第三章 抗體工程制藥

第三章抗體工程制藥利用細(xì)胞融合技術(shù)，將骨髓瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合并成雜交瘤，雜交瘤細(xì)胞會(huì)持續(xù)分泌成分單一、有特異性的抗體?？乖哼M(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)對(duì)肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。2.單克隆抗體基本原理1.定義第二節(jié)單克隆抗體抗體：動(dòng)物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的免疫球蛋白。一種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定族，因此能刺激多個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，血清中的抗體是多克隆抗體。哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)主要有兩類淋巴細(xì)胞：T細(xì)胞和B細(xì)胞。前者能分泌淋巴因子(如干擾素)；后者能分泌抗體。一個(gè)B淋巴細(xì)胞可以繁殖為一個(gè)單克隆，但B淋巴細(xì)胞在體外不能無限地分裂繁殖。癌細(xì)胞具有無限增殖的特性。B淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，能產(chǎn)生單一抗體又能在體外無限生長(zhǎng)的雜合細(xì)胞。3.單克隆抗體的制備步驟1）動(dòng)物免疫經(jīng)過免疫處理的淋巴細(xì)胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法：抗原直接注射小鼠體內(nèi)，3－4天后，取出脾制成淋巴懸液，用于融合。體外法：提取大、小鼠淋巴細(xì)胞，加適當(dāng)濃度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴細(xì)胞。2）骨髓瘤細(xì)胞的選擇骨髓瘤細(xì)胞：能在體外無限繁殖和連續(xù)繼代培養(yǎng)，且為HPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或TK（胸腺嘧啶核苷激酶）的缺陷型。3）細(xì)胞融合將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)，1200rpm離心7—10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細(xì)胞鋪展成薄層，在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG0.5ml，隨后靜置90秒，再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。采用聚二乙醇(PEG)融合。4）HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞DNA生物合成有兩條途徑：一條由糖、氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，這是主要途徑。這條途徑可氨基喋呤阻斷。在有氨基喋呤的情況下，補(bǔ)救途徑可以合成DNA，但是需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)參與。雜交瘤技術(shù)中常選用HPRT和TK缺陷型骨髓瘤細(xì)胞。HAT是含次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基。雜種細(xì)胞通過互補(bǔ)作用獲得HRPT或TK基因，可在HAT培養(yǎng)基中通過補(bǔ)救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT或TK缺陷的親本腫瘤細(xì)胞死亡，淋巴細(xì)胞亦逐漸死亡，只有雜種細(xì)胞存活。5）雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞分泌多克隆抗體，單個(gè)細(xì)胞系分泌特異抗體才為單克隆抗體。分離單個(gè)細(xì)胞系方法：有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法等。有限稀釋法取出陽性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個(gè)細(xì)胞；如果每孔加0.1ml，其機(jī)率將為每孔內(nèi)落入一個(gè)細(xì)胞；經(jīng)過8~12天后，可觀察到有集落生長(zhǎng)的孔；根據(jù)檢測(cè)的陽性結(jié)果再次進(jìn)行克隆化；將細(xì)胞懸液稀釋至一定體積內(nèi)只含有一個(gè)細(xì)胞，取這個(gè)體積的懸液培養(yǎng)成單克隆。軟瓊脂培養(yǎng)法在加入飼養(yǎng)細(xì)胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細(xì)胞的0.25％的軟瓊脂。待細(xì)胞長(zhǎng)成集落后，用毛細(xì)管吸出移種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)。0.25％的軟瓊脂培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，毛細(xì)管吸出細(xì)胞克隆。6）單抗的大規(guī)模生產(chǎn)將穩(wěn)定分泌單抗的細(xì)胞株，接種于小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖。利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗。第三節(jié)基因工程抗體一、基因工程抗體的特點(diǎn)（與單克隆抗體比較）1．通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)。3．根據(jù)治療的需要，制備新型抗體；2．基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；4．可以采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)方式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本?；蚬こ炭贵w：采用基因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。二、基因工程抗體的應(yīng)用1.在腫瘤治療方面腫瘤生長(zhǎng)因子的封閉。阻斷受體信號(hào)傳導(dǎo)?？寡苌伞？贵w與毒素融合，特異性治療腫瘤。2.在治療病毒病方面3.在治療自身免疫病方面的應(yīng)用4.在哮喘、移植排斥、血管疾病等方面此外，在疾病診斷方面。第四節(jié)抗體的氨基酸順序抗體分子的基本結(jié)構(gòu)是由四肽鏈組成的。即：由二條相同的分子量較小的肽鏈(輕鏈)和二條相同的分子量較大的肽鏈(重鏈)組成。兩條重鏈(H)糖基化和兩條輕鏈(L)非糖基化；每條重鏈和輕鏈分為氨基端(N端)和羧基端(C端)。輕鏈（L）約220個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為24kD，有兩個(gè)由鏈內(nèi)二硫鍵組成的環(huán)肽，L鏈可分為：Kappa（κ）與lambda（λ）2個(gè)亞型。重鏈（H）約440-550個(gè)氨基酸殘基組成，分子量55-75kD，4-5個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，可分為5類，μ、γ、α、δ、ε鏈。不同的H鏈與L鏈（κ或λ）組成完整的Ig分子。分別稱為：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE?？勺儏^(qū)和恒定區(qū)：H鏈或L鏈的N-末端序列變化很大，稱為可變區(qū)（V區(qū)）；C-末端氨基酸則相對(duì)穩(wěn)定，變化很小，稱為恒定區(qū)（C區(qū)）?？勺儏^(qū)位于L鏈（VL）N端1/2處，H鏈（VH）N端1/5-1/4處。可變區(qū)可分為高變區(qū)（hypervariableregion，HVR）和骨架區(qū)（frameworkregion，F(xiàn)R）。高變區(qū)為抗體與抗原的結(jié)合位置，稱為決定簇互補(bǔ)區(qū)（complementarity-determiningregion，CDR），VL和VH的HVR1，HVR2，HVR3又分別稱為CDR1，CDR2，CDR3。恒定區(qū)（constantregion，C區(qū)）：L鏈C端1/2處，H鏈C端3/4-4/5處。在同一種屬動(dòng)物中是比較恒定的，是制備第二抗體進(jìn)行標(biāo)記的重要基礎(chǔ)。鉸鏈區(qū)和J鏈依據(jù)抗體的氨基酸保守保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，不同功能區(qū)的氨基酸變化，設(shè)計(jì)不同功能的新型抗體。1.嵌合抗體

從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體。第五節(jié)抗體分子的克隆基因工程抗體的種類（2）人源化抗體(改型抗體)

將小鼠的CDR（complementaritydeterminativeregion）序列移植到人抗體可變區(qū)框架中，產(chǎn)生的抗體稱為CDR移植抗體。（3）完全人源化抗體（全套抗體庫）

采用基因敲除術(shù)將小鼠Ig基因敲除，代之以人Ig基因，然后用Ag免疫小鼠，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)即可產(chǎn)生大量完全人源化抗體。（4）單鏈抗體用基因工程方法，將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)通過一個(gè)連接肽連接而成的重組蛋白。（5）雙價(jià)抗體與雙特異性抗體許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價(jià)的抗原結(jié)合

位點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩

個(gè)抗原分子連接。第六節(jié)篩選抗體克隆的展示技術(shù)一、噬菌體展示技術(shù)噬菌體屬于單鏈DNA病毒，包括f1、fd和M13等；（一）原理噬菌體DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制,細(xì)菌不被裂解,但生長(zhǎng)速度減慢,而且可分泌出大量成熟的噬菌體顆粒；絲狀噬菌體基因組編碼10種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白，與噬菌體展示密切相關(guān)的是二種不同的結(jié)構(gòu)蛋白pⅢ和pⅧ；M13噬菌體在pⅢ和pⅧ衣殼蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面，不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時(shí)保持的外源基因天然構(gòu)象，也能被相應(yīng)的抗體或受體所識(shí)別；利用固定與固相支持物的靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒?，洗去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目的噬菌體；外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測(cè)序推導(dǎo)出來。（二）技術(shù)流程1.噬菌體抗體庫的構(gòu)建用B淋巴細(xì)胞全套抗體可變區(qū)基因克隆并組裝成的噬菌體變異群體稱為噬菌體抗體庫抗體庫構(gòu)建的一般過程①?gòu)目勺儏^(qū)基因來源中分離RNA。②互補(bǔ)DNA第1條鏈的合成。③構(gòu)建可變區(qū)基因的PCR和可變區(qū)基因文庫。④進(jìn)行載體和可變區(qū)基因文庫的限制性消化和連接。⑤感染大腸桿菌并表達(dá)目的基因。⑥篩選抗體。2.特異性噬菌體抗體庫的篩選和富集（1）吸附結(jié)合固相篩選：即將靶抗原包被在固相介質(zhì)上，加入待篩選的噬菌體。液相篩選：即將靶抗原與生物素相連，再將其固定在包被有鏈親和素的磁珠上，在磁場(chǎng)的作用下將非特異性噬菌體和特異性噬菌體分開。細(xì)胞表面篩選：將靶抗原定位于細(xì)胞表面，從而以完整細(xì)胞進(jìn)行篩選。細(xì)胞內(nèi)化篩選。（2）洗脫（3）擴(kuò)增富集（4）篩選效率的檢測(cè)（5）克隆的鑒定2.酵母雙雜交技術(shù)細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與；轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上相互獨(dú)立