肉勻漿液5.00g置于錐形瓶中，按料液比1：4加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.2。向錐形瓶中加入2500U/g混合蛋白酶（中性蛋白酶和胰蛋白酶），酶解溫度為40℃，酶解時(shí)間為1.5h，在震蕩水浴鍋中鱈魚(yú)魚(yú)肉進(jìn)行酶解。準(zhǔn)確酶解后立即置于沸水浴中10min至15min，對(duì)混合酶進(jìn)行滅活處理。滅活后取出，室溫下放置10min。對(duì)酶解液進(jìn)行離心，收集上清液。3.5.3水解度的測(cè)定 采用茚三酮比色法（趙新淮等，1994）測(cè)定水解度。（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取50mg烘干至恒重的甘氨酸粉末，用蒸餾水溶解并定容至50mL。取2mL上述溶液定容至100mL，即成20ug/mL的甘氨酸溶液，再取上述20ug/mL溶液繼續(xù)稀釋成濃度為2ug/mL、4ug/mL、8ug/mL、12ug/mL、16ug/mL、20ug/mL的溶液。分別取各濃度稀釋液2.0mL于試管中，分別加入茚三酮顯色劑1.0mL，充分震蕩混勻后，于沸水浴中加熱15min，結(jié)束后立即置于冷水中冷卻。冷卻后各加入5.0mL預(yù)先配好的40%乙醇溶液，劇烈震蕩直至溶液棕紅色褪去，于室溫下放置5-10min。以蒸餾水調(diào)零，在570nm下測(cè)定吸光值。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，以甘氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3-5甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure3-5Standardcurveoftheglycine（2）樣品水解度的測(cè)定 對(duì)酶解離心后的上清液進(jìn)行50倍、100倍、150倍、200倍、250倍的稀釋處理。各試管中加入不同倍數(shù)稀釋液2.0mL，分別加入2.0mL茚三酮顯色劑，震蕩混勻后，沸水加熱15min,并作空白實(shí)驗(yàn)。其余步驟同上，測(cè)定各濃度樣品的吸光值。表3-5樣品稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)Table3-5Sampledilutionexperiment稀釋倍數(shù)A1A2平均值選擇501.5711.5681.5701000.7800.7790.7801500.5060.5060.5062000.3920.3900.391√2500.3000.3000.300 由上表3-5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)稀釋倍數(shù)為200倍時(shí)，吸光值處在較為合理的范圍內(nèi)。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶解液中的-NH2含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品需要同時(shí)測(cè)定。水解度的計(jì)算公式如下[15]： DH=×100%=[]÷htot×100%式中：DH-水解度（%）h-水解后每克蛋白質(zhì)被酶解釋放的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol）-NH2htot-每克蛋白質(zhì)原料中的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol），膠原蛋白取8.41N-原料中氮含量，取2.58。3.5.4工藝優(yōu)化試驗(yàn)（1）單因素試驗(yàn)表3-6魚(yú)肉酶解優(yōu)化工藝參數(shù)Table3-6Fishenzymatichydrolysisprocessparameters12345料液比1：21：31：41：51：6加酶量（U/g）15002000250030003500酶解溫度（℃）2030405060酶解時(shí)間（h）0.511.522.5 采用4因素5水平單因素試驗(yàn)對(duì)鱈魚(yú)魚(yú)肉酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以水解度的大小衡量工藝優(yōu)化的優(yōu)劣。3.6鱈魚(yú)骨膠原蛋白酶解工藝3.6.1預(yù)處理將提取并離心后的膠原蛋白（明膠）上清液進(jìn)行冷凍干燥處理，凍干后的干樣品收集至封口袋并置于干燥器中備用。3.6.2操作步驟稱取干樣品0.5g，用蒸餾水溶解并定容至50mL，即成1%底物溶液。酶用量的測(cè)定采用2000U/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL五種不同的酶量分別處理1%底物樣品溶液。實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：表3-7酶用量實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table3-7Enzymedosageparameters試劑試管號(hào)1（空白組）2（原液組）34567樣品液(mL)2.02.02.02.02.02.02.0酶量(mL)2.02.02.02.02.02.02.0酶解溫度(℃)50酶解時(shí)間(h)1.5滅活時(shí)間(min)15其中試管3/4/5/6/7分別加入已配好的2000U/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL濃度的酶液，于50℃震蕩水浴鍋中震蕩酶解。準(zhǔn)確酶解1.5h后，立即在沸水浴中對(duì)酶進(jìn)行滅活15min。滅活結(jié)束后室溫下放置5~10min，離心后取上清液。3.6.3水解度的測(cè)定 對(duì)酶解離心后的上清液進(jìn)行50倍、100倍、200倍稀釋處理。各試管中加入不同倍數(shù)稀釋液2.0mL，分別加入2.0mL茚三酮顯色劑，震蕩混勻后，沸水加熱15min,并作空白實(shí)驗(yàn)。其余步驟同3.6.1（3），測(cè)定各濃度樣品的吸光值。3.6.4工藝優(yōu)化試驗(yàn)單因素試驗(yàn)表3-8魚(yú)骨蛋白酶解工藝優(yōu)化參數(shù)Table3-8Fishproteinenzymaticprocessparameteroptimization1234酶解溫度(℃)30405060加酶量(U)3000400050006000酶解時(shí)間(h)0.511.52 采用3因素4水平單因素試驗(yàn)選取出3個(gè)對(duì)工藝優(yōu)化影響較大的因素，然后進(jìn)行正交試驗(yàn)。以水解度的大小等衡量各因素影響的差異。（2）正交試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用的條件是酶解溫度、酶量和酶解時(shí)間3各因素，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)。構(gòu)建試驗(yàn)采用L9_3_4正交表，所得正交試驗(yàn)表如下：表3-9正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table3-9Orthogonaldesigntable實(shí)驗(yàn)號(hào)123溫度（℃）加酶量（U）時(shí)間（h）13040001.023050001.533060002.044040001.554050002.064060001.075040002.085050001.095060001.53.7魚(yú)骨鈣肽螯合物制備工藝3.7.1操作步驟將魚(yú)骨酶解液進(jìn)行滅活、離心，取上清液。調(diào)節(jié)pH至8.5，按膠原蛋白與Ca2+的質(zhì)量比為2:1的比例加入相應(yīng)質(zhì)量的CaCl2。60℃的恒溫水浴鍋中水浴1.5h。水浴后加入6倍體積的純乙醇沉淀10min，用濾布作為濾層進(jìn)行抽濾，抽濾過(guò)程中需用純乙醇清洗。將紗布上的固體轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行冷凍干燥處理，備用。大致過(guò)程如下：魚(yú)骨膠原肽液→加入氯化鈣→調(diào)整pH值→恒溫水浴螯合→濃縮→醇沉→抽濾、洗滌→冷凍干燥制得成品。3.7.2螯合率的測(cè)定螯合產(chǎn)物用20.0mL蒸餾水溶解，采用EDTA絡(luò)合滴定法（GB/T-6436-2002）測(cè)定螯合產(chǎn)物的鈣含量，由下面公式計(jì)算螯合率[16]：螯合物=3.7.3工藝優(yōu)化試驗(yàn)單因素試驗(yàn)表3-10單因素試驗(yàn)參數(shù)Table3-10Singlefactortestparameters因素1234溫度（℃）40506070pH5.05.25.45.6肽鈣質(zhì)量比1:12:13:14:1（2）影響螯合率的因素多肽與鈣螯合工藝的主要影響因素有許多，一般認(rèn)為，影響多肽鈣螯合物合成工藝的因素包括：反應(yīng)pH值、多肽液濃度、肽鹽質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等[9]。高菲、王維有等人為了篩選出影響多肽-鈣螯合率的主要因素，應(yīng)用Mintab16軟件進(jìn)行N=6的Plackett-Burman設(shè)計(jì)。研究結(jié)果顯示，pH值和肽鹽質(zhì)量比對(duì)螯合率有極顯著影響，而溫度、時(shí)間和多肽濃度對(duì)螯合率的影響不顯著[10]。3.7.4傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析在紅外光照射下，將適量的鈣肽螯合物凍干樣品和烘干至恒重的光譜純KBr置于瑪瑙研缽中，混勻并研磨成粉末狀并壓片，后將壓片后的樣品放入樣品室。用Nicolet-200SXV傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品在4000-500cm-1區(qū)間掃描，設(shè)置分辨率為2cm-1。4結(jié)果與討論4.1熱水抽提骨膠原蛋白工藝條件研究4.1.1單因素試驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表4-1Folin-酚法測(cè)定蛋白濃度及提取率Table4-1Folin-phenolmethodforproteinconcentrationandextractionrate因素A1(500nm)A2(500nm)提取液體積(mL)蛋白濃×25(ug/mL)提取率(%)料液比1：20.5480.5780.5636012727.27017.551：30.5400.5380.5399012181.81825.201：40.3750.3750.3751208454.54523.321：50.2890.2890.2891506500.00022.411：60.2480.2380.2431805454.54522.57高溫軟化時(shí)間(min)100.4120.4000.406909159.09118.95200.4900.4660.4789010795.45522.34300.5400.5380.5399012181.81825.20400.6460.6510.6499014670.45530.35500.7040.6950.7009015829.54532.75提取時(shí)間(h)20.4500.4430.4479010079.54520.8540.5400.5380.5399012181.81825.2060.5200.5240.5229011795.45524.4080.5250.5250.5259011863.63624.55100.5270.5280.5289011920.45524.66提取溫度(℃)500.4000.4050.403909079.54518.79600.4740.4400.4579010318.18221.35700.5400.5380.5399012181.81825.20800.4370.4360.437909852.27325.09900.4420.4310.437909852.27325.09表4-2測(cè)定羥脯氨酸含量及提取率Table4-2Thedeterminationofhydroxyprolinecontentandextractionrate因素A1(560nm)A2(560nm)提取液體積(mL)羥脯氨酸濃度(ug/100mL)提取率(%)料液比1：20.3820.3810.3815100265.88345.231：30.3880.3920.390150272.77269.601：40.3460.3320.339200231.44378.741：50.2700.2720.271250176.33774.991：60.2090.2080.209300125.68964.14高溫軟化時(shí)間(min)100.2750.2780.277150180.79446.13200.3360.3340.335150228.20158.23300.4130.4190.416150293.84174.98400.4280.4270.428150303.16177.36500.4430.4370.440150313.29079.94提取時(shí)間(h)20.3080.3060.307150205.51152.4440.4090.4040.407150286.14373.0260.4050.4130.409150288.16973.5380.4180.4160.417150194.65275.19100.4170.4200.419150195.86775.50提取溫度(℃)500.3890.3900.390150272.36669.50600.4040.4140.409150288.16973.53700.4180.4150.417150294.24675.08800.4240.4260.425150301.13576.84900.4250.4230.424150300.32476.63（2）分析與討論1）料液比對(duì)提取率的影響圖4-1料液比對(duì)提取率的影響Figure4-1Effectofratiooffeedtoliquidonextractionrate合適的料液比會(huì)對(duì)骨膠原蛋白的提取率產(chǎn)生一定的影響，從圖4-1中我們不難看出，料液比1：2時(shí)提取率相對(duì)較低，而料液比在1：4左右時(shí)提取率達(dá)到最高。之后隨著液體比例的增加，提取率基本呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而且液體比例的增加意味著提取液的蛋白濃度降低，不利于后續(xù)膠原蛋白的離心、濃縮、凍干等操作。高溫軟化時(shí)間對(duì)提取率的影響圖4-2高溫軟化時(shí)間對(duì)提取率的影響Figure4-2Theeffectofhightemperaturesofteningtimeontheextractionrate實(shí)驗(yàn)分析了不同高溫高壓軟化時(shí)間對(duì)提取率的影響變化。從圖4-2中看出，高溫軟化時(shí)間在一定范圍內(nèi)與蛋白提取率成正相關(guān)，且影響顯著，當(dāng)高溫高壓軟化時(shí)間達(dá)到50min時(shí)提取率達(dá)到最大。因此可適當(dāng)增加高溫高壓軟化的時(shí)間以提高骨膠原蛋白的提取。同時(shí)也要考慮到高溫高壓軟化步驟的操作周期以及成本等因素，選取適當(dāng)?shù)母邷剀浕瘯r(shí)間。3）提取時(shí)間對(duì)提取率的影響圖4-3提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Figure4-3Effectofextractiontimeonextractionrate實(shí)驗(yàn)分析了不同的水浴提取時(shí)間對(duì)骨膠原蛋白提取率的影響差異，從圖4-3中可以看出，在提取時(shí)間從2h上升至4h時(shí)，蛋白提取率有較少的增加；而在4h之后隨著提取時(shí)間的增加，提取率基本保持不變。因此，水浴提取時(shí)間因素對(duì)蛋白提取率的影響較小。4）提取溫度對(duì)提取率的影響圖4-4提取溫度對(duì)提取率的影響Figure4-4Effectofextractiontemperatureontheextractionrate由圖4-4可知，溫度在50℃到70℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，蛋白的提取率呈上升趨勢(shì)；在70℃到90℃范圍內(nèi)，蛋白提取率穩(wěn)定保持不變。最優(yōu)蛋白提取工藝條件的選擇表4-3實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)Table4-3Experimentalconditionparameters編號(hào)12基本條件4563料液比1：21：31：41：51：6高溫軟化時(shí)間(min)1020304050水浴提取時(shí)間(h)246810水浴提取溫度(℃)5060708090以上表進(jìn)行作圖處理如下：圖4-5Folin-酚法測(cè)定蛋白提取率Figure4-5Folin-phenolmethodforproteinextraction圖4-6羥脯氨酸法測(cè)定蛋白提取率Figure4-6Determinationoftheextractionrateofproteinhydroxyprolinemethod由圖4-5及圖4-6中可知，對(duì)蛋白提取率影響較大的因素有高溫高壓軟化時(shí)間和料液比。當(dāng)料液比1：4、高溫軟化時(shí)間50min、水浴提取時(shí)間4h、提取溫度80℃時(shí)，提取率最高，達(dá)到79.97%。Folin-酚法與羥脯氨酸法比較福林酚法測(cè)定蛋白濃度顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品的酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用；并且此方法有蛋白特異性的影響，即不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量的不同而使顯色強(qiáng)度不同。本實(shí)驗(yàn)中利用福林酚法測(cè)定蛋白濃度時(shí)，在多次實(shí)驗(yàn)排除誤差之后發(fā)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果明顯偏低，分析原因可能是因?yàn)闇y(cè)定時(shí)反應(yīng)體系酸堿度以及存在其他物質(zhì)如巰基化合物、酚類等的原因。羥脯氨酸法測(cè)定膠原蛋白濃度具有高效準(zhǔn)確的特點(diǎn)，并且因?yàn)榱u脯氨酸是膠原蛋白中的特征氨基酸，可以通過(guò)羥脯氨酸濃度較為準(zhǔn)確的反應(yīng)膠原蛋白提取率，本實(shí)驗(yàn)中采取11.1的換算系數(shù)，及1mol羥脯氨酸代表11.1mol膠原蛋白。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方法準(zhǔn)確性高，重復(fù)性較好，可以作為反應(yīng)膠原蛋白濃度的檢測(cè)方法。4.1.2響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析對(duì)單因素試驗(yàn)進(jìn)行直觀分析，從中選取料液比、高溫高壓軟化時(shí)間和提取溫度三個(gè)因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行分析。試驗(yàn)因素及水平表如下：表4-4Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table4-4TestfactorsandlevelsandcodesinBox-Bchnkencentralcompositedesign自變量水平編碼編碼水平-101料液比X11：31：41：5高溫軟化時(shí)間（min）X2405060提取溫度（℃）X3708090根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、高溫高壓軟化時(shí)間和提取溫度三個(gè)因素為自變量，以膠原蛋白提取率為響應(yīng)值R1，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為中心試驗(yàn)用以用以估算誤差。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合回歸，以料液比（X1）、高溫高壓軟化時(shí)間（X2）、提取溫度（X3）為自變量，提取率為因變量（響應(yīng)值），建立二次多元回歸方程模型：R1（膠原蛋白提取率）=75.20-2.08X1+8.30X2+3.73X3-0.098X1X2-0.51X1X3-0.36X2X3-4.35X12-18.59X22+4.05X32圖4-7殘差正太分布圖Figure4-7Residualdistributionchart圖4-8ResidualsvsPredicted圖Figure4-8ResidualsvsPredictedchart表4-5響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table4-5Responsesurfacetestschemeandresults實(shí)驗(yàn)編號(hào)X1X2(min)X3(℃)提取率(%)110174.9321-1038.903-11065.83400075.66500072.4360-1160.657-10-173.87800076.69901169.871000072.721101-161.391211061.9513-1-1042.38140-1-150.721500078.5116-10180.601710-170.22表4-6回歸方程的方差分析Table4-6Analysisofvarianceofregressionequation方差來(lái)源自由度平方和均方FP（Pro＞F）顯著性X1134.7634.761.990.2012X21551.10551.1031.550.0008**X31111.30111.306.370.0396*X1X210.0390.0390.9638X1X311.031.030.0590.8154X2X310.521.030.0300.8674X12179.4979.494.550.0703X2211455.501455.5083.32＜0.0001**X32168.9068.903.940.0874模型92306.42256.2714.670.0009**殘差7122.2817.47失擬395.0831.694.660.0856純誤差427.216.80總和162428.71注：*顯著水平為0.05；**極顯著水平為0.01。·圖4-9料液比、高溫高壓軟化時(shí)間、提取溫度對(duì)提取率影響的三維曲面圖Figure4-9Dsurfacemapoftheeffectofmaterialliquidratio,hightemperatureandhighpressuresofteningtimeandextractiontemperature回歸方程的方差分析如上表4-6?；貧w方程中的各變量對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性由F檢驗(yàn)判定，概率值P（Pr＞F）的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度就越高。由表4-6我們可以看出，回歸方程達(dá)到了極顯著水平（p＜0.01），且失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），表明方程相對(duì)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合程度較好?？倹Q定系數(shù)R2=0.9497，表明自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，即該模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際試驗(yàn)值擬合較好，因此可利用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。 回歸方程各項(xiàng)系數(shù)的顯著性分析結(jié)果顯示，因素X2的線性效應(yīng)和平方效應(yīng)對(duì)蛋白提取率的影響呈現(xiàn)極顯著（p＜0.01），因素X3的線性效應(yīng)對(duì)蛋白提取率的影響顯著（p＜0.05）。利用Design-export7.0軟件在設(shè)定的因素水平內(nèi)對(duì)回歸方程進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)最優(yōu)提取工藝為：料液比1:4提取溫度79.46℃，高溫處理時(shí)間55.68Min，理論最高提取率為82.4216%。在此條件下做三組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終平均得率為82.35%，與預(yù)測(cè)相吻合。4.2魚(yú)骨蛋白的SDS電泳圖及分析31245圖4-10抽提蛋白的SDS電泳圖Figure4-10SDSelectrophoresisoftheextractprotein1-maker2、3、4、5-不同濃度的抽提蛋白液圖4-10為抽提的魚(yú)骨蛋白液的SDS電泳圖譜。電泳結(jié)果顯示，靠近點(diǎn)樣處的顏色較深，距點(diǎn)樣處較遠(yuǎn)的區(qū)域顏色較淺。說(shuō)明抽提蛋白液中的蛋白含量較高；且絕大多數(shù)抽提的魚(yú)骨蛋白的分子量較大，從幾kDa至幾百kDa均有分布；而分子量較小的魚(yú)骨蛋白較少，因此距點(diǎn)樣處較遠(yuǎn)的區(qū)域呈現(xiàn)的顏色較淺；同時(shí)也說(shuō)明了熱水抽提試驗(yàn)中抽提出的基本上都是魚(yú)骨蛋白，僅有極少量（或幾乎沒(méi)有）的蛋白被水解成多肽。4.3酶活力測(cè)定分析表4-7酶活力測(cè)定參數(shù)及數(shù)據(jù)Table4-7Parametersanddataforenzymeactivityassay酶的種類作用類型溫度（℃）pH酶活（U/g）中性蛋白酶內(nèi)切407.21.8×105胰蛋白酶復(fù)合酶（內(nèi)切+外切）407.21.7×105木瓜蛋白酶內(nèi)切406.51.1×104（失活）由于所測(cè)蛋白酶中，木瓜蛋白酶已經(jīng)失活，故采用中性蛋白酶、胰蛋白酶的混合酶作為酶解試驗(yàn)所使用的酶。4.4酶解魚(yú)肉蛋白條件研究4.4.1單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析表4-8酶解魚(yú)肉蛋白單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table4-8Singlefactortestdataforenzymatichydrolysisoffishprotein料液比1：21：31：41：51：6DH(%)51.6140.6835.5728.4725.33酶量（U/mL）15002000250030003500DH(%)32.9834.6033.9238.0837.87酶解溫度（℃）2030405060DH(%)23.7131.3635.5836.6033.75酶解時(shí)間(h)0.511.522.5DH(%)26.6028.8635.5835.8735.75料液比對(duì)水解度的影響圖4-11料液比對(duì)水解度的影響Figure4-11Effectoffeedliquidratioonhydrolysisdegre有上圖4-11可知，隨著料液比的升高，水解度逐漸下降，當(dāng)料液比在1:6時(shí)達(dá)到最低，僅為25.33%。水解溫度對(duì)水解度的影響

圖4-12水解溫度對(duì)水解度的影響Figure4-12Theeffectofhydrolysistemperatureondegreeofhydrolysis水解溫度是影響酶解程度的一個(gè)重要因素。不同的酶在一定的條件下都具有最適溫度范圍，溫度過(guò)高或過(guò)低都將使酶活降低，使得水解程度較低。而溫度過(guò)高會(huì)是酶出現(xiàn)不可逆變性，使得水解度很低，同時(shí)造成酶的浪費(fèi)。由圖4-12中可以看出，溫度從20℃至50℃升高的過(guò)程中，水解度是依次增大的；在溫度為50℃時(shí)，水解度達(dá)到最高，為36.60%。溫度繼續(xù)上升時(shí)，水解度下降。加酶量對(duì)水解度的影響圖4-13加酶量對(duì)水解度的影響Figure4-13Theeffectoftheamountofenzymeonthedegreeofhydrolysis加酶量的多少直接影響水解度的大小。由圖4-13中看出，在酶量1500U/g至2500U/g時(shí)，水解度僅有微弱變化；而酶量從2500U/g至3000U/g時(shí)，水解度明顯增大；之后繼續(xù)增加酶量，水解度微弱增長(zhǎng)。因此，選酶量為3000U/g左右時(shí)合適。4）酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響圖4-14酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Figure4-14Theeffectofhydrolysistimeonthedegreeofhydrolysis根據(jù)上圖4-14看出，酶解時(shí)間在0.5h至1.5h時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)，水解度逐漸上升；在1.5h后繼續(xù)增加酶解時(shí)間，水解對(duì)基本保持穩(wěn)定不變。所以選取1.5h左右作為酶解時(shí)間較為合適。4.5酶解魚(yú)骨膠原蛋白研究4.5.1單因素試驗(yàn)分析表4-9單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及參數(shù)Table4-9Singlefactortestdesignandparameter因素水平123（基本條件）4酶解溫度（℃）30405060酶量（U/g）3000400050006000時(shí)間（h）0.51.01.52.0表4-10酶解魚(yú)骨蛋白試驗(yàn)結(jié)果與分析Table4-10Withtheanalysisoftestresultsofframeproteinenzymolysis試驗(yàn)方案試驗(yàn)指標(biāo)試驗(yàn)編號(hào)酶解溫度（℃）酶量（U/g）時(shí)間（h）水解度（%）11（30）3330.45522（40）3335.97133（50）3338.37344（60）3332.866531（3000）331.417632（4000）335.421733（5000）338.967834（6000）340.0209331（0.5）21.56610332（1.0）27.46711333（1.5）38.82512334（2.0）38.977根據(jù)酶解魚(yú)骨蛋白的單因素試驗(yàn)水解度的綜合比較，選取溫度30℃、40℃50℃，酶量4000U/g、5000U/g、6000U/g，酶解時(shí)間1.0h、1.5h、2.0h，三個(gè)因素的三個(gè)水平進(jìn)行下面簡(jiǎn)單的3因素3水平正交試驗(yàn)確定最優(yōu)組合條件。4.5.2正交試驗(yàn)分析表4-11酶解魚(yú)骨膠原蛋白試驗(yàn)結(jié)果與分析Table4-11Withtheanalysisoftestresultsofenzymaticbonecollagen實(shí)驗(yàn)方案試驗(yàn)指標(biāo)試管號(hào)ABCA570nm（樣品稀釋100倍）DH(%)溫度(℃)酶量(U)時(shí)間(h)12311（30）1（4000）1（1）0.66826.458212（5000）2（1.5）0.76630.647313（6000）3（2）0.87335.17642（40）230.82433.53952310.88435.66562120.72228.77673（50）320.97539.53483130.79631.90193210.81032.539K192.28099.53194.662K297.98098.21498.958K303.97496.492100.617k130.76033.17731.554k232.66032.73832.986k334.65832.16433.539R（極差）3.8981.0131.985因素主→次ACB最優(yōu)組合條件A3C3B1由正交試驗(yàn)可以看出，當(dāng)提取溫度為50℃、加酶量為4000U/g、提取時(shí)間為2h時(shí)，魚(yú)骨蛋白的酶解效果最佳。4.5.3酶解后的魚(yú)骨蛋白SDS電泳圖譜123456圖4-15酶解后的魚(yú)骨蛋白SDS電泳圖Figure4-15FishproteinSDSelectrophoresisafterenzymatichydrolysis1-魚(yú)骨