第一章基因工程概論2

三、基因工程（geneticengineering）基因工程研究發(fā)展史基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟

基因工程的應(yīng)用3.1基因工程的概念

目前世界許多國家將生物技術(shù)，信息技術(shù)和新材料技術(shù)作為三大重中之重技術(shù)，而生物技術(shù)可以分為傳統(tǒng)生物技術(shù)，工業(yè)生物發(fā)酵技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)。現(xiàn)在人們常說的生物技術(shù)實際上就是現(xiàn)代生物技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等五大工程技術(shù)。其中基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)。

遺傳學(xué)角度：一項遺傳學(xué)技術(shù)將生物的某個基因通過基因載體運(yùn)送到另一種生物的細(xì)胞中，并使之無性繁殖和行使正常功能，創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)技術(shù)無性繁殖：稱之為“克隆”行使正常功能：稱之為“表達(dá)”生物化學(xué)角度：重組載體的操作在體外，將各種來源的DNA片段與載體DNA結(jié)合成一個重組載體；重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物。DNA片段：同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的載體DNA：病毒、細(xì)菌質(zhì)粒或噬菌體基因工程（geneticengineering）

也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術(shù)。一般說來所謂的基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞中內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖。

基因工程的別名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物3.2基因工程研究發(fā)展史

基因工程的準(zhǔn)備階段基因工程的問世基因工程的迅速發(fā)展階段基因工程的準(zhǔn)備階段

在40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。在50年代揭示了DNA分子的雙螺旋模型和半保留復(fù)制機(jī)理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的問題。在50年代末期和60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功的破譯了遺傳密碼，從而闡明了信息的流向和表達(dá)問題。理論基礎(chǔ)中心法則由于基因工程是一門內(nèi)容廣泛、綜合性的生物技術(shù)學(xué)科，在60年代科學(xué)發(fā)展的水平下真正實施基因工程，還存在許多問題，特別是在技術(shù)方面。生物有機(jī)體，尤其是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的真核生物，其DNA含量是十分龐大的。DNAcontentofthehaploidgenomeisrelatedtothemorphologicalcomplexityoflowereukaryotes,butvariesextensivelyamongthehighereukaryotes.TherangeofDNAvalueswithinaphylumisindicatedbytheshadedarea.

每個基因都被認(rèn)為是編碼著一種蛋白質(zhì)分子，所以人們一直十分重視研究單基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。怎樣分離單基因，以便能在體外研究其結(jié)構(gòu)和功能的一系列問題，成為基因工程的關(guān)鍵所在。20世紀(jì)60年代末70年代初，限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶等的發(fā)現(xiàn)，使DNA分子進(jìn)行體外切割和連接成為可能。

70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技術(shù)問世。這兩項技術(shù)，使DNA的結(jié)構(gòu)分析問題得到了根本的解決。1972年首次構(gòu)建了一個重組DNA分子，并提出了體外重組的DNA分子進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程，以及在其中進(jìn)行復(fù)制和有效表達(dá)等問題。在60年代還發(fā)展出了瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)，這對于DNA片斷的分離、檢測十分有用，并很快被應(yīng)用于基因操作實驗。技術(shù)基礎(chǔ)理論上的三大發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理發(fā)現(xiàn)了遺傳信息的傳遞方式技術(shù)上的三大發(fā)明：限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶基因工程的載體逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)基因工程的問世

1973年Cohen等首次完成了重組質(zhì)粒DNA對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，同時與S.Boyer合作，將非洲爪蟾含核糖體基因的DNA片段與質(zhì)粒pSC101重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。此研究成果表明基因工程已正式問世；并說明了質(zhì)粒分子可以作為基因克隆的載體能攜帶外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，也說明了真核生物的基因可以轉(zhuǎn)移到原核生物細(xì)胞中并在其中實現(xiàn)功能表達(dá)。1972年美國斯坦福大學(xué)的伯格第一次重組DNA獲得成功.1972年，伯格把兩種病毒的DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，首次實現(xiàn)兩種不同生物的DNA體外連接，獲得了第一批重組DNA分子，這標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。伯格因此獲得了1980年諾貝爾化學(xué)獎。基因工程的迅速發(fā)展階段

自基因工程問世以的這二十幾年是基因工程迅速發(fā)展的階段。如果說20世紀(jì)八九十年代是基因工程基礎(chǔ)研究趨向成熟，那么二十一世紀(jì)初將是基因工程應(yīng)用研究的鼎盛時期。3.3基因工程的基本內(nèi)容從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段；在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子；將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（寄主細(xì)胞），并與之一起增殖；從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了細(xì)胞重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆；從這些篩選出來的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用；將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)?；蚬こ踢^程示意圖①②③④⑤⑥基因操作的基本步驟提取目的基因目的基因與運(yùn)載體結(jié)合將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測和表達(dá)一目的基因的檢測和表達(dá)二提取目的基因?qū)⑿枰幕驈墓w生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來取出DNA用限制酶切斷DNA

目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。提取目的基因的方法（一）直接分離基因——鳥槍法

將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個細(xì)胞獲得了需要的目的基因并得以表達(dá)，基因工程就算成功了。該法最大的缺點是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。用限制酶切成許多片斷提取目的基因的方法（二）人工基因合成法逆轉(zhuǎn)錄法：以信使RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成合成DNA(基因)。直接合成法：根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。DNA合成儀PCR擴(kuò)增儀目的基因與運(yùn)載體結(jié)合用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對后，在連拉酶的作用下連接形成重組DNA分子。提取質(zhì)粒并用限制酶切割用連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并擴(kuò)增基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌和動植物細(xì)胞等。導(dǎo)入受體細(xì)胞常用的方法是借鑒細(xì)菌或者病毒侵染細(xì)胞的途徑。通常還要對一些受體細(xì)胞進(jìn)行增大通透性的處理。目的基因可以隨著受體細(xì)胞進(jìn)行快速的繁殖，在很短的時間內(nèi)獲得大量的基因。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增目的基因的檢測和表達(dá)（一）前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。細(xì)菌的檢測，將每個受體細(xì)胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物目的基因的檢測和表達(dá)（二）多細(xì)胞生物的檢測，將每個受體細(xì)胞單獨培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應(yīng)變化的個體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。3.4基因工程的應(yīng)用

基因工程技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

基因工程大事記1973Cohen第一例成功的克隆實驗1978

Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物

1982

第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用

1985

第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國轉(zhuǎn)基因魚

1993

基因工程西紅柿在美國上市1997

英國羅斯林研究所多莉羊1999.9

中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計劃.負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列的1%2000.6.26

科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2001.2.11

公布人類基因組基本信息生產(chǎn)基因工程藥品基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生基因診斷基因治療如胰島素、干擾素如用基因探針檢測肝類病毒、診斷遺傳病把健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，達(dá)到治療疾病的目的在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

基因工程被用于大量生產(chǎn)過去難以得到或幾乎不可能得到的蛋白質(zhì)－肽類藥物。胰島素人生長激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長激素促生長素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體胰島素1000磅牛胰10克胰島素200升發(fā)酵液