小麥反義mlo基因在小麥愈傷組織中的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定

小麥反義mlo基因在小麥愈傷組織中的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定

明末清初是由粉菌（bgt）引起的一種高度專業(yè)化的真菌疾病。白粉菌生理小種多,變異速度快,抗病品種往往因為生理小種變異而感病,這就大大地縮短了品種的使用年限。利用基因工程方法選育廣譜抗白粉病品種將是比較經(jīng)濟和有效的方法之一。野生型Mlo基因是大麥(Hordeumvulgare)抗白粉病的負調(diào)控因子,隱性突變的mlo基因介導了大麥對白粉菌(B.graminisf.sp.hordei,Bgh)的廣譜抗性。Shirasu等和Kim等將完整的Mlo基因轉(zhuǎn)到mlo突變的大麥中,瞬間表達后,mlo突變的大麥對白粉病菌的感病性得以恢復(fù)。Schweizer等利用基因槍將Mlo-dsRNA直接導入Mlo背景的大麥品種葉片,導入Mlo-dsRNA基因的葉表皮單細胞高抗白粉病菌侵入。隨后Buschges等和Devoto等也證明大麥Mlo基因是一種植物防衛(wèi)機制的負向調(diào)控因子。研究表明,大麥mlo基因不會引起被侵染細胞的過敏性壞死反應(yīng),而是利用乳突抗性(又稱為細胞壁加厚)機制來抵抗病原菌的侵入,mlo基因促使乳突高頻、快速形成和保持時間長是大麥抗白粉菌侵入的關(guān)鍵。因此Mlo抗性代表了一類由寄主基因突變控制的植物廣譜抗病新機制。全面深入地研究Mlo基因及其介導的抗病性對揭示植物廣譜抗病機制、創(chuàng)造優(yōu)良的抗白粉病新抗源具有重要意義。小麥是大麥的近緣種,而且二者的Mlo基因具有高度的同源性,推測它們可能具有相似的作用機制。Wang和Waterhouse提出可以通過RNA干擾技術(shù)(RNAinterference,RNAi)或者反義技術(shù)(antisense)關(guān)閉或者減弱植物自身Mlo基因的表達以賦予植物抗病性。趙同金等將大麥Mlo反義基因通過農(nóng)桿菌介導的苗端轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入小麥中,獲得了抗白粉病的轉(zhuǎn)基因植株,但并未驗證小麥內(nèi)源Mlo基因沉默的效率以及探究抗性產(chǎn)生的分子細胞學機制。本實驗室于玲等克隆了一個小麥Mlo基因(Ta-Mlo),其cDNA全長序列為1602bp(GenBank登錄號為AF384144),其氨基酸序列與大麥Mlo基因(GenBank登錄號為gi7489389)編碼蛋白的相似性為89%。為進一步了解該小麥Mlo基因的功能及其與小麥白粉病抗性的關(guān)系,本實驗構(gòu)建了包含該Ta-Mlo反義基因的植物表達載體,利用基因槍法將其導入高感白粉病的小麥品種中,期望通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)途徑造成小麥內(nèi)源Mlo基因表達缺失,驗證轉(zhuǎn)基因植株基因沉默的效率并鑒定其白粉病抗性,從而進一步探討該小麥Mlo基因的作用機制。1材料和方法1.1小麥種子的誘導采用綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的感白粉病小麥品種揚麥158和濟麥20作為轉(zhuǎn)化受體。選取開花后12~16d的小麥未成熟種子用于幼胚愈傷組織的誘導。依照蔣正寧等的方法消毒種子及誘導培養(yǎng)愈傷組織。1.2表達載體的構(gòu)建將Ta-Mlo編碼序列從pGEM-T-easy載體上用NotI切下,并連接到中間載體pBluescript的相同酶切位點處,將重組克隆用pBluescript載體上M13左引物(M13F)和目標基因左引物(MloF)進行PCR擴增,篩選出目標基因反向插入的克隆pBS-Mlo(–),再以SmaI和SacI從pBS-Mlo(–)切下目標基因,在相同酶切位點處替換表達載體pAHC25載體上的GUS基因編碼序列,由此將目標基因克隆到強啟動子ubi的下游,獲得表達載體pAHC-Mlo(–)(圖1)。1.3雜草抗性芽苗的恢復(fù)培養(yǎng)以預(yù)培養(yǎng)7~10d的幼胚愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體,在轟擊前6h至轟擊后16h進行高滲處理。基因槍轟擊方法和轟擊參數(shù)參照王華忠等的方法。轟擊后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到無選擇壓的SD2培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)2周,并使選擇標記基因充分表達。恢復(fù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移到添加3mgL-1除草劑Bialaphos的篩選培養(yǎng)基進行除草劑抗性芽苗的分化,每3周繼代一次,于26℃、光照10hd-1和光照強度為40μmolm-2s-1條件下培養(yǎng),經(jīng)兩輪篩選及分化,當除草劑抗性綠芽長至3~5cm時,轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基中。待苗長到6~8cm高時,開管煉苗2~3d,用清水洗凈苗根系上的培養(yǎng)基后移栽至瓦盆,在溫室生長成株。1.4對轉(zhuǎn)植的分子檢測1.4.1dnapcr擴增依據(jù)BAR基因和目標基因序列設(shè)計3對擴增引物,分別是BARF:5′-CGAGACAAGCACGGTCAACTTC-3′,BARR:5′-AAACCCACGTCATGCCAGTTC-3′,退火溫度63℃,擴增片段長度402bp;MloF:5′-ATGGCAAAGGACGACGGGTA-3′,MloR:5′-AAGCGGAACCGCGCAGGATC-3′,退火溫度60℃,擴增片段長度為548bp;UbiF:5′-CCACATCATCACAACCAAGC-3′,UbiR:5′-ACCCAGATCTCCCCCAAATC-3′,退火溫度55℃,擴增片段長度616bp。小量提取T0和T1代轉(zhuǎn)化植株及受體對照的基因組DNA,分別使用上述引物對進行PCR篩選和鑒定。PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性,3min;94℃變性,30s,退火45s,72℃延伸1min,35個循環(huán);72℃再延伸10min;10℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后,用凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析。1.4.2實時熒光定量pcr檢測PCR-Southern雜交取上述目標基因PCR擴增產(chǎn)物,純化后經(jīng)0.7%瓊脂糖膠電泳,采用堿法轉(zhuǎn)移到AmershamHybondN+膜上。斑點雜交采用轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA(以受體品種作對照)經(jīng)超聲波破碎及堿變性后,直接點到AmershamHybondN+膜上。探針均采用地高辛標記的用特異引物擴增獲得的目標基因片段(548bp)。探針標記和Southernblot均采用DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII試劑盒(Roche),按使用說明書操作。1.4.3實時熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qPCR)檢測提取T0代經(jīng)分子檢測為陽性的18個單株的總RNA,其中表現(xiàn)高抗(病級為0;和1)的6株,以揚麥158和濟麥20為受體各3株;表現(xiàn)中抗及中感(病級為2~3)的8株,包括以揚麥158為受體的5個單株和以濟麥20為受體的3個單株;表現(xiàn)高感(病級為4)的4株,兩基因型受體各2株。以未轉(zhuǎn)基因受體為對照。利用PrimeScriptRTreagentKit(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用PremixExTaq(ProbeqPCR)Kit(TaKaRa)進行PCR擴增。1.5保護患者兩組小鼠血清中bata的抗性差異T1代小麥植株長至4~5葉時,在新葉近端部涂抹濃度為120mgL-1的BASTA水溶液(中國農(nóng)業(yè)科學院徐惠君研究員惠贈),10d后觀察抗性差異并拍照記錄。1.6苗期接種張量成像將T0代和T1代轉(zhuǎn)化植株種植于南京農(nóng)業(yè)大學江浦試驗站塑膜大棚中,苗期人工接種白粉病混合菌種,接種7d后調(diào)查并記錄發(fā)病情況,按盛寶欽提出的苗期反應(yīng)型(0~4級)分級標準進行抗病性鑒定,0、0;和1級為高抗,2級為中抗,3級為中感,4級為高感。1.7水合氯醛法白粉菌接種后12、18、24、30、36和48h,分別對轉(zhuǎn)基因植株和受體對照植株的葉片取樣,將葉片樣品在含0.15%三氯乙酸的乙醇脫色液中于37℃恒溫箱脫色48h,中間更換2~3次脫色液,直至葉段完全透明,保存于水合氯醛溶液中,顯微鏡觀察前用考馬斯亮藍染色液(0.15%三氯乙酸水溶液:0.6%考馬斯亮藍R-250甲醇溶液=1∶1,V/V)染色10min,再用蒸餾水漂洗,滴加甘油∶水(1∶1,V/V)溶液鏡檢。使用Leica光學顯微鏡觀察染色后的葉片,統(tǒng)計分析100~150個白粉菌侵入位點的乳突和吸器的形成情況,用SAS9.1.3進行Duncan氏新復(fù)極差檢驗法分析觀測數(shù)據(jù)。2結(jié)果與分析2.1再生小麥基因組外源基因嵌入及pcr擴增檢測采用基因槍法將Ta-Mlo反義基因?qū)敫吒邪追鄄〉膿P麥158和濟麥20幼胚愈傷組織,轟擊幼胚愈傷組織各約2000塊,經(jīng)篩選、分化和生根壯苗培養(yǎng)(圖2-A~C),獲得以揚麥158為受體的具除草劑抗性的再生植株154株,再生頻率為7.2%;以濟麥20為受體的具除草劑抗性的再生植株102株,再生頻率為5.1%。為了檢測再生小麥基因組中是否有外源基因的插入,首先用BAR基因引物對T0代轉(zhuǎn)化植株的gDNA進行PCR擴增檢測,在256個T0代植株中,有69個單株(以揚麥158為受體36株,以濟麥20為受體的33株)擴增出預(yù)期的402bp片段,而受體對照植株未出現(xiàn)該片段(圖3-A)。為避免小麥內(nèi)源Mlo基因的干擾,以ubi啟動子左引物UbiF和目的基因Ta-Mlo左引物MloF搭配進行PCR擴增檢測,在上述69個單株中有63個單株(以揚麥158為受體33株,以濟麥20為受體的30株)同時也能擴增出與質(zhì)粒對照相同大小的DNA片段(2218bp),而受體對照無擴增帶(圖3-B)。3次重復(fù)結(jié)果一致,初步確定這63株T0代轉(zhuǎn)化植株為PCR陽性轉(zhuǎn)化植株,因此以揚麥158為受體的轉(zhuǎn)基因頻率為1.7%,以濟麥20為受體轉(zhuǎn)的基因頻率為1.5%。2.2對轉(zhuǎn)植的分子檢測2.2.1r-硫化學和基因組dna的雜交為進一步明確轉(zhuǎn)基因植株的真實性,對T0代PCR陽性植株進行PCR-Southern雜交和基因組DNA點雜交驗證。結(jié)果顯示PCR陽性植株都可檢測到與質(zhì)粒對照相同大小的雜交帶(圖4-A)或雜交點(圖4-B),仍表現(xiàn)為陽性,而陰性對照沒有出現(xiàn)任何雜交信號。2.2.2不同基因植株的ta-mlo基因表達差異對18個分子檢測為陽性且不同病級的T0代轉(zhuǎn)基因植株和2個受體對照植株內(nèi)源Mlo的qPCR分析結(jié)果表明,與受體對照相比,絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株的Ta-Mlo基因表達量顯著降低(圖5),說明反義基因的導入能有效地沉默其內(nèi)源Mlo基因,但不同轉(zhuǎn)基因植株降低的程度并不一致。高感植株的Ta-Mlo基因的表達量都比較高并接近感病受體品種,但表現(xiàn)中抗和中感的轉(zhuǎn)基因植株的抗性水平和Ta-Mlo基因的表達量并不完全對應(yīng),說明轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出的抗病性可能還受體內(nèi)復(fù)雜的分子機制調(diào)控。2.3對基因突變植株抗感病的鑒定PCR檢測呈陽性的T1代轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)BASTA水溶液處理10d后,葉片上涂抹BASTA的部位雖有些脫水但仍然透綠,而對照葉片上涂抹BASTA的部位明顯變黃枯死(圖6)。這與分子檢測的結(jié)果相一致,說明BAR基因也導入到受體小麥中并且可遺傳到T1代。接種白粉菌7d后,非轉(zhuǎn)基因?qū)φ粘浞职l(fā)病,病級為4級,表現(xiàn)為高感;以揚麥158為受體的33株T0代轉(zhuǎn)基因植株中有1株表現(xiàn)近免疫(0;級),2株表現(xiàn)高抗(1級),17株表現(xiàn)中抗到中感(2級和3級);以濟麥20為受體的的30株T0代轉(zhuǎn)基因植株中有3株表現(xiàn)高抗,3株表現(xiàn)中感(表1)。由此可見,反義Ta-Mlo基因的導入在某些情況下能夠使轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性提高。將經(jīng)過白粉病抗性鑒定且T0代分子檢測為陽性的18個轉(zhuǎn)基因單株的種子播種獲得T1代植株,苗期剪葉片提取DNA進行目標基因的PCR鑒定后,陽性植株和受體對照同時接種小麥白粉病混合菌進行抗性分級鑒定。結(jié)果表明,T1代不同株系中對白粉病的抗性發(fā)生了分離,T0代為抗病單株的后代多數(shù)仍表現(xiàn)抗病,T0代為感病單株的后代則仍表現(xiàn)感病(表2)。說明由反義基因?qū)朐斐傻腗lo基因沉默能夠有效地遺傳給下一代。2.5感病材料的e在接種白粉菌12h后,不同受體背景的抗病轉(zhuǎn)基因材料(簡稱抗病材料)和感病受體材料(簡稱感病材料)葉片的表皮細胞內(nèi),白粉菌侵入點下方均可觀察到明顯的乳突反應(yīng)(圖7-a,b),抗、感材料的乳突在產(chǎn)生初期差異不明顯,說明小麥在白粉菌侵入早期均有一定程度的乳突反應(yīng)。隨著侵染時間的延長,抗、感材料中形成乳突的孢子百分率都逐漸增加,于接種后24h達到峰值,但感病受體材料不如抗病轉(zhuǎn)基因材料增加顯著,說明抗病轉(zhuǎn)基因材料乳突的形成速度較快。此后感病材料中觀察到乳突形成的孢子所占百分率逐漸降低,抗病材料中也逐漸降低,但降低的趨勢較緩慢,在接種后30、36和48h時抗、感之間呈現(xiàn)出顯著差異(圖8-A),說明抗病材料中乳突維持的時間較長,抑制或延緩了白粉菌的進一步發(fā)育。經(jīng)考馬斯亮藍染色,不同受體背景的抗、感材料在接種白粉菌12h后,有孢子侵入的葉片表皮細胞內(nèi)可以觀察到少量的吸器形成,隨著接種時間推移,感病材料中吸器數(shù)目迅速增加,抗病材料的吸器數(shù)目也逐漸增加,但增加的速度相對較緩慢。接種后24h,以揚麥158和濟麥20為受體的抗病轉(zhuǎn)基因材料的吸器形成百分率分別達峰值22%和19%,隨后逐漸下降,在接種后48h降至7%~8%,而2個感病受體對照的吸器形成百分率在接種24h后維持在50%~65%左右(圖8-B)。同時,可以觀察到吸器形態(tài)在抗、感材料間也有顯著的差異,感病材料在接種后24h開始出現(xiàn)大量正常的指狀吸器(圖7-c),而抗病轉(zhuǎn)基因材料的白粉菌侵入的細胞內(nèi)觀察到吸器數(shù)目較少,且吸器的形態(tài)偏小或畸形(圖7-d)。說明由于轉(zhuǎn)基因材料的抗性作用使吸器的發(fā)育受阻,白粉菌孢子無法吸收寄主營養(yǎng)而進一步發(fā)育,從而轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)為抗病。3mlo基因?qū)π←溈剐缘挠绊懘篼淢lo基因的隱性突變(mlo)可以使大麥獲得對幾乎所有已知大麥白粉病菌生理小種的廣譜、高效和持久抗病性。Wolter等認為Mlo基因缺失或移碼突變成為mlo后,不能合成有正常功能的MLO蛋白,因此對細胞死亡的負調(diào)控作用被解除,同時可引起細胞壁加厚,有助于防止白粉病菌的侵染,由此引發(fā)廣譜抗病性。Uwe等研究表明MLO蛋白通過抑制抗真菌基因(avrMla)的防御反應(yīng),抑制由病原物相關(guān)分子表型(PAMP)引發(fā)的基礎(chǔ)抗性(PTI),導致感病性。進而Panstruga提出了大麥Mlo與白粉病菌的互作模型,白粉菌萌發(fā)的芽管附著在表皮細胞上后,PAMPs引發(fā)信號傳導,激發(fā)大麥獲得性免疫系統(tǒng),從而導致了一系列的生化免疫反應(yīng),促進白粉菌的生長。Mlo基因與白粉病菌互作的分子機制研究表明,mlo抗性的完全表達需要Ror1、Ror2基因的參與;一種小G-RACB蛋白與大麥mol抗性密切相關(guān),能夠調(diào)節(jié)MLO對白粉病菌的感病性;據(jù)報道,MLO蛋白還是一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白,對抗性基因的負調(diào)控作用會被病原菌侵入激活,可能參與植物抗病性反應(yīng)的細胞信號傳導。從鹽脅迫的小麥幼莖和根部分離出7個組織特異性表達的小麥MLO蛋白家族成員,并通過比對水稻等模式生物的同源序列進行了系統(tǒng)進化研究;劭伯飛克隆的TaMlo3基因(AF336105)在抗病品種中的表達豐度持續(xù)非常低,而在感病品種中表達豐度高,且表達量在白粉菌接種后6h達到最低后逐漸恢復(fù)正常,說明TaMlo3的表達量與抗性抑制程度有關(guān);徐紅明等和孫燕飛等的研究也顯示,Mlo基因在小麥與白粉菌親和互作中的表達高峰遠遠高于與非親和組合。Eva等采用大麥條花葉病毒(BSMV)介導的基因沉默(VIGS)的方法抑制感病小麥中TaMlo基因(GenBank登錄號為AF361933)的表達,接種白粉菌后發(fā)現(xiàn)Mlo基因沉默的植株的抗病性增加,微觀表現(xiàn)為次級菌絲和菌落的形成率較對照顯著降低,說明小麥內(nèi)源Mlo基因的沉默可提高感病小麥的白粉病抗性,但未在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化情況下驗證。趙同金等和吳瑩瑩分別對大麥Mlo基因和小麥Mlo基因的反義序列進行轉(zhuǎn)化小麥研究,獲得了抗白粉病小麥轉(zhuǎn)基因植株,但未對小麥內(nèi)源Mlo基因沉默的效率進行檢測,亦未對轉(zhuǎn)反義Mlo基因小麥的白粉病菌侵入進行細胞學觀察。本實驗室于玲等克隆了小麥Ta-Mlo基因