常規(guī)病理檢查重點(diǎn)

1、常規(guī)組織病理學(xué)技術(shù),固 定,取 材,脫水，透明，浸蠟,包 埋,切片,鏡下觀察，診斷,常規(guī)病理學(xué)技術(shù)（病理工作流程,快速冰凍,取材,常規(guī)組織處理,OCT包埋,細(xì)胞學(xué)檢查,取材,染色,固定,組織固定,目的： 保持組織和細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，防止因?yàn)槊富钚曰蛭⑸锒菇M織壞死，自溶及腐敗。 保持組織和細(xì)胞中可溶性成分不被溶解。 減少蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等細(xì)胞成分丟失。 維持細(xì)胞膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整,組織固定,目的： 使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來，產(chǎn)生不同的折射率，造成光學(xué)上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。 固定劑兼有硬化作用，使組織硬化增加組織硬度，便于制片。 防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而

2、失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。 經(jīng)過固定的組織，能對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辯認(rèn),組織固定,固定的機(jī)制和原理有很多種，包括: 反應(yīng)基團(tuán)間的共價(jià)結(jié)合 交聯(lián)的共價(jià)結(jié)合 脫水與酸性物質(zhì)作用 鹽的形成和熱能 共同作用,組織固定,理想的固定劑： 保留蛋白，mRNA以及DNA的生化特征。 支持組織化學(xué)染色，免疫組化，原位雜交和各種其他技術(shù)。 能快速滲透和固定組織。 適合各種不同的組織和不同大小標(biāo)本的固定。 固定劑易于回收和處理，價(jià)格合理。 無毒，無害，無可燃性,組織固定,固定劑的種類： 1、按照化學(xué)性質(zhì)分類 類：醛類：甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。 類：氧化劑類：四氧化鋨（奧酸），高

3、錳酸鉀，重鉻酸鉀等。 類：蛋白變性類：甲醇，乙醇，醋酸等 類：其他：氯化汞，苦味酸等 。 2、按照成分分類： 單一固定液：如甲醛，酒精，醋酸，鋨酸，丙酮等 混合固定液：中性甲醛，AF液等,組織固定,常用的固定方法 蒸汽固定法：甲醛或鋨酸可產(chǎn)生蒸汽。用于保存可溶性成分；小而薄的組織，冷凍干燥組織 灌注固定法：肺，腎臟，肝臟等 細(xì)胞涂片的固定：浸入法和滴加法，浸入法應(yīng)注意相互污染的問題 微波固定法：微波加熱可縮短固定時(shí)間，但時(shí)間和溫度掌握困難,常用固定液介紹,甲醛（分子式:HCHO）固定: 純甲醛是一種蒸汽 溶于水后成為37%40%的甲醛溶液（又稱福爾馬林溶液） 固定液為10%的中性福爾馬林（即約

4、含4%W/V的甲醛溶液） 甲醛在水溶液中形成HOCH2OH（亞甲基氫氧化合物）復(fù)合物,甲醛（分子式:HCHO）固定: 甲醛的亞甲基氫氧化合物能與蛋白質(zhì)末端多種不同的功能基團(tuán)結(jié)合，使蛋白多肽分子間形成橋鍵，使蛋白質(zhì)不再發(fā)生改變，保存原位。,甲醛（分子式:HCHO）固定的優(yōu)點(diǎn): 組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好 固定均勻，穿透性強(qiáng) 組織收縮少 增加組織硬度，便于切片 價(jià)格便宜,甲醛（分子式:HCHO）固定的缺點(diǎn): 封閉抗原決定簇： 醛基與抗原蛋白氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的空間構(gòu)象發(fā)生改變，可能部分和完全遮蓋抗原決定簇，使之不能完全暴露，導(dǎo)致免疫組織化學(xué)染色產(chǎn)生假陰性。 處理措施： 固定后能夠充分水洗，可

5、減少分子間交聯(lián)。 抗原修復(fù)還可使抗原再現(xiàn)。 縮短固定時(shí)間(824小時(shí))，降低固定溫度(4)可減少交聯(lián),甲醛（分子式:HCHO）固定的缺點(diǎn): 甲醛內(nèi)雜質(zhì)含量多，影響酶染色 含甲酸，固定液酸化，影響染色 產(chǎn)生甲醛顆粒，影響觀察，尤以多血的肝，脾組織常見 易揮發(fā)，污染環(huán)境,10%中性緩沖福爾馬林固定液： 100ml40%福爾馬林 900ml蒸餾水 NaH2PO4 4g Na2HPO4 6.5g 最常用的固定液，抗原保存好，合適免疫組化染色,常用甲醛固定液,優(yōu)點(diǎn)：-保存組織中易溶于水的物質(zhì)，如尿酸結(jié)晶和糖原-常與其他試劑配制成多種混合固定液：加快固定時(shí)兼有脫水的作用缺點(diǎn)：-可溶解脂類物質(zhì)，要求保留脂類

6、物質(zhì)時(shí)不能使用酒精-對(duì)組織收縮較大，單純酒精固定組織收縮明顯，變硬變脆，制片困難-滲透力差，組織表面已固定，組織中間固定不佳-沉淀核蛋白，球蛋白，白蛋白，影響核染色-價(jià)格貴,乙醇（alcohol）固定,醋酸（cetic acid）固定-對(duì)染色質(zhì)固定較好。-對(duì)脂肪、糖元不能固定。- 能使組織膨脹，可抵償因乙醇、升汞、甲醛等固定液引起的組織收縮和硬化，故常配成5%混合固定液。- 穿透速度最快，固定時(shí)間短。- 5醋酸的p值在28，此時(shí)可停止細(xì)菌和酶的活動(dòng)，可防止組織自溶變性,能沉淀蛋白質(zhì)，它不能固定脂肪、類脂和糖類。-穿透力較弱，單獨(dú)使用可使組織收縮。多與醋酸和鉻鹽（重鉻酸鉀）配成混合固定液。-固定

7、后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，特別是核的細(xì)微結(jié)構(gòu)顯示清晰。-易產(chǎn)生汞鹽的沉著，損害切片刀，因此染色前必須脫汞,氯化汞（ercury bichloride,能沉淀蛋白質(zhì)，但對(duì)脂肪和類脂無固定作用。-穿透力很慢，細(xì)胞收縮顯著，但不會(huì)使組織硬化。-有軟化皮膚的作用，配制的Bouin氏液對(duì)頭皮及全身皮膚制片效果甚好。-固定時(shí)間太久會(huì)影響HE染色。-糖元較好的固定劑,苦味酸（icric acid,可以作固定劑，又可作脫水劑，穿透速度快，可使蛋白質(zhì)沉淀凝固，2毫米以下的組織固定半小時(shí)至1小時(shí)即可。-可引起組織較強(qiáng)的收縮使之變硬，對(duì)核固定不佳。-對(duì)某些酶的固定很好，如堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等。-一般多與氯化汞、甲醛混合液使

8、用，先用低濃度丙酮再經(jīng)高濃度丙酮固定以減少組織收縮和過度硬化,丙酮,強(qiáng)氧化劑，不能與酒精等還原劑混合，常配成0.5%水溶液固定組織。-單獨(dú)固定組織不能沉淀蛋白質(zhì)，但加入冰醋酸轉(zhuǎn)變?yōu)殂t酸，（即酸化重鉻酸鉀），可使蛋白質(zhì)凝固沉淀。-與甲醛混合是固定線粒體、高爾基復(fù)合體和嗜鉻細(xì)胞等優(yōu)良固定劑，若配成Eenker氏液，能很好的固定細(xì)胞質(zhì)、胞核及染色體。-穿透速度快，組織收縮小，固定的組織必須流水充分洗滌（612h），否則影響染色。對(duì)酸性染料染色良好，對(duì)堿性料染較差，若加入升汞及醋酸等，則對(duì)細(xì)胞核染色極佳,重鉻酸鉀,乙醇-甲醛液（AF液）配制：95%或無水乙醇90ml加入40%瓶裝甲醛10ml，常用固定

9、液。 兼有脫水作用，用于固定肥大細(xì)胞和糖元較好，米粒大小固定46h，大塊組織1224h，固定后不經(jīng)水洗，直接放入95%酒精開始脫水,enker氏液配制:重鉻酸鉀2.5g+升汞5g+蒸餾水100ml，加溫溶解，冷卻過濾，貯于棕色瓶內(nèi)，成為貯存液。用時(shí)取此液95ml再加入冰醋酸5ml即成。 enker氏液固定后，細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色較為清晰，特別顯示骨骼肌的橫紋 固定時(shí)間12-24h，然后沖洗24h，切片脫臘后需脫汞（浸入5%碘酒精10），脫碘（5%硫代硫酸鈉）流水洗,Bouin氏液配制：苦味酸飽和液75ml+甲醛25ml+冰醋酸5ml 此液滲透快，組織收縮小，固定均勻，為常用固定液。它對(duì)肝、皮膚、

10、胰臟特染效果好，但固定過久對(duì)堿性染料的著色有影響,Garnay氏液配制：純酒精60ml+氯仿30ml+醋酸10ml細(xì)胞極好的固定液，對(duì)淋巴組織及腺體固定很好，米粒大的組織固定12h，也適宜RNA、DNA及糖元的固定,Helly氏液配制：重鉻酸鉀25g+升汞50g+蒸餾水1000ml+甲醛50ml白細(xì)胞顆粒良好的固定劑，可用于造血器官，如骨髓，脾臟的固定,B5固定液配制：儲(chǔ)備液：氯化汞12g+醋酸鈉2.5g+蒸餾水200ml。使用前加2ml甲醛到20ml儲(chǔ)備液中常用于骨髓，淋巴結(jié)，脾和其他造血組織的固定,組織固定注意事項(xiàng),組織離體后盡早放入固定液中 固定液體的體積應(yīng)大于標(biāo)本的45倍，甚至20倍

11、固定的容器口要方便組織固定后取出 組織固定時(shí)間不宜太長，一般不超過72小時(shí)，固定不足和固定時(shí)間太久都可能影響染色，免疫組化等,組織取材,尸檢組織取材 外科切除標(biāo)本取材 活檢小組織取材,組織取材,要求： 取材組織厚度小于3mm，長度和寬度大約2cm為宜。 取材刀鋒利，避免組織損傷。 剔除標(biāo)本中的線頭，吻合釘。 有鈣化和骨化的組織要脫鈣。 保持取材臺(tái)的干凈，流水沖洗。 避免小標(biāo)本丟失，可用伊紅染料標(biāo)記。 腫瘤標(biāo)本取材應(yīng)注意相互關(guān)系。 核對(duì)標(biāo)本，以免張冠李戴,組織處理,1、脫水： 將組織內(nèi)的水分用某些化學(xué)試劑置換出來的過程稱脫水。 脫水是透明前必要的過程。所用試劑為能與透明劑相混溶的試劑。 常用脫水

12、劑有乙醇，正丁醇，丙酮。 脫水過程從低濃度到高濃度，時(shí)間一般為20min120min。高濃度乙醇中不能放置太久時(shí)間,尸檢及活檢：有條件時(shí)，將組織分別進(jìn)行脫水，因?yàn)椴煌M織脫水時(shí)間有差異。-動(dòng)物組織： 應(yīng)區(qū)分動(dòng)物大、小，如狗組織接近新生兒組織，大白鼠和小白鼠也有差異，前者需時(shí)稍長，后者則較短。-脫水時(shí)間與脫水劑的關(guān)系：脫水劑的新舊（純度）影響脫水時(shí)間，必須靈活掌握。-穿刺組織：如腎穿刺、活檢小組織，常規(guī)用擦鏡紙包裹，涂伊紅，以防丟失,1、脫水時(shí)的注意事項(xiàng),非石蠟溶劑的脫水劑：如乙醇和丙酮等，其組織在脫水后必須再經(jīng)二甲苯透明才能浸蠟。-脫水兼石蠟溶劑的脫水劑：如正丁醇等組織在脫水后即可直接浸蠟，不

13、經(jīng)過中間溶劑如二甲苯之類的試劑,脫水劑的種類和效果,組織處理,2、透明： 用化學(xué)試劑，通常為二甲苯將組織內(nèi)的脫水劑置換出來的過程稱透明。 透明發(fā)揮了一個(gè)橋梁作用，透明劑可以與包埋劑和脫水劑相溶。 常用透明劑有二甲苯，笨，三氯甲烷等。 一般置換23次透明劑，每次時(shí)間1540min。 透明劑易使組織變硬變脆，所以不能讓組織在透明劑內(nèi)放置時(shí)間太長,組織處理,3、浸蠟與包埋： 經(jīng)過前期處理的標(biāo)本，再置入支持物中，使支持物滲透入組織，并將組織埋入，包裹的過程。 常用支持物有石蠟，樹脂，碳蠟，明膠，火棉膠。 一般采用熔點(diǎn)為5658,經(jīng)三道溶化的石蠟浸漬后,透明劑被全部置換出來。浸蠟溫度高于蠟的熔點(diǎn)2 3,

14、石蠟：石蠟有高熔點(diǎn)和低熔點(diǎn)之分，一般普遍應(yīng)用熔點(diǎn)為56以上的石蠟。低熔點(diǎn)在54以下，用于酶的顯示和保存抗原活性。石蠟分軟蠟（5254），硬蠟（5658），蜂蠟60。一般氣溫用硬蠟，氣溫低時(shí)用軟蠟?；鹈弈z：碳蠟明膠,浸蠟劑的種類,組織處理,3、浸蠟與包埋： 將蠟液注入包埋的模具中，放好組織后，移至冷臺(tái)，使組織和蠟液凝固在一起的過程。 包埋應(yīng)注意組織的埋面，保持組織在一個(gè)平面上，間距合適，避免氣泡，包埋要迅速，防止組織與蠟分離,組織處理,手工處理 全封閉柜式自動(dòng)脫水機(jī)（室溫） 全封閉柜式自動(dòng)脫水機(jī)（加溫） 全封閉柜式自動(dòng)脫水機(jī)（真空負(fù)壓,全封閉柜式自動(dòng)脫水機(jī)（櫻花tissue-tek VIP6,常

15、規(guī)石蠟切片,多采用輪式切片機(jī)，一次性刀片 切片厚度為4um6um 展片水溫4248 注意清潔，避免污染 易脫片組織可用防脫片的涂膠載破片 防止切片裂痕，厚薄不均的現(xiàn)象,常規(guī)石蠟切片,防脫片的涂膠載破片 多聚賴氨酸：0.1%水溶液，使用時(shí)再1:10稀釋，涂片 3-氨丙基三已氧基硅烷（APES） 帶電荷玻片或陽玻片,冰凍切片,常用于術(shù)中快速病理診斷 組織不經(jīng)脫水，透明等步驟，對(duì)蛋白，脂肪，各種酶保存好，合適做組織化學(xué)，免疫組化等染色，尤其對(duì)不合適石蠟組織的抗體 組織會(huì)膨脹，細(xì)胞變大，出現(xiàn)與常規(guī)切片的一些差異,常規(guī)HE染色,染色的意義和目的： 用染液對(duì)組織切片進(jìn)行處理，使組織中的不同成分被染上相應(yīng)的

16、顏色，產(chǎn)生不同的折射率，以利于光鏡觀察和分析,常規(guī)HE染色,HE是蘇木素（haematoxylin）和伊紅（eosin）的縮寫 蘇木素是從蘇木素樹的樹心中提煉的天然堿性染料，蘇木素經(jīng)過氧化后變成蘇木紅，在媒染劑作用下形成藍(lán)色色精，對(duì)細(xì)胞核具有良好的染色能力 伊紅屬酸性染料，化學(xué)名稱四溴熒光素二鈉，分為水溶性和醇溶性兩種，常規(guī)HE使用的是水溶性伊紅,常規(guī)HE染色染色的原理,細(xì)胞核染色的原理：細(xì)胞核主要是DNA，帶負(fù)電荷，呈酸性，容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，蘇木素氧化呈蘇木紅，蘇木紅與媒染劑中金屬陽離子結(jié)合形成藍(lán)色色精，以離子鍵或氫鍵與核結(jié)合。 細(xì)胞質(zhì)的染色的原理：細(xì)胞質(zhì)主要是蛋白質(zhì)，為兩性化合

17、物，等電點(diǎn)為pH4.75.0。當(dāng)染液的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，伊紅是一種酸性染料，水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白的氨基正電荷結(jié)合而使細(xì)胞質(zhì)著色,常規(guī)HE染色染色步驟,1、脫蠟 二甲苯脫蠟10分鐘左右 二甲苯脫蠟5分鐘左右 無水酒精(乙醇)洗去二甲苯1分鐘 無水酒精(乙醇)洗去二甲苯1分鐘 95%酒精1分鐘 85%酒精1分鐘 自來水洗片刻,除去汞鹽沉淀物: 對(duì)于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片，切片脫臘后需脫汞（浸入5%碘酒精10），脫碘（5%硫代硫酸鈉）流水洗染色。除鉻沉著物: 有些組織用含鉻的enker氏液等固定，致有鉻沉淀物?？蓱?yīng)用鹽酸乙醇溶液，或用5%碘酒和5

18、%硫代硫酸鈉水溶液處理,常規(guī)HE染色染色步驟,脫甲醛色素: 甲醛固定組織時(shí)間較長及溫度較高情況下，甲醛易氧化自行分解產(chǎn)生甲酸，導(dǎo)致組織成酸性，此時(shí)可能有甲醛色素產(chǎn)生。此種色素?zé)o光澤，不溶于水，乙醇，二甲苯等。對(duì)于這種色素可用下列方法除去。 1 濃氨水1 ml，75%乙醇200 ml。切片脫蠟后置溶液中30 或較久流水洗染色。 2 1%氫氧化鉀1 ml，80%乙醇100 ml。切片脫蠟后置溶液中10 流水洗5 80%乙醇5 蒸餾水洗染色,常規(guī)HE染色染色步驟,常規(guī)HE染色染色步驟,2、染色 蘇木素染色15分鐘左右 自來水洗片刻 1%或0.5%或0.25%鹽酸水分化35秒鐘 自來水洗，溫水藍(lán)化片刻

19、 伊紅酒精染液浸染20秒2分鐘,常規(guī)HE染色染色步驟,3、脫水、透明、封固 85%的酒精脫水20秒 95%的酒精1分鐘 無水酒精染12分鐘 無水酒精染2分鐘 二甲苯浸2分鐘 二甲苯浸2分鐘 中性樹膠或加拿大樹膠封片,常規(guī)HE染色結(jié)果,細(xì)胞核呈藍(lán)色 鈣鹽和各種微生物呈藍(lán)色或紫藍(lán)色 細(xì)胞質(zhì)，肌纖維，纖維結(jié)締組織，紅細(xì)胞和伊紅色顆粒呈不同程度的紅色,常規(guī)HE染色質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),切片完整，厚度46um，厚薄均勻，無皺褶，無刀痕 細(xì)胞核，質(zhì)染色分明，紅藍(lán)適度，透明潔凈，封固美觀,細(xì)胞病理學(xué),細(xì)胞病理學(xué)（cytopathology）是通過觀察細(xì)胞類別，形態(tài)和性質(zhì)，協(xié)助臨床篩查，診斷和研究疾病的科學(xué)。是病理學(xué)得分支學(xué)科,細(xì)胞學(xué)檢查的材料來源,體腔抽出液體的脫落細(xì)胞 粘膜表面的脫落細(xì)胞 針吸細(xì)胞 內(nèi)鏡刷洗細(xì)胞 細(xì)胞印片 培養(yǎng)細(xì)胞爬片,細(xì)胞學(xué)檢查的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 方法簡單安全，受檢者痛苦小 設(shè)備簡單，標(biāo)本來源容易，可以反復(fù)獲取。 制片技術(shù)簡單，可以快速診斷 缺點(diǎn)： 存在假陽性好假陰性 無法分辨細(xì)胞結(jié)構(gòu) 無法明確細(xì)胞