綠孔雀檢疫技術(shù) 第4部分：消化道線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

1DB53/TXXXX—2021綠孔雀檢疫技術(shù)第4部分：消化道線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范本規(guī)范明確了綠孔雀(Pavomuticus）檢疫技術(shù)中消化道線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的試驗(yàn)原理、常見(jiàn)線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)特征、試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。本文件適用于綠孔雀檢疫技術(shù)中消化道線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1線(xiàn)蟲(chóng)Nematodes線(xiàn)蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)為假體腔動(dòng)物，線(xiàn)蟲(chóng)屬通常呈圓柱形，線(xiàn)狀或毛發(fā)狀，某些種類(lèi)呈鞭狀或球狀。不分節(jié)，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)并具有三胚層假體腔，一般為雌雄異體。蟲(chóng)體大小隨種類(lèi)不同差別較大，雄蟲(chóng)一般較雌蟲(chóng)為小。寄生性線(xiàn)蟲(chóng)最常見(jiàn)寄生于消化系統(tǒng)。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。BLAST：基于局部序列比對(duì)算法的搜索工具BasicLocalAlignmentSearchToolDNA：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicacidNCBI：美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NationalCenterforBiotechnologyInformationPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReactionTAE：Tris-乙酸電泳緩沖液TrisAcetate-EDTABuffer5試驗(yàn)原理綠孔雀消化道線(xiàn)蟲(chóng)的檢測(cè)可采用形態(tài)學(xué)觀(guān)察線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)卵或蟲(chóng)體的方法，當(dāng)鏡檢發(fā)現(xiàn)形態(tài)特征明確的線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)卵，如毛細(xì)線(xiàn)蟲(chóng)，可直接作出判定；對(duì)于無(wú)法利用形態(tài)學(xué)鑒定的蟲(chóng)卵或蟲(chóng)體，進(jìn)一步采用PCR方法進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定。2DB53/TXXXX—20216常見(jiàn)線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)特征綠孔雀線(xiàn)蟲(chóng)的基本形態(tài)特征參見(jiàn)附錄A。7試驗(yàn)條件7.1實(shí)驗(yàn)室通用要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿(mǎn)足GB19489中的要求。7.2人員要求采樣和試驗(yàn)人員為具有相應(yīng)的專(zhuān)業(yè)知識(shí)人員。7.3生物安全要求采樣及試驗(yàn)過(guò)程中做好自身防護(hù)，試驗(yàn)結(jié)束后的檢驗(yàn)器具要進(jìn)行消毒處理，廢棄樣品要及時(shí)進(jìn)行無(wú)害化集中處理。8儀器設(shè)備和試劑8.1主要儀器設(shè)備8.1.1正置光學(xué)顯微鏡。8.1.2載玻片及蓋玻片若干，漏斗、玻璃棒、燒杯。8.1.3金屬篩：60目。8.1.4PCR擴(kuò)增儀。8.1.5高速臺(tái)式離心機(jī)。8.1.6電子天平：量程0.01mg～10000mg。8.1.7恒溫水浴鍋：36℃±1℃,65℃±1℃。8.1.8超純水器，高壓滅菌器。8.1.9單道移液器（量程0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL和100μL～1000μL）。8.1.10電泳槽、電泳儀、紫外凝膠成像儀、渦旋振蕩器。8.2主要試劑8.2.1飽和食鹽水。8.2.22.5%重鉻酸鉀液，乳酸酚透明液。8.2.3基因組DNA提取試劑盒。8.2.42×TaqPCRMasterMix酶。8.2.5DL2000DNAMarker。8.2.6無(wú)菌水。8.2.750×TAE緩沖液：Tris堿242g和57.1mL冰醋酸，用雙蒸水定容到1L。8.2.8核酸染料，用于凝膠成像顯示條帶。8.2.91%瓊脂糖凝膠：1g瓊脂糖與100mL1×TAE緩沖液，加熱融化均勻，60℃時(shí)，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳。3DB53/TXXXX—20219樣品樣品從綠孔雀糞便中采集，采樣和保存方法見(jiàn)附錄B。10試驗(yàn)步驟10.1形態(tài)學(xué)檢測(cè)10.1.1蟲(chóng)卵檢測(cè)采用飽和食鹽水漂浮法，線(xiàn)蟲(chóng)卵富集在飽和液表面。取糞樣5g，加飽和食鹽水50mL，用玻璃棒攪勻，通過(guò)60目金屬篩或雙層紗布過(guò)濾到干凈燒杯中，靜置0.5h；蘸取表面液膜，點(diǎn)樣于載玻片上，蓋上蓋玻片，進(jìn)行鏡檢。10.1.2蟲(chóng)體檢測(cè)從糞樣中分離蟲(chóng)體，用生理鹽水清洗干凈，放于載玻片，滴加乳酸酚透明液2～3滴，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察透明蟲(chóng)體的內(nèi)部形態(tài)構(gòu)造。對(duì)于存疑蟲(chóng)體，結(jié)合下述PCR擴(kuò)增方法對(duì)其進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定。10.2PCR檢測(cè)10.2.1DNA的提取和保存取糞樣，用商品化DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，步驟按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1周內(nèi)使用到的DNA，裝有DNA的離心管保存于4℃冰箱中；需要長(zhǎng)期保存的DNA，裝有DNA的離心管保存于-20℃冰箱10.2.2PCR擴(kuò)增10.2.2.1PCR擴(kuò)增引物針對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)ITS基因的部分片段設(shè)計(jì)引物，此引物靈敏度和特異性較高。上下游引物序列如下：BD1：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′；BD2：5′-ATGCTTAAATTCAGCGGGT-3′。10.2.2.2PCR擴(kuò)增體系PCR擴(kuò)增體系為50μL，包括2×TaqPCRMasterMix酶25.0μL，無(wú)菌水19.0μL，引物BD1和BD2各2.0μL，DNA模板2.0μL。10.2.2.3PCR擴(kuò)增程序用PCR擴(kuò)增儀設(shè)置反應(yīng)程序，94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，設(shè)置30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后72℃延伸5min，16℃結(jié)束反應(yīng)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。10.2.2.4PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物5μL，加入1%瓊脂糖凝膠電泳孔中，以DL2000DNAMarker作為參照，110V電壓電泳30min。將凝膠取出放入紫外凝膠成像儀中觀(guān)察并拍照。若出現(xiàn)預(yù)期的1000bp左右的條帶，擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序后驗(yàn)證。4DB53/TXXXX—202111試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理11.1蟲(chóng)卵檢測(cè)經(jīng)飽和食鹽水漂浮法鏡檢發(fā)現(xiàn)如附錄C中圖C.1或圖C.2所示的蟲(chóng)卵，直接判定為綠孔雀消化道線(xiàn)蟲(chóng)感染陽(yáng)性。若發(fā)現(xiàn)存疑蟲(chóng)卵，對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBIGenBank中的序列進(jìn)行BLAST在線(xiàn)比對(duì)，判定是否為綠孔雀消化道線(xiàn)蟲(chóng)感染陽(yáng)性。11.2蟲(chóng)體檢測(cè)對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行鏡檢觀(guān)察到如附錄C中圖C.3或圖C.4所示的蟲(chóng)體，直接判定為綠孔雀消化道線(xiàn)蟲(chóng)感染陽(yáng)性。若發(fā)現(xiàn)存疑蟲(chóng)體，對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBIGenBank中的序列進(jìn)行BLAST在線(xiàn)比對(duì)，判定是否為綠孔雀消化道線(xiàn)蟲(chóng)感染陽(yáng)性。5DB53/TXXXX—2021（資料性）消化道線(xiàn)蟲(chóng)的基本形態(tài)特征寄生于孔雀體內(nèi)的線(xiàn)蟲(chóng)主要為蛔蟲(chóng)（Ascaridia）、異刺線(xiàn)蟲(chóng)（Heterakis）和毛細(xì)線(xiàn)蟲(chóng)（Capillaria——蛔蟲(chóng)（Ascaridia）呈黃白色，圓柱狀，雄蟲(chóng)長(zhǎng)2.6cm～7cm；雌蟲(chóng)長(zhǎng)6.5cm～11cm。蟲(chóng)卵呈橢圓形，深灰色，卵殼光滑，大小為（70～90）μm×（47～51）μm；——異刺線(xiàn)蟲(chóng)（Heterakis）屬于異刺科異刺屬線(xiàn)蟲(chóng)，寄生于孔雀等禽類(lèi)的盲腸。蟲(chóng)體呈細(xì)線(xiàn)狀，淡黃色。雄蟲(chóng)長(zhǎng)7mm～13mm；雌蟲(chóng)長(zhǎng)10mm～15mm。蟲(chóng)卵呈橢圓形，淺灰色，大小為（65～80）μm×（35～46）μm；——毛細(xì)線(xiàn)蟲(chóng)（Capillaria）成蟲(chóng)呈乳白色。前端細(xì)長(zhǎng)，毛發(fā)狀，蟲(chóng)體后端由細(xì)變粗，形狀呈鞭子樣。雄蟲(chóng)長(zhǎng)23.7mm～54.4mm，尾部卷曲；雌蟲(chóng)長(zhǎng)39.4mm～53.0mm，尾部稍有彎曲。蟲(chóng)卵呈腰鼓形，黃褐色，卵殼較厚，兩端有卵塞，大?。?5～80）μm×（35～46）μm。6DB53/TXXXX—2021（規(guī)范性）糞樣的采集和保存方法B.1采樣工具一次性PE手套、封口袋、樣品管、照相機(jī)等。B.2糞樣的選取原則B.2.1采集綠孔雀新鮮糞樣，同一堆糞樣只采集一份樣品。B.2.2如遇到綠孔雀母幼糞樣，分開(kāi)采集；依據(jù)母綠孔雀和幼綠孔雀的糞樣大小有明顯差異作出判斷，并在備注欄記錄。B.3樣品采集方法B.3.1在采集用于消化道線(xiàn)蟲(chóng)研究的糞樣時(shí)，采集較為新鮮、無(wú)污染的糞便樣品，并佩戴一次性PE手套。每次采樣時(shí)應(yīng)更換新的PE手套，以避免樣品間的交叉污染。B.3.2采集時(shí)，直接剝?nèi)》蛛x新鮮糞樣的表層部分和內(nèi)部部分，分別放入樣品管中，貼上樣品標(biāo)簽紙，寫(xiě)上樣品編號(hào)和坐標(biāo)，將樣品管放入自封袋，并再次寫(xiě)上樣品編號(hào)。B.3.3同一堆糞樣應(yīng)盡量多取樣品。B.4樣品記錄與編號(hào)在采集糞樣時(shí)，應(yīng)填寫(xiě)《綠孔雀糞樣采集記錄表》（見(jiàn)表B.1）。記錄采樣包括樣品編號(hào)，采集管數(shù)，采集地名稱(chēng)，采集地經(jīng)緯度、海拔，采集日期，采集人等信息。表B.1綠孔雀糞樣采集記錄表B.5樣品的臨時(shí)保存野外樣品采回后，仔細(xì)檢查核對(duì)標(biāo)簽和記錄。有條件時(shí)在4℃冷藏保存，直到樣品送到相關(guān)實(shí)驗(yàn)室。B.6樣品的運(yùn)輸和實(shí)驗(yàn)室保存野外樣品采集完成后應(yīng)于48h內(nèi)送到相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，并盡快進(jìn)行DNA提取工作。運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)注意保持低溫，可將糞樣靜置于冰袋上，用泡沫箱進(jìn)行保溫。B.7樣品的采集、運(yùn)輸和處理過(guò)程中的生物安全糞樣的采集、運(yùn)輸和處理過(guò)程中的生物安全要求應(yīng)符合GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范的要求。7DB53/TXXXX—2021（資料性）綠孔雀消化道