煙草抗青枯、黑脛病益生菌劑研制與應(yīng)用

1、煙草抗青枯、黑脛病益生菌 劑研制與應(yīng)用 1.項(xiàng)目實(shí)施的背景 1.1 青枯病、黑脛病是煙草生產(chǎn)上的毀滅性病害。 湘西土樣中青枯菌含量較大，永州次之，郴州相對(duì)較少，土湘西土樣中青枯菌含量較大，永州次之，郴州相對(duì)較少，土 壤中青枯菌含量與青枯病發(fā)生的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，其中加青枯壤中青枯菌含量與青枯病發(fā)生的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，其中加青枯 菌拮抗菌肥土壤中的含菌量明顯少于未加菌肥土壤菌拮抗菌肥土壤中的含菌量明顯少于未加菌肥土壤 杜桂萍，周建國，煙草青枯病菌的田間快速檢測，湖南農(nóng)業(yè)杜桂萍，周建國，煙草青枯病菌的田間快速檢測，湖南農(nóng)業(yè) 大學(xué)學(xué)報(bào)大學(xué)學(xué)報(bào). 2010,36(2):192-195. 1.2 對(duì)青枯

2、病的防治尚無理想藥劑和抗病品種。 規(guī)模化發(fā)展、集約化經(jīng)營規(guī)?；l(fā)展、集約化經(jīng)營煙草連作煙草連作病原積累病原積累 病害發(fā)生造成損失病害發(fā)生造成損失易感品種易感品種 合成農(nóng)藥合成農(nóng)藥 的長期使的長期使 用用 l活性化合物積活性化合物積 累累 l農(nóng)藥殘留農(nóng)藥殘留 l非靶標(biāo)毒性非靶標(biāo)毒性 l病原菌耐藥性病原菌耐藥性 逐漸增強(qiáng)逐漸增強(qiáng) l煙草及其制品煙草及其制品 安全性安全性 煙草可持續(xù)發(fā)展受到影響煙草可持續(xù)發(fā)展受到影響 1.3 化學(xué)農(nóng)藥使用的長期影響。 1.4 湖南省郴州市煙草種植面臨的主要問題。 n目前最突出的問題是根莖病害和葉部病害；目前最突出的問題是根莖病害和葉部病害； n根莖病害發(fā)生規(guī)律復(fù)雜、

3、危害嚴(yán)重、難以控制。根莖病害發(fā)生規(guī)律復(fù)雜、危害嚴(yán)重、難以控制。 n煙草青枯病和黑脛病是煙草的系統(tǒng)性、突發(fā)性和流行性病煙草青枯病和黑脛病是煙草的系統(tǒng)性、突發(fā)性和流行性病 害，面積和危害程度都在擴(kuò)大，已經(jīng)成為制約我省郴州市害，面積和危害程度都在擴(kuò)大，已經(jīng)成為制約我省郴州市 煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要的因素。煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要的因素。 文獻(xiàn)檢索后發(fā)現(xiàn) 有關(guān)煙草青枯病害的報(bào)道有有關(guān)煙草青枯病害的報(bào)道有162篇論文篇論文 王巖等以硫酸慶大霉素為誘變劑，通過濃度梯度平板法篩選出拮抗效 果與T5菌株類似的抗性突變菌株T5-1，該菌遺傳穩(wěn)定性較好。以牛糞、 玉米秸稈為原料生產(chǎn)有機(jī)肥，當(dāng)堆溫達(dá)到50 以上后

4、保溫2周，然后 降溫至40時(shí)接入T5-1菌株，40 下培養(yǎng)3 d，可得到拮抗菌和嗜溫 菌濃度均為1012cfu/g (干基)的高密度堆肥產(chǎn)品。 大田試驗(yàn)結(jié)果表明，該有機(jī)肥對(duì)煙草青枯病具有一定的防治效果，第 一年有機(jī)肥施用量較小，效果不顯著；第二年連續(xù)施用有機(jī)肥且加大 施用量，抗病效果顯著增加，其中生物有機(jī)肥作基肥施用效果最好， 青枯病的發(fā)病率較對(duì)照降低了50.65 ，病情指數(shù)降低了71.09。 有關(guān)煙草黑脛病害的報(bào)道有有關(guān)煙草黑脛病害的報(bào)道有179篇論文。篇論文。 方敦煌等報(bào)道生防菌方敦煌等報(bào)道生防菌GP13不同施用時(shí)期防治效果表明，生防不同施用時(shí)期防治效果表明，生防 菌對(duì)煙草黑脛病的防治效果

5、在菌對(duì)煙草黑脛病的防治效果在40.1-90.5 ，3個(gè)時(shí)期個(gè)時(shí)期 以成活后施用，防治效果較好，移栽期效果稍差，假植期以成活后施用，防治效果較好，移栽期效果稍差，假植期 防效相對(duì)較差。防效相對(duì)較差。500倍生防菌菌劑的防效與對(duì)照藥劑相當(dāng)，倍生防菌菌劑的防效與對(duì)照藥劑相當(dāng)， 防效為防效為42.6-94.5。 未見通過直接對(duì)病原菌抗生素標(biāo)記，不經(jīng)未見通過直接對(duì)病原菌抗生素標(biāo)記，不經(jīng) 過平板拮抗，直接進(jìn)行土壤菌株對(duì)抗篩選過平板拮抗，直接進(jìn)行土壤菌株對(duì)抗篩選 的研究報(bào)道。的研究報(bào)道。 二、研究目標(biāo)和主要研究內(nèi)容 研究目標(biāo) 1. 通過室內(nèi)及大田試驗(yàn)，建立恰當(dāng)?shù)囊种坪诿劜　⑶嗫莶∫嫔鷦┖Y選方法， 篩選出2

6、0-35抑制土壤青枯病、黑脛病病源菌在煙田內(nèi)擴(kuò)繁的益生細(xì)菌、芽 孢桿菌。 2. 構(gòu)建抑制青枯病、黑脛病病源菌數(shù)量的益生菌庫，實(shí)現(xiàn)對(duì)根莖病害的多元 化控制。 3. 研究益生菌劑的生產(chǎn)、保存、使用的關(guān)鍵技術(shù)，對(duì)連作煙田的失衡微生物 系進(jìn)行原位修復(fù)； 4. 構(gòu)建青枯病和黑脛病的模式研究系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)根莖病害的可持續(xù)控制。 主要研究內(nèi)容 1 煙草根際、葉際優(yōu)勢微生物菌庫的建立。以桂陽代表性的植煙土壤為對(duì) 象，可培養(yǎng)方法在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)優(yōu)勢微生物進(jìn)行分離純化，構(gòu)建一個(gè)豐富的 根際優(yōu)勢微生物菌庫群，其目的是為構(gòu)建菌庫提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。 2. 實(shí)驗(yàn)室模擬并研究不同微生物在滅菌土壤中的定植能力，篩選出模擬大 田情

7、況下，在可變環(huán)境中定植能力均較好的微生物，從而構(gòu)建益生菌庫。 3. 研究菌劑種類和用量對(duì)不同病害發(fā)病情況降低程度，確定較為有效的田 間菌劑使用濃度，使用條件，與栽培技術(shù)的配套情況，評(píng)估菌劑的適應(yīng)能 力，為菌劑使用提供理論依據(jù)。 4.益生菌劑對(duì)土壤微生態(tài)的影響及抗病機(jī)理研究 （1）菌劑對(duì)土壤中有效N、P、K含量變化影響研究 （2）菌劑對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響研究 5.確定菌株的生產(chǎn)參數(shù) 研究菌劑規(guī)?；a(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)和技術(shù)參數(shù):以工業(yè)化生產(chǎn)為前提，研究 不同發(fā)酵工藝菌劑中活菌收獲率，降低生產(chǎn)成本，確定生產(chǎn)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵 技術(shù)參數(shù)，進(jìn)行中試生產(chǎn)研究，并對(duì)產(chǎn)品不同保存情況下菌劑活力進(jìn)行 研究，確定關(guān)鍵技術(shù)，

8、為菌株產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)銷售提供技術(shù)儲(chǔ)備。 三、技術(shù)關(guān)鍵與創(chuàng)新點(diǎn) 1、技術(shù)關(guān)鍵 （1）建立具有桂陽煙區(qū)土壤代表性的能夠在煙草根際、葉際定植且具有 降低病原微生物侵染能力的微生物菌庫，并從中篩選出具有田間使用效 果的菌株。 （2）大田實(shí)驗(yàn)中該菌株能夠在煙草根際、葉際與病原菌的生態(tài)位競爭中 占有優(yōu)勢，可以在大田中繁殖、持久性生存，穩(wěn)定，具有可持續(xù)性。 （3）確定菌劑的生產(chǎn)培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)，菌劑保存條件，如是固態(tài)菌劑，確 定填充劑成分，掌握不同環(huán)境條件下菌劑保存時(shí)間與菌劑活菌數(shù)的關(guān)系。 2、創(chuàng)新點(diǎn) 本項(xiàng)目從病原菌、寄主植物、發(fā)病土壤三要素出發(fā)，直接利用抗生素 標(biāo)記青枯病原菌、益生拮抗菌，基于生態(tài)位理論研究在土壤

9、中病原菌、 益生菌群的變化，及植株感病情況情況，構(gòu)建益生菌庫，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)煙 草病害的生物多元化控制方法； 四、研究方法與技術(shù)路線 1、主要的試驗(yàn)研究方法 （1）采集桂陽煙區(qū)煙草不同生長時(shí)期根際土壤、葉際樣品，調(diào)查煙草 根際微生物群落結(jié)構(gòu)，并分離純化煙草優(yōu)勢細(xì)菌。以桂陽煙區(qū)種植的煙 草植株為研究對(duì)象，不同生長階段，取煙草根際土壤、葉片，采用土壤 溶液培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)等方法，結(jié)合分子克隆 技術(shù)研究煙草根際、葉際微生物多樣性，分離代表性優(yōu)勢微生物。 （2）實(shí)驗(yàn)室煙草根際、葉際益生微生物菌庫的建立。 土壤優(yōu)勢細(xì)菌分別接種桂陽煙區(qū)代表性滅菌土壤，設(shè)置不同土壤溫度、 濕度、營養(yǎng)類型

10、，病害接種量等變化，篩選對(duì)病害微生物生長繁殖抑制 且不同情況下均表現(xiàn)較強(qiáng)定植能力的微生物，采用分子鑒定方法鑒定菌 種后構(gòu)建菌庫。 （3）盆栽試驗(yàn)選擇優(yōu)良菌株 在初步篩選的基礎(chǔ)上，縮小篩選范圍，并對(duì)篩選菌株進(jìn)行抗生素選擇 性標(biāo)記（選擇與出發(fā)菌株生長型一致的菌株），消毒煙苗栽培至桂陽煙 區(qū)代表性滅菌土壤，抗生素標(biāo)記菌株灌根或噴灑至葉際后，接種病原微 生物（青枯、黑脛等病菌），設(shè)置溫、濕度梯度、菌劑使用濃度等環(huán)境 變量，研究煙苗病情指數(shù)，表現(xiàn)優(yōu)良的作為菌劑備選。 （4）大田試驗(yàn)選擇菌劑配方 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室盆栽結(jié)果，多點(diǎn)選擇合適的煙田，跟蹤菌劑在煙草生長期 內(nèi)在根際、葉際的定植規(guī)律，研究對(duì)煙草品質(zhì)的影響。

11、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)較 好的菌劑作為生產(chǎn)備選。 （5）確定菌種生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)，開展中試研究，確定產(chǎn)品劑型、存放條件。 與企業(yè)合作，研究菌劑發(fā)酵生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)和技術(shù)參數(shù)，降低成本，以 工業(yè)化生產(chǎn)為前提，研究所選用基質(zhì)配方的規(guī)?；a(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)，并確 定生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的相應(yīng)技術(shù)參數(shù)，為功能生物有機(jī)肥的研發(fā)提供支撐。研 究液態(tài)、固態(tài)菌劑的保存方法及相應(yīng)保存時(shí)間，活菌或數(shù)量變化趨勢， 研究不同保存環(huán)境條件（光、溫度、pH、含水量等）對(duì)菌劑活力影響， 優(yōu)化得出適宜的生產(chǎn)、保存及運(yùn)輸條件。 （6）研究菌劑在土壤中遷移、繁殖規(guī)律，對(duì)土壤微生態(tài)的影響。 抗生素標(biāo)記菌劑分別對(duì)田間煙苗采用灌根等接種技術(shù)，研究在煙草根 際、葉際、維

12、管束定植規(guī)律，PCR-DGGE、克隆文庫技術(shù)、T-RFLP、 Biolog等技術(shù)研究菌劑對(duì)土壤微生物生態(tài)影響，闡明菌劑的施用對(duì)煙草土 傳病害病原菌的拮抗作用及抑制病原菌生長的機(jī)理。 2、技術(shù)路線 五、預(yù)期達(dá)到的目標(biāo) 1、成果形式 （1）構(gòu)建適應(yīng)桂陽煙區(qū)特點(diǎn)的益生微生物菌庫1個(gè)，菌庫容量高于20種 微生物。 （2）產(chǎn)品：田間證明有效，達(dá)到申請(qǐng)國家微生物肥料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的微生物 菌劑產(chǎn)品1-2個(gè)，并已通過中試生產(chǎn)。 （3）論文 2-4篇。 （4）專利 1-2項(xiàng)。 （5）施用項(xiàng)目研發(fā)的菌劑后，植煙土壤微生態(tài)改良、土傳病害降低，發(fā) 病指數(shù)比對(duì)照煙田病情指數(shù)降低20%。 2、經(jīng)濟(jì)指標(biāo)： 預(yù)計(jì)項(xiàng)目結(jié)束后，每畝

13、煙草施用菌劑10 公斤，按3元/公斤，每年推 廣20萬畝，控制生產(chǎn)成本不高于0.7元/公斤，此項(xiàng)目5年內(nèi)新增產(chǎn)值就達(dá) 300萬元之多，本項(xiàng)目生產(chǎn)菌劑在防治煙草青枯病、黑脛病的同時(shí)，具有 防治茄科作物土傳病害的潛力，通過在煙草栽培中的示范性應(yīng)用，將會(huì) 帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。 六、具體實(shí)施措施 1、建立項(xiàng)目組，以項(xiàng)目的形式實(shí)施 郴州市煙草科學(xué)研究所、河南工程學(xué)院資源與環(huán)境工程學(xué)院共同牽頭， 郴州市煙草公司桂陽縣分公司，三個(gè)單位根據(jù)各自特點(diǎn)具體組織實(shí)施。 2、在河南工程學(xué)院和重慶市煙草研究所建立菌種選育研究平臺(tái)，進(jìn)行 菌株選育和分析研究。 3、項(xiàng)目組將成立技術(shù)組，研發(fā)關(guān)鍵技術(shù)，引進(jìn)成熟經(jīng)驗(yàn)，制定祥盡的

14、 技術(shù)實(shí)施方案。 4、研究、試驗(yàn)、示范、培訓(xùn)、具體實(shí)施相結(jié)合。 七、項(xiàng)目開展的條件及已經(jīng)進(jìn)行的部分工作 （一）項(xiàng)目開展的條件 1、市、縣公司的大力支持，煙農(nóng)的迫切需要。 2、相關(guān)文獻(xiàn)得成功報(bào)道、已有的工作基礎(chǔ)可確保項(xiàng)目的可行性。 3、已經(jīng)組建了具有豐富經(jīng)驗(yàn)的7人工作團(tuán)隊(duì)，項(xiàng)目展開具有具有可靠的 硬件配備 4、已有相應(yīng)的菌劑中試廠家。 （二）已有的工作基礎(chǔ)： 1、項(xiàng)目申報(bào)單位湖南省煙草公司郴州市公司在從傳統(tǒng)煙葉生產(chǎn)向現(xiàn)代煙 草農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)變方面，做了許多有益的研究與探索，并取得良好成效，積累 了豐富的經(jīng)驗(yàn)。 。 2、郴州市公司與河南工程學(xué)院在2010就開展了針對(duì)桂陽縣旱田煙草青 枯病生物防治的科研工作，連續(xù)兩年從桂陽仁義石坡、桂陽樟市曹新橋 曹溪、桂陽樟市山背、桂陽仁義王泗煙草青枯病發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)取樣70個(gè)， 調(diào)查煙草青枯病發(fā)病株與未發(fā)病株、旱田與水田根際微生物群落種群均 一度、種群豐富度，種群類別等指標(biāo)，并進(jìn)行跟蹤、對(duì)比分析，兩年中 共分離出優(yōu)勢細(xì)菌60余株、芽孢桿菌87株，分離出煙草青枯病病原菌5 株。 項(xiàng)目組已從重慶市、湖北省恩施市煙田取樣，分離出優(yōu)勢細(xì)菌、芽胞桿菌上簽株。 項(xiàng)目組已開展綠色木霉、哈茨木霉等菌株與病原菌拮抗的相關(guān)研究。 已成功將分離出的煙草青枯病原菌進(jìn)行利福霉素、青霉