枯草芽孢桿菌黑色變種超氧化物歧化酶活性測(cè)定的影響因素

枯草芽孢桿菌黑色變種超氧化物歧化酶活性測(cè)定的影響因素

超氧化物酪氨酸酶（sod）是一種具有特定生物內(nèi)標(biāo)記異體基的氧化酶。這是唯一以o2為基礎(chǔ)的酶。2'反應(yīng)可滲透2'o8-，生成b2和b2o。隨著超氧化物歧化酶研究的不斷深入和輻射防護(hù)生物學(xué)的不斷發(fā)展,對(duì)超氧化物歧化酶的研究也越來(lái)越多。SOD屬酸性蛋白酶,對(duì)pH值、熱和蛋白酶水解等比一般酶穩(wěn)定,但是其活性和催化效率與其含量和所處環(huán)境的理化因素有關(guān)。近幾年來(lái)對(duì)SOD穩(wěn)定性的研究有了很大的進(jìn)展,出現(xiàn)了對(duì)SOD的分子改造和化學(xué)修飾。對(duì)SOD的分子改造與修飾,改變了分子的物理化學(xué)性質(zhì),增加了SOD對(duì)高溫和極端pH值等的穩(wěn)定性。但是在研究外界脅迫對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性SOD活性的影響時(shí),往往存在環(huán)境因素對(duì)其活性的影響,降低了研究結(jié)果的可信度。因此,本課題從酶液以及菌液的制備、保存溫度、保存方式、保存時(shí)間等方面分析了SOD活性測(cè)定中的影響因素,從而為研究SOD活性的測(cè)定提供參考。1材料和方法1.1菌株的保藏中心枯草芽孢桿菌黑色變種(Bacillussubtilisvar.niger,ATCC9372),購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。1.2細(xì)胞破碎條件對(duì)sod活性的測(cè)定營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基:蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化鈉5g,水1000mL培養(yǎng)菌體,37℃,160rpm振蕩培養(yǎng)菌體16h,作為種子液。按10%比例將種子液重新接入培養(yǎng)基,37℃,160rpm振蕩培養(yǎng)12h,得到菌液。酶標(biāo)儀(ThermoFisherScientificInc1500~417)測(cè)定其在600nm處的吸光度,記錄OD600。將菌液平均分成2份(記為A、B),A樣品考察細(xì)胞破碎條件對(duì)SOD活性測(cè)定的影響;B樣品考察不同保存條件(樣品保存形式、保存時(shí)間、保存溫度)對(duì)SOD活性的影響。1.3超聲時(shí)間對(duì)sod活性的影響將上述A樣品4℃,5000rpm×10min離心收集菌體,等體積溶菌酶液(4mg/mL)復(fù)溶分裝,37℃恒溫分別放置30min和40min,分別用不同超聲時(shí)間處理(10min、15min、20min、25min、30min),顯微鏡檢觀察破碎情況,并測(cè)定SOD活性,選擇出對(duì)酶活性影響最小的細(xì)胞破碎條件。1.4樣品保存1.4.1酶液制備方法將上述B樣品分成2個(gè)部分(B1和B2),B1分裝于EP管后直接保存于4℃、-20℃、-70℃冰箱,分別在不同時(shí)間取出測(cè)定SOD活性。此樣品定義為菌液樣品。將B2樣品5000rpm×10min,4℃冷凍離心,收集菌體。用0.03mol/LpH7.2PBS(無(wú)水磷酸氫二鈉2.83g,磷酸二氫鉀1.36g,蒸餾水1000mL洗滌1次,37℃溶菌酶處理后超聲破碎。超聲破碎后的樣品1000rpm×10min,4℃冷凍離心,收集上清液酶液。酶液分裝于EP管后分別保存于不同溫度(保存條件同B1),不同時(shí)間取出測(cè)定SOD活性。此樣品定義為酶液樣品。1.4.2不同的h和多次保存時(shí)間對(duì)其酶活的影響不同溫度下保存的菌液樣品和酶液樣品分別考察短時(shí)間保存(0h、4h、8h、12h、16h及24h)和長(zhǎng)時(shí)間保存(1d、3d、5d、10d、15d、20d及50d)對(duì)其酶活的影響。分別在預(yù)定的時(shí)間取出B1、B2,測(cè)定SOD活性,分析不同保存條件對(duì)酶活測(cè)定的影響。1.5黃系a型抗氧化酶活性測(cè)定SOD活性測(cè)定選用用超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒,該試劑盒采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性,酶標(biāo)儀測(cè)定550nm處的吸光值。酶活性定義為每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)。2結(jié)果與分析2.1不同超聲時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌sod活性的影響采用顯微鏡鏡檢的方法對(duì)比研究了溶菌酶處理30min和40min,超聲波分別處理10min、15min、20min、25min、30min時(shí),細(xì)胞破碎的情況。鏡檢發(fā)現(xiàn),當(dāng)溶菌酶處理30min,細(xì)胞破碎程度隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)而加大,超聲處理10min時(shí)約70%破碎,處理20min時(shí)約80%,處理30min時(shí)細(xì)胞基本破碎;當(dāng)溶菌酶處理40min,隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng),細(xì)胞碎片增多,而且細(xì)胞碎片較30min處理時(shí)紛雜,超聲25min、30min時(shí)碎片粘連。用溶菌酶37℃溫育30min或40min,再超聲處理不同時(shí)間(10min、15min、20min、25min、30min)后的SOD活性顯示,溶菌酶處理30min時(shí),隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng),SOD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)變化,超聲時(shí)間為25min時(shí),酶活達(dá)到峰值,隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)增大,酶活降低(見圖1);溶菌酶處理40min時(shí),SOD活性隨著超聲時(shí)間呈不規(guī)律變化。超聲時(shí)間較短時(shí),SOD活性較處理30min時(shí)高,但此時(shí)鏡檢結(jié)果表明細(xì)胞未完全破碎;超聲時(shí)間增長(zhǎng)時(shí),SOD酶活反而低,即處理40min時(shí),超聲處理對(duì)SOD活性產(chǎn)生了負(fù)影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用溶菌酶處理枯草芽孢桿菌黑色變種,作用40min下的細(xì)胞破碎程度較30min高,但對(duì)SOD活性的影響較大;溶菌酶處理30min,細(xì)胞破碎相對(duì)完全,對(duì)SOD活性影響小;綜上所述,選用溶菌酶30min并以超聲25min處理對(duì)SOD活性影響最小,本研究后續(xù)所有酶樣品制備均選擇該參數(shù)。2.2不同保存方式對(duì)樣品sod活性的影響圖2顯示的是酶液樣品在24h內(nèi)SOD活性變化的曲線。從圖中可以看出,在24h內(nèi),SOD活性隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而不斷下降。保存溫度對(duì)SOD的活性也有明顯影響。在4h內(nèi),以4℃保存酶液最佳,其SOD酶活性基本無(wú)變化。在8h后,-70℃保存下的酶液酶活性最大,在24h時(shí)其活性保留了88.87%。圖3顯示的是以菌液形式保存的樣品在24h內(nèi)SOD活性隨時(shí)間變化的曲線。從圖中可以看出,在8h內(nèi),不同溫度保存下的菌體SOD活性都有一定程度的增加,在8h時(shí)-70℃保存的酶活最高,酶活值上了6.94%。隨著時(shí)間的繼續(xù)增大,SOD活性開始下降,在24h后降到原酶活性的77.19%。由圖可知菌液樣品的SOD活性在短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。這可能是由于菌液樣品在低溫環(huán)境下首先自我調(diào)節(jié)適應(yīng)環(huán)境,相較之下4℃誘導(dǎo)菌液分泌更多的SOD來(lái)抵御逆境。由圖2和圖3,可以得出這樣的結(jié)論:短時(shí)間內(nèi)保存時(shí)間、保存溫度和保存樣品形式對(duì)SOD活性有顯著的影響。在4h內(nèi),以菌液形式保存于4℃下的樣品SOD酶活性最高;4~16h里,以菌液形式保存于-70℃下的樣品SOD酶活性最高;16~24h中,以酶液形式保存于-70℃下的樣品SOD酶活性最高。根據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)分析表明,菌液及酶液2種保存方式在短時(shí)間內(nèi)的結(jié)果差異極顯著,p<0.01;3種保存溫度間差異也都極顯著,p<0.01。2.3不同保存溫度對(duì)sod活性的影響圖4和圖5分別是酶液形式和菌液樣品在長(zhǎng)時(shí)間保存下SOD活性隨時(shí)間變化的曲線。從圖中可以看出,2種形式的樣品SOD活性均隨保存時(shí)間的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。尤其在20d以后,酶活下降程度很大。不同保存溫度下的SOD活性也不同,保存溫度越低SOD活性越高。酶液樣品-70℃下保存,3d內(nèi)SOD酶活性下降相對(duì)較小,3d時(shí)能保留85.62%的酶活性;菌液樣品的SOD活性下降相對(duì)高。由上述2個(gè)圖可以得出結(jié)論:酶液樣品保存于-70℃時(shí)SOD酶活性最高,即外部因素對(duì)其影響最小。菌液和酶液樣品長(zhǎng)時(shí)間保存,SOD活性均不斷下降,在相同保存溫度下,酶液樣品的SOD活性比菌液樣品高,但2種樣品的SOD活性在保存20d后均急速下降,保存得溫度越低SOD活性相對(duì)越高。究其原因可能是:酶液樣的SOD活性只受到時(shí)間和溫度的影響,而菌液樣品受到環(huán)境影響刺激后,細(xì)胞會(huì)調(diào)節(jié)自身做出不同的響應(yīng),導(dǎo)致SOD活性變化與酶液樣品不一致。綜上所述,保存時(shí)間和保存溫度均對(duì)SOD活性有影響,制成酶液后保存于較低溫度下,對(duì)其影響相對(duì)較小。通過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)分析表明,2種形式長(zhǎng)期保存下,檢測(cè)時(shí)間之間差異都極顯著,p<0.01;3種保存溫度間差異也都極顯著,p<0.01。3不同保存方式對(duì)sod活性的影響細(xì)菌的細(xì)胞壁幾乎都是由肽聚糖(peptidoglycan)組成,細(xì)菌細(xì)胞破碎的主要阻力來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎的方法,以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細(xì)胞壁破碎。超聲破碎和酶溶法是目前實(shí)驗(yàn)室最常見的細(xì)胞破碎方法。傳統(tǒng)的超聲破碎法是采用超聲波振蕩器發(fā)射的15~25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。此法每次只能處理一個(gè)樣品,在少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便,液量損失少,當(dāng)樣品量相對(duì)較多時(shí)比較費(fèi)時(shí);另外超聲波直接與細(xì)胞接觸,產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)可能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活,且樣品散熱有困難,處理后的樣品常有黑色沉淀。超聲波能改變蛋白質(zhì)的進(jìn)空間結(jié)構(gòu),隨著超聲次數(shù)的增大引起蛋白質(zhì)活性的降低。由于本研究要考察酶活,因此本研究采用溶菌酶處理和超聲破碎相結(jié)合的方法,使細(xì)胞破碎程度相對(duì)較高,且將外界對(duì)SOD活性影響降到最低。本研究超聲清洗機(jī)代替超聲細(xì)胞破碎儀,不但避免了超聲波與細(xì)胞的直接接觸,降低超聲波對(duì)酶活的影響,還可以成批處理樣品,操作更簡(jiǎn)便。劉紅等曾采用酶解—超聲法破碎大腸桿菌提純包含體,優(yōu)化提純包含體的條件,結(jié)果證實(shí)此方法可獲得純度更高的包含體。李蘭等對(duì)比研究了4種破壁方式對(duì)細(xì)菌產(chǎn)SOD活性的影響,發(fā)現(xiàn)助溶劑破壁處理下得到的SOD活性最高。SOD是一種活性蛋白質(zhì)。因此,一切對(duì)蛋白質(zhì)活性有影響的因素都會(huì)影響酶的活性。周佳敏等指出,SOD與溶液微環(huán)境變化呈相關(guān)性。酶與底物作用的活性,受溫度、pH值、酶液濃度、底物濃度、酶的激活劑或抑制劑等許多因素的影響;另外,酶樣品的保存也會(huì)對(duì)酶活測(cè)定造成影響。本研究考察了保存形式(酶液、菌液)、保存時(shí)間和保存溫度對(duì)SOD活性的