nrf2and通路在藥物治療中的作用

nrf2and通路在藥物治療中的作用

nf2是含有明亮氨基酸鏈基本結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移因素，屬于cap-n-collar（cnc）調(diào)節(jié)蛋白家族。Nrf2及其信號(hào)通路與腫瘤、炎癥、糖尿病、慢性腎功能衰竭、哮喘、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等多種疾病病理生理和發(fā)病過程密切相關(guān),已成為廣受關(guān)注的藥物靶點(diǎn)。Nrf2包括Neh1到Neh6共6部分結(jié)構(gòu)。Neh1為堿性亮氨酸拉鏈基本序列,是Nrf2和Maf形成異二聚體并與抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidantresponseelement,ARE)結(jié)合的區(qū)域。Nrf2與ARE結(jié)合的同時(shí),由具有轉(zhuǎn)錄活性的Neh4和Neh5與輔助蛋白結(jié)合后才能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。Neh2能與Keap1結(jié)合并被其負(fù)性調(diào)節(jié),正常情況下胞漿中的Nrf2大多與Keap1結(jié)合而被降解。氧化應(yīng)激、親電子試劑或磷酸化作用可導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離和釋放;同時(shí)還可能減弱Keap1介導(dǎo)的蛋白酶對(duì)Nrf2的降解作用。Nrf2與Keap1解離后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而和ARE結(jié)合,啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。由此可以看出,通過阻止Nrf2與Keap1的結(jié)合、減弱Keap1介導(dǎo)的蛋白酶對(duì)Nrf2的降解作用都可以激活Nrf2/ARE通路。除此之外還可以通過調(diào)節(jié)Nrf2的核-漿穿梭或者誘導(dǎo)Nrf2的表達(dá)來調(diào)節(jié)Nrf2?，F(xiàn)有的Nrf2調(diào)節(jié)劑主要通過對(duì)Keap1的半胱氨酸殘基進(jìn)行修飾來阻止Nrf2和Keap1的結(jié)合,調(diào)節(jié)Nrf2通路活性而達(dá)到治療疾病的目的。保護(hù)性基因包括Ⅱ相解毒酶基因、抗氧化蛋白類基因、泛素酶基因和蛋白酶體基因、以及多向性抗藥蛋白2(MRP2、ABCC2)基因等。研究表明Nrf2在抗腫瘤、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)保護(hù)等方面發(fā)揮著重要作用。簡要介紹Nrf2/ARE通路在疾病發(fā)展中的作用及相關(guān)藥物研發(fā)的新進(jìn)展。1nr2疾病的發(fā)展1.1nrf2是制病中的靶點(diǎn),且爭議前發(fā)生階段仍發(fā)研究表明Nrf2/ARE通路參與了腫瘤的形成與發(fā)展。Yu等發(fā)現(xiàn)Nrf2基因敲除小鼠更易發(fā)生化學(xué)誘導(dǎo)的DNA損傷,在苯并芘致胃癌和亞硝基化合物致尿路上皮癌模型中表現(xiàn)出癌癥高發(fā)性。大量證據(jù)表明Nrf2是推動(dòng)結(jié)腸直腸癌發(fā)生和進(jìn)展的重要因素,以Nrf2/ARE通路為靶點(diǎn)可能是治療結(jié)腸直腸癌的有效途徑。此外,Nrf2基因缺陷的小鼠比野生型小鼠更易生成腫瘤,Nrf2誘導(dǎo)劑抑制腫瘤生長的研究結(jié)果進(jìn)一步證明了Nrf2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。1.2nrf2對(duì)炎癥的保護(hù)作用炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)抗外界感染和組織損傷的一種生理保護(hù)機(jī)制,但是炎癥反應(yīng)紊亂又會(huì)造成眾多對(duì)機(jī)體有害的炎癥性疾病,如風(fēng)濕、多發(fā)性硬化、銀屑病、炎性腸病等。最近研究發(fā)現(xiàn)Nrf2能調(diào)節(jié)促炎癥反應(yīng)的刺激因素并能保護(hù)炎癥損傷的細(xì)胞和組織,在病理性炎癥反應(yīng)中起到保護(hù)作用。Nrf2敲除小鼠發(fā)生類似狼瘡的多器官免疫損傷、血管內(nèi)免疫復(fù)合物沉積、早期死于腎小球腎炎等多種改變,表明Nrf2在炎癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Nrf2誘導(dǎo)的下游靶基因HO-1是重要的抗炎酶,其抗炎機(jī)制被認(rèn)為是增加一氧化碳水平和抑制巨噬細(xì)胞的活性。Nrf2本身能夠負(fù)性調(diào)節(jié)炎癥調(diào)節(jié)因子和酶類,如炎性細(xì)胞因子、炎癥趨化因子、細(xì)胞黏附分子、金屬蛋白酶、環(huán)氧合酶2(COX-2)等。Kim等已經(jīng)詳細(xì)綜述了Nrf2與先天性和自身性免疫疾病、肺部炎癥、胃腸道炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、腎炎、皮膚損傷、腦部炎癥等炎癥相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系,因此Nrf2已成為研發(fā)治療以上疾病的重要靶點(diǎn)。1.3nrf2/在肌張血壓病作用下的病理組織學(xué)研究氧化應(yīng)激是許多神經(jīng)退行性疾病起始和發(fā)展的重要因素,有研究表明帕金森病和阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病與還原型谷胱甘肽減少以及Ⅱ相解毒酶失調(diào)引起的氧化或過氧化有關(guān)。而Nrf2/ARE信號(hào)通路的神經(jīng)保護(hù)作用已得到眾多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,Lee等認(rèn)為Nrf2是通過拮抗線粒體復(fù)合物Ⅵ阻滯劑和提高細(xì)胞內(nèi)鈣濃度來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能的。Nrf2/ARE信號(hào)通路激動(dòng)劑在肌萎縮側(cè)索硬化鼠模型上以及其他神經(jīng)退行性疾病模型上表現(xiàn)出良好的治療潛力。對(duì)于急性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如創(chuàng)傷性腦損傷、缺血性腦卒中、出血性腦卒中等,氧化應(yīng)激是發(fā)病機(jī)制中非常重要的組成部分。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在創(chuàng)傷性腦損傷時(shí)Nrf2及其調(diào)節(jié)的醌氧化還原酶(NQO1)等Ⅱ相解毒酶水平顯著增加,說明Nrf2/ARE信號(hào)通路是創(chuàng)傷性腦損傷時(shí)的內(nèi)源性適應(yīng)機(jī)制。而且一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了Nrf2的神經(jīng)保護(hù)作用,Nrf2信號(hào)通路誘導(dǎo)劑萊菔硫烷(sulforaphane)、姜黃素等也在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激、減少腦水腫和神經(jīng)炎癥等功能。1.4高血壓的治療糖尿病時(shí)的高糖狀態(tài)所引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的活性氧(ROS)在糖尿病急慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展上起關(guān)鍵作用。Nrf2/ARE信號(hào)通路作為參與氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路之一,已有研究證實(shí)其與包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種病變密切相關(guān)。Tan等在心肌細(xì)胞的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)糖尿病時(shí)能通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)下調(diào)Nrf2的功能,導(dǎo)致氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)胰島素抵抗,減少糖尿病患者心肌的葡萄糖利用。Xue等在高糖環(huán)境下培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1并用Nrf2的典型激動(dòng)劑萊菔硫烷作用6~48h,結(jié)果表明萊菔硫烷能夠恢復(fù)高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞生物化學(xué)紊亂,提示Nrf2/ARE可以作為口服藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。另外一項(xiàng)研究顯示Nrf2誘導(dǎo)劑奧體普拉可改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖和胰島素抵抗,說明Nrf2抗氧化系統(tǒng)抵抗胰島素抵抗和肥胖的重要作用。用Nrf2基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了Nrf2基因缺失會(huì)損害葡萄糖耐量并加重高血糖癥狀。2以nrf2為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)由于Nrf2/ARE通路在糖尿病、神經(jīng)性疾病、腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用,以Nrf2為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)在各領(lǐng)域展開了廣泛的探索,其中治療糖尿病腎病的巴多克沙龍(bardoxolone)和治療多發(fā)性硬化的富馬酸二甲酯(dimethylfumarate)已進(jìn)入了Ⅲ期臨床研究,有望誕生新藥。2.1巴多糖0.5%的糖尿病并發(fā)癥巴多克沙龍是一種合成的三萜類化合物,主要用于糖尿病腎病的治療。Dinkova-Kostova等發(fā)現(xiàn)巴多克沙龍能夠誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶(如NQO1)表達(dá),抑制誘導(dǎo)型氮氧化物合酶(iNOS)的表達(dá),這種作用在Nrf2-/-和keap1-/-的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中消失,證實(shí)其作用主要由Nrf2/ARE通路介導(dǎo)的。目前Reata制藥公司和雅培公司正在共同開展巴多克沙龍治療糖尿病腎病的大規(guī)模Ⅲ期臨床試驗(yàn)。一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)中,270位糖尿病慢性腎病患者隨機(jī)接受安慰劑或巴多克沙龍治療(25、75、150mg,po,每日1次)共52周。結(jié)果顯示,給藥4周后巴多克沙龍各劑量組患者腎功能即有改善(腎小球?yàn)V過率升高),24周時(shí)25、75、150mg劑量組腎小球?yàn)V過率分別增加(8.2±1.5)、(11.4±1.5)、(10.4±1.5)mL/(min·1.73m2),明顯高于安慰劑對(duì)照組(P<0.001),且治療者腎小球?yàn)V過率(GRF)的升高一直持續(xù)至52周。另一個(gè)多中心的開放臨床試驗(yàn)中,20位Ⅱ型糖尿病慢性腎病患者接受巴多克沙龍25mg/d治療28d,隨后加大劑量至75mg/d,56d時(shí)90%患者的GRF增加伴隨血肌酐和血尿素氮減少,并顯示出劑量和時(shí)間相關(guān),說明巴多克沙龍治療能明顯改善糖尿病患者的腎功能。研究者和雅培制藥公司稱這種藥物“有可能極大地改變慢性腎病的治療狀況、改善患者的預(yù)后”。2.2模擬檢測生物標(biāo)志物的活性和生物利用度從十字花科植物綠花椰菜提取的萊菔硫烷是一種Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑,可以預(yù)防多種化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的DNA損傷和腫瘤的發(fā)生。綠花椰菜中富含蘿卜硫苷(glucoraphanin),后者經(jīng)水解形成萊菔硫烷。在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,萊菔硫烷已經(jīng)表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性,主要作用機(jī)制是激活Nrf2信號(hào)通路,誘導(dǎo)Ⅱ相酶(NQO1、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等)的表達(dá)。Ding等給野生型和Nrf2-/-小鼠ig萊菔硫烷0、10、40μmol/kg,共5d,隨后ip給予4-苯基苯胺(ABP),24h后處死動(dòng)物,收集膀胱檢測dG-C8-ABP和Nrf2調(diào)節(jié)的細(xì)胞保護(hù)基因。結(jié)果野生型小鼠萊菔硫烷對(duì)dG-C8-ABP的阻止效率是61%,在Nrf2-/-小鼠中完全無作用;在野生型小鼠膀胱上皮細(xì)胞中能檢測到顯著的NQO1,Nrf2-/-小鼠中則檢測不到;這就證明萊菔硫烷能阻止ABP引起的膀胱細(xì)胞和組織的DNA損傷,其作用主要由Nrf2介導(dǎo)。Kensle等進(jìn)行了萊菔硫烷激活Nrf2/ARE信號(hào)通路及其安全性、藥動(dòng)學(xué)、生物利用度和藥效學(xué)等實(shí)驗(yàn)。其中一項(xiàng)優(yōu)化劑量處方的安慰劑對(duì)照試驗(yàn)招募了291名志愿者,給予試驗(yàn)者富含萊菔硫烷40μmol和富含蘿卜硫苷6mmol的混合物,3個(gè)月后評(píng)價(jià)綠花椰菜芽飲料對(duì)空氣污染生物標(biāo)志物的影響以及萊菔硫烷的耐受性和有效性。但是該試驗(yàn)結(jié)果至今還沒有公布。2.3動(dòng)星狀細(xì)胞的nrf2/au通路富馬酸二甲酯(BG-12)是治療多發(fā)性硬化癥的口服藥,作用機(jī)制包括抑制NF-κB、促進(jìn)活化T淋巴細(xì)胞的凋亡、增加細(xì)胞因子IL-4和IL-5、激動(dòng)Nrf2增加NQO1、HO-1以及谷胱甘肽的水平等。Lin等用20μmol富馬酸二甲酯和溶媒處理星狀細(xì)胞,結(jié)果富馬酸二甲酯組細(xì)胞核中檢測到的Nrf2水平比對(duì)照組高,研究者認(rèn)為富馬酸二甲酯激動(dòng)星狀細(xì)胞的Nrf2/ARE通路,提高谷胱甘肽的表達(dá),從而發(fā)揮對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞及其鄰近神經(jīng)元的保護(hù)作用。Scannevin等用富馬酸二甲酯或富馬酸單甲酯處理動(dòng)物或者神經(jīng)細(xì)胞都能增加細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的水平,然而這個(gè)現(xiàn)象在Nrf2基因敲除小鼠中消失。新藥BG-12已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,一個(gè)Ⅲ期臨床試驗(yàn)(DEFINE)是隨機(jī)雙盲、安慰劑對(duì)照、劑量比較研究,旨在確定其治療復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化患者的有效性和安全性。1200多名患者隨機(jī)接受安慰劑或BG-12治療,每日2次或每日3次,po,每次240mg,共2年。結(jié)果2年后服用BG-12每日2次、每日3次組及安慰劑組的復(fù)發(fā)率分別為27%、26%、46%(P<0.001);每日2次、每日3次BG-12組比安慰劑對(duì)照組的年復(fù)發(fā)率分別減少53%、48%(P<0.001),確認(rèn)的殘疾進(jìn)展分別減少38%(P=0.005)、34%(P=0.01)。另一項(xiàng)CONFIRM研究驗(yàn)證了DEFINE研究的結(jié)果,BG-12可顯著降低年復(fù)發(fā)率,用藥2年時(shí),服用BG-12每日2次、每日3次組分別比安慰劑組的年復(fù)發(fā)率低44%(