放射免疫檢測(cè)技術(shù)

關(guān)于放射免疫檢測(cè)技術(shù)基本內(nèi)容一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理二、放射免疫分析（RIA）三、免疫放射分析（IRMA）四、RIA與IRMA的比較五、放射免疫分析中造成測(cè)量誤差的因素六、核廢物的處理七、應(yīng)用八、課堂小結(jié)九、作業(yè)第2頁,共36頁，2024年2月25日，星期天一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理1、7個(gè)基本概念2、常用的放射性核素3、放射性核素的選擇原則4、放射性標(biāo)記的抗原或抗體的要求5、制備放射性核素標(biāo)記物6、放射性標(biāo)記物的純化7、理想的分離技術(shù)8、免疫復(fù)合物分離常用方法9、核射線探測(cè)儀器的探測(cè)原理第3頁,共36頁，2024年2月25日，星期天1、7個(gè)基本概念⑴放射性核素：是指原子核能自發(fā)地產(chǎn)生成分或能級(jí)的變化，在變化時(shí)伴有射線的發(fā)射（放射性），然后變成另一種元素的核素。

一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理放射量單位有:①放射性活度②放射性比活度③放射性濃度第4頁,共36頁，2024年2月25日，星期天1、7個(gè)基本概念⑵放射性活度：一定量的放射性核素在單位時(shí)間內(nèi)的核衰變數(shù)，即每秒核衰變次數(shù)。單位：貝可勒爾(Becquerel，Bq)1Ci=3.7×1010Bq一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第5頁,共36頁，2024年2月25日，星期天1、7個(gè)基本概念⑶放射性比活度：是指固體樣品的放射性活度，即單位質(zhì)量樣品中所含放射性活度，以Bq/g或Bq/mmol表示。⑷放射性濃度：是指液體樣品的放射性活度，即單位體積溶液中所含放射性活度，以Bq/ml表示。一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第6頁,共36頁，2024年2月25日，星期天1、7個(gè)基本概念⑸比活度：是單位質(zhì)量標(biāo)記物的放射強(qiáng)度，單位為Bq/

g。

標(biāo)記抗原的比放射性越高，所需標(biāo)記抗原量越少，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的敏感度越高。但過高的比放射性可能會(huì)損傷抗原的免疫活性。如碘標(biāo)記化合物以單碘標(biāo)記為宜。一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第7頁,共36頁，2024年2月25日，星期天1、7個(gè)基本概念⑹放射化學(xué)純度：是指結(jié)合于抗原上的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率。

影響因素:①被標(biāo)記物不純，雜質(zhì)也被放射性核素標(biāo)記；②標(biāo)記后的分離純化不完全；③標(biāo)記化合物貯存過程中的碘脫落。一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第8頁,共36頁，2024年2月25日，星期天1、7個(gè)基本概念⑺免疫活性：指標(biāo)記抗原結(jié)合于抗體的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率。以檢查標(biāo)記后免疫活性損失情況。一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第9頁,共36頁，2024年2月25日，星期天2、常用的放射性核素：放射性核素依據(jù)衰變方式分α、β、γ三種，用于放射性標(biāo)記的有β和γ兩類;分別用液體閃爍計(jì)數(shù)器及γ計(jì)數(shù)器測(cè)定。

β型：3H（最常用）、14C和32P。

γ型：125I（最常用）、131I、51Cr和60Co。一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第10頁,共36頁，2024年2月25日，星期天125I和3H標(biāo)記物特點(diǎn)比較125I標(biāo)記物3H標(biāo)記物標(biāo)記方法方法簡(jiǎn)便，易獲得高比放射性標(biāo)記物方法較難，不易獲得高比放射性標(biāo)記物對(duì)標(biāo)記化合物影響標(biāo)記時(shí)以I代替H1改變物質(zhì)結(jié)構(gòu)，可影響抗原免疫學(xué)活性不改變抗原結(jié)構(gòu)，一般不影響抗原免疫活性測(cè)量方法方法簡(jiǎn)便、效率高方法復(fù)雜，效率低測(cè)量?jī)x器γ計(jì)數(shù)器液體閃爍計(jì)數(shù)器半衰期60.2天約11年廢棄物處理容易較難第11頁,共36頁，2024年2月25日，星期天3、放射性核素選擇原則高比活度、適宜半衰期、對(duì)抗原或抗體沒損害、容易標(biāo)記。4、放射性標(biāo)記的抗原或抗體的要求純度高、靈敏、有足夠或完整的免疫活性、高親和常數(shù)、特異性強(qiáng)、交叉反應(yīng)率低。一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第12頁,共36頁，2024年2月25日，星期天5、制備放射性核素標(biāo)記物⑴直接標(biāo)記法將125I直接結(jié)合在蛋白質(zhì)側(cè)鏈的酪氨酸殘基苯環(huán)上，形成單碘酪氨酸或雙碘酪氨酸。操作簡(jiǎn)便，結(jié)合效率高，但只能標(biāo)記含酪氨酸的化合物，有時(shí)可能會(huì)損害蛋白質(zhì)的活性。⑵間接標(biāo)記法先將放射性碘連接到一個(gè)小分子載體上，再將這個(gè)小分子載體與蛋白質(zhì)結(jié)合。一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第13頁,共36頁，2024年2月25日，星期天6、放射性標(biāo)記物的純化可用葡聚糖凝膠過濾法或薄層層析法、紙層析法、電泳法、高效液相層析法等。

理想的放射性標(biāo)記物：高放射化學(xué)純度適當(dāng)?shù)谋确派湫愿叩拿庖呋钚浴Ｒ?、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第14頁,共36頁，2024年2月25日，星期天7、理想的分離技術(shù)①簡(jiǎn)便易行，適于大批量樣品分析;②分離效果完全、快速，非特異結(jié)合低;③試劑來源容易、價(jià)格低廉、穩(wěn)定性好、可長(zhǎng)期保存;④不受外界因素和樣品中其他組分的干擾，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)抗原分離效果相同;⑤適合自動(dòng)化分析的要求。

一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第15頁,共36頁，2024年2月25日，星期天8、免疫復(fù)合物分離常用方法⑴.吸附法

用吸附劑(如活性炭)吸附小分子的游離。⑵.化學(xué)沉淀法RIA反應(yīng)條件接近抗體的等電點(diǎn)，加入聚乙二醇(PEG)等蛋白質(zhì)沉淀劑可破壞蛋白分子表面的水化層而使蛋白沉淀，從而分離B與F。⑶.雙抗體法

利用抗抗體和※Ag-Ab復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成更大免疫復(fù)合物，離心沉淀即可分離B與F。⑷.PR試劑

將雙抗體法和PEG結(jié)合起來的沉淀法，可彌補(bǔ)各自的不足，分離效果好，適用范圍廣。⑸.固相分離法

將抗體或抗原結(jié)合在固相載體（如磁顆粒、聚苯烯管子或珠等）上，利用固相抗體或抗原分離B和F，具有簡(jiǎn)便、快速、適合于自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，已逐步取代傳統(tǒng)的液相分離方法。一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第16頁,共36頁，2024年2月25日，星期天9、核射線探測(cè)儀器的探測(cè)原理

核射線探測(cè)器是個(gè)能量轉(zhuǎn)化器，其檢測(cè)原理是當(dāng)射線作用于閃爍體，閃爍體吸收了射線的能量而引起閃爍體中的原子或分子激發(fā)，當(dāng)受激的原子或分子退激時(shí)，則發(fā)出光子進(jìn)入光電倍增管光陰極，轉(zhuǎn)換為光電子，光電子在光電倍增管電場(chǎng)作用下到達(dá)陽極，形成電脈沖。

轉(zhuǎn)換模式：放射能→光能→電能→脈沖。一、放射免疫檢測(cè)技術(shù)的基本原理第17頁,共36頁，2024年2月25日，星期天二、放射免疫分析（RIA）1、基本原理抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，即待測(cè)抗原(Ag)和定量的標(biāo)記抗原(※Ag)與限量的抗體(Ab)進(jìn)行特異性反應(yīng)，其中Ab的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)小于Ag＋※Ag的結(jié)合位點(diǎn)總數(shù)，則Ag和※Ag與Ab發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。如待測(cè)Ag含量多，則Ag-Ab復(fù)合物形成得多，※Ag-Ab復(fù)合物(B)形成少，游離的※Ag（F）多，反之亦然。第18頁,共36頁，2024年2月25日，星期天二、放射免疫分析（RIA）第19頁,共36頁，2024年2月25日，星期天2、分類根據(jù)加樣順序不同，RIA可分為2個(gè)類型：①平衡法

將Ag和※Ag同時(shí)與Ab反應(yīng)，達(dá)到平衡后分離※Ag-Ab和※Ag，方法穩(wěn)定，但敏感度稍差；②順序飽和法

先將待測(cè)Ag與Ab充分反應(yīng)，達(dá)平衡后再加入※Ag，敏感度提高，穩(wěn)定性不如平衡法。二、放射免疫分析（RIA）第20頁,共36頁，2024年2月25日，星期天3、數(shù)據(jù)處理⑴根據(jù)放射性核素的類型分別選用液體閃爍計(jì)數(shù)儀（β型）和γ計(jì)數(shù)儀（γ型），測(cè)定各待測(cè)標(biāo)本和備抗原標(biāo)準(zhǔn)品的※Ag-Ab放射性強(qiáng)度(B)或游離※Ag放射性強(qiáng)度(F)。⑵制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，縱坐標(biāo)為放射性反應(yīng)參數(shù)，有各種表示方式，可選用B/F、B/（B＋F）、F/B、B/B0（零標(biāo)準(zhǔn)管）等比值或B或F的cpm（脈沖）值，常選用B/B0比值作為參數(shù)。橫坐標(biāo)為已知測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，以算術(shù)數(shù)或?qū)?shù)表示。放射免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線為雙曲線。⑶根據(jù)待測(cè)抗原管的放射性強(qiáng)度計(jì)算相應(yīng)反應(yīng)參數(shù)值，再從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查得待測(cè)抗原相應(yīng)含量。二、放射免疫分析（RIA）第21頁,共36頁，2024年2月25日，星期天RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的類型（1）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、計(jì)數(shù)（cpm）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（2）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、cpm為縱坐標(biāo)，曲線呈反S型；(3）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的算術(shù)數(shù)（或?qū)?shù)）為橫坐標(biāo)，F(xiàn)/B（或B0/B）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（4）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，logitB/B0為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為從左到右的漸降直線。第22頁,共36頁，2024年2月25日，星期天4、方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)

①敏感度高，能測(cè)到μg/L，甚至可測(cè)到ng/L或pg/水平；②特異性強(qiáng)，與結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)間的交叉反應(yīng)少；③準(zhǔn)確性好，重復(fù)性好，批間批內(nèi)誤差低；④用血量少。缺點(diǎn)①有放射性核素對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室污染；②放射性核素易衰變以及放射性標(biāo)記物不穩(wěn)定，導(dǎo)致試劑有效期短。二、放射免疫分析（RIA）第23頁,共36頁，2024年2月25日，星期天三、免疫放射分析（IRMA）1、原理屬于非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)。是將放射性同位素標(biāo)記在抗體上，用過量的標(biāo)記抗體(Ab)與待測(cè)抗原反應(yīng)，反應(yīng)式為Ag+※Ab=Ag-※Ab+※Ab。待充分反應(yīng)后，除去游離的標(biāo)記抗體，Ag-※Ab結(jié)合物的放射性強(qiáng)度與待測(cè)抗原量呈正比關(guān)系，即待測(cè)抗原含量越多，則復(fù)合物的計(jì)數(shù)率就越高，反之則越低。第24頁,共36頁，2024年2月25日，星期天2、技術(shù)路線抗體包被反應(yīng)管—→待測(cè)抗原—→過量的標(biāo)記抗體—→抗原抗體反應(yīng)（溫育）—→平衡—→分離Ag-※Ab+※Ab—→放射性強(qiáng)度測(cè)定—→繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線—→計(jì)算待測(cè)抗原量三、免疫放射分析（IRMA）第25頁,共36頁，2024年2月25日，星期天3、方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)

敏感性高特異性高標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記容易。結(jié)果穩(wěn)定缺點(diǎn)

IRMA抗體用量偏多抗體的特異性純化較難（如用單克隆抗體可克服這些缺點(diǎn)）。三、免疫放射分析（IRMA）第26頁,共36頁，2024年2月25日，星期天四、RIA與IRMA的比較

放射免疫分析（RIA）是放射免疫技術(shù)最經(jīng)典的模式。它是以放射性核素標(biāo)記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體為基本原理來測(cè)定待檢樣品中抗原量的一種分析方法。

免疫放射分析（IRMA）是用放射性核素標(biāo)記的過量抗體與待檢測(cè)抗原直接結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫分析。第27頁,共36頁，2024年2月25日，星期天二者的異同點(diǎn)如下：

①標(biāo)記物RIA以放射性核素標(biāo)記抗原；IRMA則是標(biāo)記抗體。②反應(yīng)速率IRMA反應(yīng)速度比RIA快。③反應(yīng)原理RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制性結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待檢抗原量成反相關(guān)；IRMA為非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待檢抗原成正相關(guān)。④特異性IRMA特異性較RIA高。⑤靈敏度和檢測(cè)范圍IRMA測(cè)定的靈敏度明顯高于RIA，IRMA標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍較RIA寬1~2個(gè)數(shù)量級(jí)。⑥其他RIA所用抗體為多克隆抗體，對(duì)親和力和特異性要求較高，但用量很少；IRMA為試劑過量的反應(yīng)，對(duì)抗體親和力的要求不及RIA，但用量大。此外，RIA可以測(cè)量半抗原，但I(xiàn)RMA只能測(cè)定至少有兩個(gè)以上表位的抗原。四、RIA與IRMA的比較第28頁,共36頁，2024年2月25日，星期天五、放射免疫分析中造成測(cè)量誤差的因素

誤差包括系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差。系統(tǒng)誤差發(fā)生在測(cè)量過程中由于儀器不準(zhǔn)、試劑不純、標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定等原因，使測(cè)定結(jié)果呈傾向性偏大或偏小，這種誤差應(yīng)力求避免。隨機(jī)誤差是測(cè)量過程中各種偶然因素造成的，沒有固定的傾向性，這類誤差是不可避免的，必要時(shí)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。造成誤差的可能來源有以下幾個(gè)方面：

1．各種儀器：設(shè)備的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、效率以及被污染等情況帶來的誤差。如：①由于放射性測(cè)量?jī)x器的穩(wěn)定性、效率、樣品試管的材料和均勻性及被測(cè)物的放射性強(qiáng)度等原因。②由于樣品的自吸收，本底校正，測(cè)定時(shí)間，可能的污染等原因。③在試驗(yàn)室中所有的移液管、微量取樣器以及天平的刻度、校準(zhǔn)和使用方法等原因。④由于反應(yīng)試管、移液管以及測(cè)定用試管等表面清潔度和所引起的不同吸附等原因都可以對(duì)測(cè)定結(jié)果帶來誤差。

2．試劑的純度、質(zhì)量和穩(wěn)定性的影響也是造成誤差的重要因素。如標(biāo)記抗原的比度、純度，輻射自分解，抗體的穩(wěn)定性，分離劑、阻斷劑及緩沖液等試劑的純度等。第29頁,共36頁，2024年2月25日，星期天3．在放射免疫分析中一些基本操作，如取樣、提取、沉淀、分離以及保溫條件不適當(dāng)?shù)仍斐傻恼`差。由于工作人員熟練程度不同也常常帶來誤差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹氣與不吹氣等。工作人員草率、不按規(guī)程操作等也都可以造成誤差。4．樣品誤差。樣品的收集方法、貯存溫度、放置條件，微量樣品取樣的準(zhǔn)確度，樣品可能造成的污染以及樣品的變性（如免疫反應(yīng)活性的降低、蛋白質(zhì)的變性等）也都能造成測(cè)量的誤差。5．提取及層析分離過程中的丟失。五、放射免疫分析中造成測(cè)量誤差的因素

第30頁,共36頁，2024年2月25日，星期天六、核廢物的處理放射性廢物中的放射性物質(zhì)，采用一般的物理、化學(xué)及生物學(xué)的方法都不能將其消滅或破壞，只有通過放射性核素的自身衰變才能使放射性衰減到一定的水平。而許多放射性元素的半衰期十分長(zhǎng)，并且衰變的產(chǎn)物又是新的放射性元素，所以放射性廢物與其它廢物相比在處理和處置上有許多不同之處。第31頁,共36頁，2024年2月25日，星期天

1、放射性廢水的處理

放射性廢水的處理方法主要有稀釋排放法、放置衰變法、混凝沉降法、離子變換法、蒸發(fā)法、瀝青固化法、水泥固化法、塑料固化法以及玻璃固化法等。

2、放射性廢氣的處理

(1)鈾礦開采過程中所產(chǎn)生廢氣、粉塵，一般可通過改善操作條件和通風(fēng)系統(tǒng)得到解決。(2)實(shí)驗(yàn)室廢氣，通常是進(jìn)行預(yù)過濾，然后通過高效過濾后再排出。(3)燃料后處理過程的廢氣，大部分是放射性碘和一些惰性氣體。

3、放射性固體廢物的處理和處置

放射性固體廢物主要是被放射性物質(zhì)污染而不能再用的各種物體(1)焚燒(2)壓縮(3)去污(4)包裝六、核廢物的處理第32頁,共36頁，2024年2月25日，星期天

七、在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用1.激素的測(cè)定

RIA可用于大多數(shù)激素的測(cè)定