分散液相微萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬尿中鹽酸克倫特羅和氯霉素殘留

分散液相微萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬尿中鹽酸克倫特羅和氯霉素殘留

鹽酸克倫特羅和氯霉素被用作飼料添加劑，但其作為動(dòng)物源性食品的殘留，導(dǎo)致各種緊急和慢性毒副作用，損害人體健康。目前這兩種化合物已被列為禁用獸藥,但在生豬養(yǎng)殖過(guò)程中仍有非法使用現(xiàn)象。分析豬尿中這兩種違禁藥物殘留是監(jiān)控生豬安全養(yǎng)殖的有效手段。豬尿中氯霉素的檢測(cè)報(bào)道較少,鹽酸克倫特羅的分析方法有用于篩選的半定量免疫分析法以及用于定量分析的高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。儀器定量法前處理較復(fù)雜,需經(jīng)HLB柱、陽(yáng)離子交換柱、免疫親和柱凈化,或固相微萃取裝置富集。分散液相微萃取是2006年由Rezaee首次提出的一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的樣品前處理技術(shù),目前已用于水中多種農(nóng)藥殘留的測(cè)定及人尿中精神類藥物的分析,但獸藥殘留測(cè)定方面卻較少報(bào)道。最近Liu等應(yīng)用陽(yáng)離子交換柱凈化結(jié)合分散液相微萃取、液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定了豬肉組織中的鹽酸克倫特羅。本實(shí)驗(yàn)采用分散液相微萃取技術(shù),結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,建立了快速、靈敏測(cè)定豬尿中鹽酸克倫特羅和氯霉素的分析方法。1實(shí)驗(yàn)部分1.1標(biāo)準(zhǔn)試劑和標(biāo)準(zhǔn)方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:TSQQuantum配Survey液相操作系統(tǒng)(美國(guó)ThemoFisherScientific公司);SynergiHydroRP色譜柱(150mm×2.0mm,3μm,美國(guó)Phenomenex公司);SorvallPrimoR高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)FisherScientific公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)Merck公司);異丙醇(色譜純,美國(guó)Tedia公司);丙酮、氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳(分析純,上?；瘜W(xué)試劑有限公司);鹽酸克倫特羅、氯霉素、D9-鹽酸克倫特羅(純度不低于99%)和D5-氯霉素(100mg/L乙腈溶液)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer;5.6%氨水溶液:取濃氨水稀釋5倍;D9-鹽酸克倫特羅和D5-氯霉素混合標(biāo)準(zhǔn)水溶液:0.5mg/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別準(zhǔn)確稱取10mg(精確至0.01mg)鹽酸克倫特羅和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成100mg/L的混合儲(chǔ)備液,用水稀釋儲(chǔ)備液至1mg/L用于加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。1.2萃取劑為混合溶劑吸取5mL(精確至0.01mL)尿樣于10mL離心管中,加入10μLD9-鹽酸克倫特羅和D5-氯霉素內(nèi)標(biāo)混合溶液(0.5mg/L),用約120μL5.6%氨水溶液調(diào)節(jié)pH至10.0,加入0.51gNaCl使其在水相中含量為10%,用微量注射器從離心管底部加入1000μL三氯甲烷-異丙醇(體積比1∶3)混合溶劑輕輕振蕩,形成水-分散劑-萃取劑的乳濁液體系,室溫放置5min,然后以7000r/min離心3min,用微量進(jìn)樣器吸取底部沉淀,氮?dú)獯蹈珊?加入甲醇-水(體積比1∶1)混合液500μL,振蕩渦旋15s,過(guò)0.45μm濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。1.3水質(zhì)條件色譜條件:柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5μL;流動(dòng)相:甲醇-5mmol/L醋酸銨溶液(含0.1%甲酸),體積比60∶40,流速:0.2mL/min。質(zhì)譜條件:電噴霧正負(fù)切換分段掃描:0～3.3min,正離子掃描,噴霧電壓4200V;3.3～6min,負(fù)離子掃描,噴霧電壓-3000V。毛細(xì)管溫度:350℃;碰撞氣氬氣:1.5mtorr。定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、碰撞能量等參數(shù)見表1。在此條件下,鹽酸克倫特羅和氯霉素的保留時(shí)間分別為2.4、3.9min(見圖1)。2結(jié)果與討論2.1不同分散劑組合對(duì)鹽酸克倫特羅和氯霉素萃取效率的影響在空白豬尿中添加鹽酸克倫特羅和氯霉素(加標(biāo)質(zhì)量濃度均為2μg/L,pH10.0)用于實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。取上述加標(biāo)豬尿5mL,分別以密度大于水且不溶于水的氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷和四氯甲烷為萃取劑,以能完全溶解萃取劑且溶于水的異丙醇、乙腈、甲醇和丙酮為分散劑,萃取劑與分散劑的體積分別為250μL和500μL,其余步驟同“1.2”,測(cè)定不同分散萃取體系下鹽酸克倫特羅和氯霉素的峰面積,計(jì)算其與20μg/L標(biāo)樣的峰面積比值,結(jié)果見表2。萃取劑四氯甲烷、氯苯與4種分散劑的組合對(duì)氯霉素的萃取效率偏低(小于25%)。綜合比較三氯甲烷、二氯甲烷與4種分散劑組合對(duì)2種化合物的萃取效率,以異丙醇/三氯甲烷為最優(yōu)分散萃取體系。2.2萃取溶劑的選擇分別以不同體積的三氯甲烷(20、50、125、250、500μL)和500μL異丙醇為萃取體系,加入5mL尿樣混合萃取(鹽酸克倫特羅和氯霉素的加標(biāo)質(zhì)量濃度均為2μg/L、pH10.0),其余步驟同“1.2”。三氯甲烷用量為20μL時(shí),萃取后的沉淀體積小于5μL,難以轉(zhuǎn)移下層沉淀相;三氯甲烷用量為50、125、250、500μL時(shí)生成的沉淀體積分別為20、80、220、480μL。鹽酸克倫特羅和氯霉素的峰面積如圖2所示(單位濃度氯霉素的峰面積響應(yīng)值小于鹽酸克倫特羅,圖2～圖5中氯霉素的峰面積放大3倍)。結(jié)果顯示,當(dāng)三氯甲烷體積從50μL增至250μL時(shí),鹽酸克倫特羅和氯霉素的萃取效率逐漸增加,此后萃取效率隨三氯甲烷體積的增加變化緩慢,本實(shí)驗(yàn)選擇三氯甲烷的最佳體積為250μL。分散劑的體積影響萃取劑在水中的分散程度,從而影響目標(biāo)化合物的提取效率。分別以不同體積的異丙醇(250、500、750、1000、1250μL)和250μL三氯甲烷為萃取體系,其余步驟同“1.2”,離心萃取后測(cè)得的結(jié)果如圖3所示。異丙醇體積從250μL增至1250μL時(shí),萃取效率先增加后略有降低,750μL時(shí)達(dá)到最高。因此實(shí)驗(yàn)選擇異丙醇的最佳體積為750μL。2.3不同ph值對(duì)鹽酸克倫特羅和氯霉素萃取效率的影響鹽酸克倫特羅和氯霉素為弱堿性化合物,鹽酸克倫特羅的pKa為9.42,氯霉素為9.61,本實(shí)驗(yàn)考察了pH在8.0～11.0范圍內(nèi)對(duì)化合物萃取效率的影響。調(diào)節(jié)尿樣pH值為8.0、9.0、10.0、11.0,以250μL三氯甲烷和750μL異丙醇為萃取體系,鹽酸克倫特羅和氯霉素的峰面積變化趨勢(shì)如圖4所示。結(jié)果顯示,當(dāng)pH值為10.0時(shí),鹽酸克倫特羅和氯霉素的萃取效率最佳。以250μL三氯甲烷和750μL異丙醇為萃取體系,在pH為10.0的條件下,考察了NaCl含量分別為0、5%、10%、15%、20%時(shí)對(duì)鹽酸克倫特羅和氯霉素萃取效率的影響(見圖5)。結(jié)果表明,采用10%NaCl進(jìn)行萃取時(shí),鹽酸克倫特羅的萃取率最高,且明顯優(yōu)于其他濃度點(diǎn)的萃取效果,而氯霉素在10%、15%和20%NaCl的條件下均有較高的萃取率,本實(shí)驗(yàn)最終選擇NaCl的最佳濃度為10%。2.4-氯霉素質(zhì)量濃度的計(jì)算用流動(dòng)相將鹽酸克倫特羅和氯霉素稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、10、20、50μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品,D9-鹽酸克倫特羅和D5-氯霉素的質(zhì)量濃度均為5μg/L。以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性擬合,得到鹽酸克倫特羅的回歸方程為y=0.2030x-0.1052,r=0.9991;氯霉素的回歸方程為y=0.2218x+0.0188,r=0.9993。以S/N=10計(jì)算得到本方法中鹽酸克倫特羅的定量下限為0.05μg/L,氯霉素的定量下限為0.1μg/L。2.5鹽酸克倫特羅和保鮮劑的加標(biāo)工藝為保證定量的準(zhǔn)確性,減少液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析時(shí)基質(zhì)的干擾,測(cè)定豬尿樣品時(shí)添加0.5μg/L的D9-鹽酸克倫特羅和D5-氯霉素。鹽酸克倫特羅的加標(biāo)水平為0.05、0.5、1、2μg/L,方法回收率為82%～90%,RSD為6.8%～9.3%;氯霉素的加標(biāo)水平為0.1、0.5、1、2μg/L,方法回收率為87%～97%,RSD為7.5%