植物寄生線蟲食線蟲真菌的研究進展

植物寄生線蟲食線蟲真菌的研究進展

植物寄生蟲鏈對作物造成的損失極為嚴重。世界每年的損失超過1000億美元，其中70%的損失被認為是根結(jié)線蟲造成的。在對線蟲的防治中,常用的方法有輪作防病、化學防治、生物防治和抗病育種等。作物輪作防病被廣泛應用,但有一定的局限性,它不適應于寄主范圍較寬的根結(jié)線蟲的防治。利用抗病品種是最經(jīng)濟的方法,但目前常規(guī)的抗病育種方法存在兩個問題:一是利用單一抗性基因使得不受抗性影響的線蟲大量繁殖而造成新的病害,或造成小種變異,二是抗病材料的匱乏也使常規(guī)育種遠遠滿足不了生產(chǎn)的需要?；瘜W防治一直是目前采取的主要防治對策,近年來,由于滅生性強的化學藥物防治線蟲引發(fā)了環(huán)境污染、抗藥性增強的問題,以及化學藥物在環(huán)境中的殘留期延長等諸多弊端的逐漸顯露,生物防治病原線蟲日益受到重視,逐漸成為了研究熱點;與此同時,生防制劑的開發(fā)也就成為了解決問題的重點和難點。食線蟲真菌(nematophagousfungi)是線蟲的真菌天敵,是指寄生、捕捉、定殖、毒殺線蟲的一大類真菌。利用食線蟲真菌防治線蟲是線蟲生物防治的重心,圍繞這一重心和目的,科研工作者就這類真菌的分類學、生物學、分子生物學以及生防菌劑的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化進行了170多年的研究,積累了豐富的研究基礎,取得了極大的進展,但是也面臨著一些迫切需要解決的問題。1食線蟲真菌資源食線蟲真菌主要包括捕食線蟲真菌,內(nèi)寄生真菌,產(chǎn)毒素殺線蟲真菌和定殖于固著性線蟲、卵、雌蟲、胞囊的機會病原真菌4大類。目前,全世界報道的食線蟲真菌種類400多種,中國報道的種類200多種。對食線蟲真菌全面系統(tǒng)地進行研究的是云南大學張克勤研究團隊和中國科學院微生物研究所劉杏忠研究團隊,兩團隊報道了我國食線蟲真菌及其相關真菌的絕大多數(shù)物種,發(fā)表新種30多個。專著《食線蟲菌物分類學》,《中國真菌志—節(jié)叢孢及相關屬》真實反映了我國在食線蟲真菌資源研究方面的概況和水平。據(jù)估計全世界有8000多種食線蟲真菌還未被報道,其中中國擁有近2700種未知種類。資源是生物防治的基礎,這些資源為植物寄生線蟲生防制劑的研發(fā)提供了極其珍貴的資源儲備。2粗狀節(jié)叢孢對雙孢菇線蟲的防效整個食線蟲菌物的研究歷史始于1839年Corda對節(jié)叢孢屬(ArthrobotrysCorda)的建立及發(fā)表多孢節(jié)叢孢新種(A.superba)。1852年Fresenius報道了該屬的另一個種少孢節(jié)叢孢(A.oligospora),但當時還未認識到這類真菌具有捕食線蟲的習性。1870年Woronin發(fā)現(xiàn)少孢節(jié)叢孢可以形成菌網(wǎng),但仍不知道菌網(wǎng)的作用。直到1888年德國科學家Zopf開始認識到菌網(wǎng)具有捕食線蟲的習性,正式揭開了捕食線蟲的研究歷史。以捕食線蟲真菌作為線蟲生防因子始于1978年法國的Cayrol等成功地應用粗狀節(jié)叢孢(A.robusta)防治雙孢蘑菇菌絲線蟲(Ditylenchusmyceliophagus),使蘑菇產(chǎn)量比未施用該菌物的對照提高25%,并制成了商品制劑Royal300,對法國雙孢蘑菇菌絲線蟲的防治起了重要作用。1979年,Cayrol等又用不規(guī)則節(jié)叢孢(A.irregalaris),以麥粒作基物生產(chǎn)了第二個商品制劑Royal350,防治蔬菜根結(jié)線蟲。溫室防治根結(jié)線蟲比單獨施用化學藥劑和其它方法均有效,大田施用對蕃茄等根結(jié)線蟲有一定防效。20世紀80年代初,在菲律賓用淡紫擬青霉(Pacilomyceslilacinus,商品名為Biocon)防治馬鈴薯根結(jié)線蟲取得了較好防效。法國Deleij等1992年用厚垣孢輪枝菌(Verticilliumchlamydosporium)防治溫室番茄根結(jié)線蟲,效果達90%,該菌能在番茄土壤中增殖,并存活至少123d。將該菌與化學藥劑(aldicarb)混合使用,效果可達98%,而化學藥劑對菌劑沒有影響。劉杏忠等2001年在美國篩選出洛氏被毛孢(Hirsutellarhossiliensis),經(jīng)培養(yǎng)后施入土壤,在溫室自然條件下對大豆孢囊線蟲防效達90%以上,Kerry1984年用厚垣孢輪枝菌防治小麥胞囊線蟲(Heteroderaavenae),可降低雌蟲量65%。劉杏忠在東北用淡紫擬青霉防治大豆孢囊線蟲,推廣12000hm2,平均防效達60%。張克勤等從云南篩選出一株厚垣孢輪枝霉ZK7,完成了該菌的30t罐工業(yè)化生產(chǎn),申請了專利,獲得農(nóng)藥三證,推廣5000hm2,對煙草根結(jié)線蟲防效平均達60%。3細菌超微結(jié)構(gòu)及宿主基因檢測食線蟲真菌侵染寄主線蟲的過程包含一系列生物事件:首先粘附到寄主體表,接著穿透體壁,最后侵入和消化體內(nèi)組織細胞而獲得營養(yǎng)。迄今,對這一侵染過程的分子機制尚缺乏足夠的認識,但基于昆蟲病原菌的研究結(jié)果,真菌產(chǎn)生的胞外酶類參與了侵染過程:溶解體壁以促進穿透;釋放營養(yǎng)供病原物生長;對線蟲產(chǎn)生細胞毒效應;消化組織并抑制其它微生物的再度入侵。由于線蟲體表和消化道表面覆蓋一層有彈性的非細胞結(jié)構(gòu)的天然屏障角質(zhì)膜,膠原蛋白是構(gòu)成線蟲角質(zhì)膜的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白,而且線蟲體壁主要由蛋白質(zhì)組成,溶膠原的絲氨酸蛋白酶能有效地降解線蟲體壁,破壞角質(zhì)膜的完整性,有利于真菌穿透侵染。作為侵染利器的胞外蛋白酶則成為興趣焦點,其純化是研究性質(zhì)和功能鑒定的前提。瑞典Lund大學的Ahman等率先開展真菌侵染線蟲相關酶的研究,從捕食線蟲真菌少孢節(jié)叢孢(A.oligospora)中克隆了首個真菌降解線蟲體壁的胞外蛋白酶基因PII,PII編碼的蛋白酶活性能被苯甲磺酰氟抑制劑所抑制,表明其活性中心有絲氨酸殘基,在蛋白酶分類上屬于絲氨酸蛋白酶,該酶是少孢節(jié)叢孢侵染線蟲的主要蛋白酶之一,當然,還有其它類型的酶參與了侵染過程。除了絲氨酸類蛋白酶外,Veenhuis等以A.oligospora和Panagrellusredivivus為模式系統(tǒng)進行超微結(jié)構(gòu)研究和細胞化學研究,證明了A.oligospora能產(chǎn)生過氧化氫酶(catalase)等氧化還原酶。分子生物學的飛速發(fā)展極有可能為線蟲生防開創(chuàng)新途徑。近5年來,國內(nèi)張克勤團隊、劉杏忠團隊開展了食線蟲真菌侵染線蟲相關酶的研究,克隆、表達了一批侵染性絲氨酸蛋白酶基因,幾丁質(zhì)酶基因。目前正在從結(jié)構(gòu)生物學和生物信息學的角度進行侵染性蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)解析及功能區(qū)分析。在食線蟲真菌中有一類真菌以菌絲特化形成的各種捕食器捕食線蟲,形成的捕食器官類型主要有:收縮環(huán),非收縮環(huán)、粘球、粘性分枝,三維菌網(wǎng)等。對捕食器進行分子水平的研究對于解析微生物與其宿主間的相互關系,微生物結(jié)構(gòu)的分子調(diào)控有重要意義。在目前對捕食器編碼基因一無所知情況下,無法設計特異探針從基因組中將該基因擴增出來,但有三條有效的方法可供選擇或同時進行。一是從捕食器的蛋白質(zhì)入手,分離、純化這種(或這些)蛋白質(zhì),通過對蛋白質(zhì)的測序,得到氨基酸序列,然后設計探針可以將我們的目的基因從基因組中擴增出來,并進行建庫和測序,最后用獲得序列與產(chǎn)生捕食器官和不產(chǎn)生捕食器官的菌絲體進行Northern雜交,從侯選的基因序列中檢測出捕食器官的基因。二是利用mRNA差別顯示PCR技術通過雜交方法從中鑒定出捕食器官基因。三是利用限制性內(nèi)切酶介導的DNA整合技術(Restrictionenzyme-mediatedDNAintegration,REMI)。REMI技術是指在CaCL2/PEG/限制性酶的轉(zhuǎn)化體系中,將帶有特定標記的外源DNA片段(來自質(zhì)粒)插入染色體DNA中(如捕食線蟲真菌的染色體),這樣就打亂了被插入細胞本身的遺傳框架而產(chǎn)生許多轉(zhuǎn)化子,篩選我們需要的轉(zhuǎn)化子(如捕食器官基因不表達的所有突變子),然后再利用質(zhì)?；厥占夹g(plasmidrescue)將插入的外源DNA片段及其插入點附近的染色體DNA以一個環(huán)狀質(zhì)粒的形式從染色體中分離出來。接著進行下一步的建庫,測序和鑒定等工作。到目前為止,國內(nèi)外尚未報道一個有關捕食器形成的相關基因。4抗菌活性研究活體菌對線蟲的生防受土壤生物和非生物因素的影響較大,由此激發(fā)人們努力探索微生物次生代謝產(chǎn)物來防治線蟲。食線蟲產(chǎn)毒菌物(toxicfungi)是指能夠產(chǎn)生毒素毒害線蟲的一類菌物,食線蟲產(chǎn)毒菌物的代謝產(chǎn)物十分豐富,從50多株菌中分離到90多種對線蟲有活性的化合物,其結(jié)構(gòu)類型多樣,主要有醌類、生物堿類、萜類、肽類、吡喃類、呋喃類、脂肪酸類、萘類等。在這一領域最出色的是德國Anke及其學生所作的貢獻。他們研究了50多株食線蟲真菌,從中獲得具有毒殺線蟲的活性代謝產(chǎn)物96個,主要是醌類化合物,生物堿類化合物、萜類化合物、大環(huán)內(nèi)酯類化合物、肽類化合物、頂環(huán)氧菌素類化合物和吡喃類化合物。Stalder等人[14,15,16,17,18,19,20,21,22,23]從子囊菌Lachumpapyraceum中分離到30多個化合物,并多數(shù)為新化合物,其中鑒定了24個對線蟲有活性的物質(zhì)。Anke等人檢測了267株子囊菌的培養(yǎng)液對線蟲的活性,發(fā)現(xiàn)屬于18個屬的29株子囊菌產(chǎn)生殺線蟲毒素。Stadler等用水瓊脂平板測定方法檢測了202株擔子菌對C.elegans活性,發(fā)現(xiàn)17株有活性。在這17株中,只有14株液體發(fā)酵抽提物對C.elegans有活性。進一步檢測水瓊脂平板試驗已表明沒有活性的25株菌株的液體發(fā)酵抽提物對C.elegans活性,只發(fā)現(xiàn)3株有活性。這些有活性的菌株大部分分布在側(cè)耳屬和猴頭菌屬。Mayer等從奧爾類臍菇(Omphalotusolearius)分離到一個商業(yè)利用前景的次級代謝物環(huán)十二縮肽omphalotinA。它對南方根結(jié)線蟲的活性最大,18h后半致死量為0.75ppm,1h后半致死量為2ppm,比商業(yè)殺線劑啊維菌素活性更高。云南大學張克勤團隊在國內(nèi)率先開展了真菌殺線蟲代謝產(chǎn)物的研究。篩選了1000多株高等擔子菌、半知菌以及水生真菌,有30多個種為首先報道真菌代謝產(chǎn)物對線蟲有毒殺作用,目前已分離和鑒定了40多個化學結(jié)構(gòu),其中從Hypomyucessp.分離到的次生代謝產(chǎn)物痂囊羥菌素對松材線蟲的半致死率為15μg/ml,具有一定的開發(fā)前景。5土壤抑菌生防菌作用線蟲生防中的一個共同問題是在實驗室試驗和溫室試驗防效極高的生防菌在大田中的防效卻偏低和不穩(wěn)定,這也是土傳病蟲害微生物防治的一個通病。經(jīng)過研究,人們發(fā)現(xiàn)土壤對生防菌存在嚴重的土壤抑菌作用(fungistasisofsoil),在嚴重抑菌土壤中,生防菌的萌發(fā)率低于10%,這是制約土傳病蟲害生防的瓶頸。在線蟲生防中,孫漫紅等測定了東北10多份土壤對線蟲生防菌的土壤抑菌作用。莫明和等系統(tǒng)地對土壤抑菌作用問題進行了研究。測定了來自全國26個省市2010份土壤樣品對9種真菌生防菌(Paecilomyceslilacinus、Pochoniachlamydosporia、Lecanicilliumpsalliotae、Beauveriabassiana、Clonostachysrosea、Trichodermaviride、T.harzianum、T.koningii、T.hamatum)的抑菌作用。結(jié)果顯示:中國農(nóng)業(yè)土壤對真菌生防菌的抑菌作用普遍存在,所有供試土樣對供試真菌都表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用,對孢子萌發(fā)的平均抑制率在22.8%~97.5%之間,對菌絲生長的平均抑制率在17.3%~75.6%之間。在土壤抑菌作用形成機制方面,利用可培養(yǎng)方法結(jié)合16SrRNA-RFLP序列分析方法對通過產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的細菌區(qū)系進行了系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)以下5大細菌類群:Alcaligenaceae、Bacillales、Micrococcaceae、Rhizobiaceae和Xanthomonadaceae通過分泌揮發(fā)性物質(zhì)參與土壤抑菌作用。利用可培養(yǎng)方法結(jié)合16SrRNA-ARDRA序列分析方法對產(chǎn)生非揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的細菌區(qū)系進行了系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)3大細菌類群:Actinobacterales、Bacillales和Gammaproteobacteria通過分泌非揮發(fā)性物質(zhì)參與土壤抑菌作用。其中Arthrobacter、Bacillus和Pseudomonas3個屬的細菌為優(yōu)勢菌群。利用GC/MS分析了土壤抑菌參與土壤抑菌作用的揮發(fā)性物質(zhì),通過純品驗證,確定出11種參與土壤抑菌作用的細菌揮發(fā)性物質(zhì)。從強抑菌作用土壤中分離獲得抑菌力最強的菌株Bacilliussp.H6,發(fā)現(xiàn)其抑菌作用機理是通過產(chǎn)生抑菌蛋白,致使真菌孢子和芽管異常膨大從而阻止真菌的繁殖。通過硅膠板薄層層析,顯色劑顯色和用陽性快速原子轟擊質(zhì)譜,鑒定該抑菌蛋白為伊枯菌素A,并測定了該抑菌蛋白對線蟲生防菌的抑菌作用。通過上述研究,對土壤抑菌真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長機制進行了詮釋:在土壤生態(tài)系統(tǒng)中,經(jīng)過長期的適應性進化,每一特定的土壤環(huán)境中形成了相對穩(wěn)定的生物區(qū)系,這些生物間形成了相互依賴和相互制約的復雜關系,而生物分泌的代謝產(chǎn)物是維系這種關系的主要調(diào)控因子。這種關系既有保持該生境生物群落相對穩(wěn)定的功能,又有抵御外來生物種類的入侵和干擾的功能。土壤抑菌作用是其后一功能的具體體現(xiàn)。土壤對真菌生防菌的抑菌作用普遍存在,不同理化性質(zhì)的土壤(如pH)對不同真菌的抑菌程度不同,表現(xiàn)出抑菌程度的復雜性和多樣性。對真菌生防菌而言,土壤抑菌作用將使其在土壤中長時間處于休眠狀態(tài),很難在土壤中生長和定殖,進而影響生防制劑的防效及其穩(wěn)定性。6取代化學農(nóng)藥