唾液富組蛋白抗白念珠菌作用的研究

唾液富組蛋白抗白念珠菌作用的研究

【關(guān)鍵詞】唾液；富組蛋白；白念珠菌

1概況

富組蛋白(histidinerichprotein,HRPs或histatins)是一族存在于靈長類動(dòng)物腮腺和頜下腺分泌物中富含組氨酸的小分子、陽離子多肽［1～3］?，F(xiàn)有研究表明：HRPs具有多種生物學(xué)功能，HRPs可能作為一組內(nèi)源性多肽，在宿主非免疫防御系統(tǒng)中起重要作用，與多種口腔感染性疾病密切相關(guān)。近年來隨著抗生素、免疫抑制劑的大量應(yīng)用以及艾滋病的出現(xiàn)口腔念珠菌病的發(fā)病率急劇上升，并出現(xiàn)大量的耐藥菌株，現(xiàn)有的抗真菌藥物的副作用較大，急需找出一種具有較強(qiáng)的抗菌作用又對(duì)人體沒有損害的物質(zhì)。因此唾液富組蛋白的抗白念珠菌作用逐漸被重視。

2唾液富組蛋白的發(fā)現(xiàn)、純化

本世紀(jì)70年代采用四步色譜、酸尿淀粉膠及離子交換色譜技術(shù)檢測(cè)出5種富組蛋白。80年代應(yīng)用陽離子電泳技術(shù)可分離出7種富組蛋白，迄今為止，已從腮腺和頜下腺中分離出至少12種富組蛋白，分別命名為HRPs1～12［1,2,4～6］。富組蛋白在人類唾液中的含量因不同人群、不同測(cè)定方法、不同的唾液流速而報(bào)告各異。

3唾液富組蛋白的生物學(xué)作用

參與牙齒獲得性膜的形成：磷酸化的富組蛋白表現(xiàn)出對(duì)羥磷灰石表面有較大的吸附活性，其主要功能是獲得性膜中的前體蛋白，是羥磷灰石晶體增長的抑制劑。該蛋白層位于釉質(zhì)和牙菌斑之間，可防止菌斑細(xì)菌的代謝產(chǎn)物向釉質(zhì)內(nèi)擴(kuò)散，也防止了釉質(zhì)內(nèi)鈣和磷酸鹽向牙菌斑內(nèi)擴(kuò)散，還可降低酸對(duì)釉質(zhì)的腐蝕速度，對(duì)于抗齲有著重要意義［9］。

調(diào)節(jié)牙菌斑的PH值：HRPs分子中的咪唑環(huán)本身即有生理性的緩沖PH的作用。每分子的HRPs含有7個(gè)His、3～4個(gè)Arg和Lys，而Arg和Lys很容易被轉(zhuǎn)化生成堿基，從而中和了致齲菌產(chǎn)生的酸，起到抗齲作用。

抑制變形鏈球菌：Mackay［7］等發(fā)現(xiàn)部分純化的HRPs在體外能抑制主要的致齲菌—變形鏈球菌的生長和生活力，且靜止期的菌細(xì)胞比生長期的菌細(xì)胞對(duì)HRPs更為敏感。

抑制牙周病相關(guān)菌的凝集及其酶的作用：Murakami［8］等觀察到合成的HRPs5對(duì)牙齦擬桿菌和紅細(xì)胞的凝集有很強(qiáng)的抑制作用。含有L-His,Arg和Lys殘基的堿性肽在細(xì)胞的凝集過程中，可能通過靜電作用，結(jié)合到表面的粘附素上。因此，HRPs很可能對(duì)在口腔的群集有抑制作用。Nishikata［10］等研究發(fā)現(xiàn)HRPs5能強(qiáng)烈地抑制由產(chǎn)生的胰蛋白酶樣蛋白酶的活性，其IC50=50nm；還能抑制梭菌蛋白酶的活性，其IC50=800nm；對(duì)膠原酶亦有一定的抑制作用。

抑制白念珠菌的作用：Pollock［3］等首次報(bào)道了HRPs混合物的抗白念珠菌的作用。Raj［11］等對(duì)HRPs5進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HRPs5C端至少具有14個(gè)殘基和a-螺旋體構(gòu)象是重要的殺菌功能性片段和模式，最主要的功能性殘基是15，18，19和21位的His；第11和13位的Lys以及第12位的Arg。

抗病毒作用：最近有學(xué)者報(bào)道，全唾液能抑制HIV-1的感染性。唾液并不具有較寬的抗病毒譜，所以這種作用對(duì)HIV-1是特異性的。但具體是哪一種或哪幾種蛋白在起作用目前尚不清楚，但是HRPs的作用不能排除［17］。

中和細(xì)菌內(nèi)毒素的作用：Sugiyama［12］等發(fā)現(xiàn)HRPs可以抑制細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖介導(dǎo)的鱟試劑的凝膠作用。各主要的HRPs中和LPS的能力為HRPs5HRPs3HRPs1，而它們分別含56%、47%、36%的堿性氨基酸殘基。推測(cè)帶正電的氨基酸殘基在這種作用中起關(guān)鍵作用。國內(nèi)的報(bào)道也證實(shí)了這一點(diǎn)。

誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺：Sugiyama［13］等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HRPs3和5具有相同的誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺的活性，而HRPs1卻只有很小的作用。因此，HRPs5的結(jié)構(gòu)似乎在組胺釋放中起重要作用，但其機(jī)制尚不清楚。

4唾液富組蛋白的結(jié)構(gòu)及其抗白念珠菌作用機(jī)制

眾所周知，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)決定其生物學(xué)功能。Raj［11］等學(xué)者認(rèn)為HRPs抗白念珠菌的特性與其氨基酸序列有關(guān)。他們將：HRPs5Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Gly-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr）及其殘基片段1-16、9-24、11-24、13-24、15-24和7-16分別與不同濃度的白念珠菌作用，檢測(cè)其抗白念珠菌活性的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：天然的與人工合成的HRPs5，C16和C14有較強(qiáng)的抑制白念珠菌生長的能力，而且HRPs5與C16的抗白念珠菌的活性基本一致，而同樣含有16個(gè)氨基酸的N16抗白念珠菌的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于C16。這一結(jié)果提示HRPs5的抗白念珠菌的功能區(qū)位于羧基端。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)這些片段發(fā)揮生物學(xué)功能的最小長度為12個(gè)氨基酸殘基，雖然在HRPs3-10中都具有Lys-Phe-His-Gly-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr相同的12個(gè)殘基，但是C12的抗白念珠菌活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HRPs5，一旦將C12延長為C16，則其與HRPs5具有相同的抗白念珠菌活性。Dalbey［14］等認(rèn)為正電荷殘基在膜蛋白質(zhì)局部起重要作用。膜蛋白質(zhì)的正電荷殘基可以與膜的磷脂頭通過靜電力結(jié)合。這樣一來HRPs5的C16殘基既可以通過氫鍵與膜結(jié)合，又可以通過氨基端和羧基端的正電荷與磷脂頭靜電力結(jié)合，這種膜結(jié)合蛋白就可以發(fā)揮起生物學(xué)作用。

5影響唾液富組蛋白抗白念珠菌作用因素

①富組蛋白濃度對(duì)抗白念珠菌活性的影響。②PH對(duì)HRPs抗白念珠菌活性的影響。③白念珠菌的生長環(huán)境中營養(yǎng)狀況的影響。④環(huán)境中的離子濃度的影響。⑤唾液的蛋白分解作用。

6腺病毒介導(dǎo)富組基因治療白念珠菌感染

O’connell［15］將富組多肽基因3在復(fù)制缺陷腺病毒介導(dǎo)下成功在體內(nèi)外涎腺上表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中將人類富組多肽基因3轉(zhuǎn)移到人類腎上皮細(xì)胞、大鼠頜下腺上皮細(xì)胞及人類頜下腺細(xì)胞，均有明顯的富組多肽蛋白分泌至培養(yǎng)基中，用轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)基進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)表明：120min內(nèi)，可將90%的白念珠菌殺滅，且對(duì)AIDS患者感染的耐氟康唑的白念珠菌仍有顯著的殺滅作用。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用腺病毒介導(dǎo)富組多肽基因經(jīng)導(dǎo)管感染頜下腺后，腺體唾液中的富組多肽平均高達(dá)302μg/ml，而未感染的大鼠頜下腺唾液中測(cè)不到人的富組多肽。表明經(jīng)頜下腺富組蛋白基因轉(zhuǎn)移，腺體表達(dá)后，其合成蛋白多分泌至唾液。從而可用來治療相關(guān)的口腔疾病。進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已在白念珠菌感染的動(dòng)物模型進(jìn)行，人類臨床應(yīng)用也在擬定中。

7唾液富組蛋白抗白念珠菌作用的臨床應(yīng)用前景

Santarpia［16］等人用經(jīng)過消毒的人唾液HRPs3、HRPs5溶液治療6例義齒性口炎患者1周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRPs減少了上頜義齒組織面的白念珠菌數(shù)量。近年來隨著抗生素、免疫抑制劑的大量應(yīng)用以及艾滋病的出現(xiàn)口腔念珠菌病的發(fā)病率急劇上升，并出現(xiàn)大量的耐藥菌株。人們迫切需要找到一種有效、毒副作用低且廉價(jià)的藥物應(yīng)用于臨床治療，基因技術(shù)的飛速發(fā)展是這一愿望有可能得以實(shí)現(xiàn)。因此HRPs的抗白念珠菌作用的臨床應(yīng)用前景十分廣闊。

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