用ELISA試劑盒檢測(cè)人白介素4IL-4方法步驟

1、僅供個(gè)人參考IL-4簡(jiǎn)介：白介素4(IL-4)是一種多功能細(xì)胞因子，主要是由激活的T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。IL-4因?yàn)樘腔牟煌?，分子量?5到19kDs不等。IL-4可以對(duì)多種細(xì)胞起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)功能的作用。白細(xì)胞介素4參與多種B-細(xì)胞等此類細(xì)胞的激活過程，是DNA合成的協(xié)同刺激分子，它能誘導(dǎo)靜息B細(xì)胞上II型MHC主要組織相容復(fù)合體)分子的表達(dá)。能增強(qiáng)IgE與lgG1的分泌以及在細(xì)胞表面的表達(dá)，還可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞上對(duì)IgE低親和Fc受體的表達(dá)。IL-4在抗體亞型轉(zhuǎn)換中也起到重要的調(diào)節(jié)作用，是 T輔助前體細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，從而間接調(diào)節(jié)體液免疫以及

2、抗體的生成。 此外，白細(xì)胞介素4基因在機(jī)體中的的遺傳變異可導(dǎo)致缺血性中風(fēng)易感性提高，腦血管意外或腦梗塞等疾病。檢測(cè)原理：For personal use only in study and research; not for commercial use本試劑盒采用雙抗體夾心ELI SA法檢測(cè)樣本中IL-4的濃度。IL-4捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本 或參考品時(shí)，其中的IL-4會(huì)與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗人IL-4抗體后，抗人IL-4抗體與IL-4接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入 辣根過氧化物酶標(biāo)記的

3、親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會(huì)與夾心的免疫復(fù)合物連接起來(lái)； 其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在IL-4將會(huì)形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會(huì)催化無(wú)色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀其450nm處的ODt, IL-4濃度與OD50值之間呈正比，通過參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照未知樣本中0D值即可算岀標(biāo)本中IL-4濃度。標(biāo)本收集：1. 標(biāo)本的收集請(qǐng)按下列流程進(jìn)行操作：A. 細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；B. 血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；C. 血漿標(biāo)本，推薦用EDTA勺方法收集；D. 若待測(cè)樣

4、本不能及時(shí)檢測(cè)，標(biāo)本收集后請(qǐng)分裝，凍存于-20 C，避免反復(fù)凍融。2. 血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；3. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測(cè)前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除；4. 請(qǐng)勿使用溶血，高血脂或污染的標(biāo)本檢測(cè)，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。注：正常人血清或血漿樣本請(qǐng)用標(biāo)本緩沖液做倍比稀釋后再檢測(cè)。注意事項(xiàng)：1. 試劑盒請(qǐng)保存在28Co2. 濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請(qǐng)水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。3. 若標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后，請(qǐng)?jiān)谌靸?nèi)用完。4. 底物請(qǐng)勿接觸氧化劑和金屬。5. 加樣時(shí)，請(qǐng)及時(shí)更換槍頭，避免交叉污染。6. 嚴(yán)禁混用不同批號(hào)的試劑盒組份。7. 充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)性很重要，在加

5、液后請(qǐng)輕輕叩擊邊緣以保證混勻。8. 室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在 2528 C。9. 洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會(huì)使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。10. 試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作雙復(fù)孔。11. 加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。12. 血清和血漿標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)抗體的孵育時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。檢測(cè)前準(zhǔn)備工作：1. 試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫平衡20分鐘；每次檢測(cè)后剩余試劑請(qǐng)及時(shí)于28 C保存。2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋（1份加19份水）。3. 標(biāo)準(zhǔn)品：加入去離子水0.25ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品瓶中使IL-4終濃度達(dá)到2000pg/ml，靜置15分鐘后輕輕混懸待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯

6、度稀釋后依次加入檢測(cè)孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個(gè)點(diǎn)，最高濃度為2000 pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）洗滌方法：自動(dòng)洗板機(jī)或人工洗板：每孔洗滌液為300卩l(xiāng)，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。實(shí)驗(yàn)過程需自備的材料：1. 不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；2.酶標(biāo)儀； 3自動(dòng)洗板機(jī)；4去離子水或雙蒸水；操作步驟：1. 通過計(jì)算并確定一次性實(shí)驗(yàn)所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時(shí)用不到板條請(qǐng)放回鋁箔袋密封，保 存于4 C。2. 建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實(shí)驗(yàn)均需做標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照并畫出標(biāo)

7、準(zhǔn)曲線。3. 分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（100ul/孔）加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。對(duì)于血清或血漿標(biāo)本，請(qǐng)加入50ul樣本分析緩沖液后加50ul標(biāo)本，如稀釋量大，請(qǐng)將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)充至100ul。4. 洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。5. 加入生物素化抗體工作液（100ul/孔）。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。6. 洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。7. 加入酶結(jié)合物工作液（100ul/孔）。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫孵育20分鐘。8. 洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。9. 加入顯色劑TMB10

8、0UI/孔，避光室溫孵育20分鐘。10. 加入終止液50ul/孔，混勻后即刻測(cè)量ON值。結(jié)果判斷：1. 復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測(cè)量值。2. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD直應(yīng)減去本底校正孔的OD直。3. 手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD直作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過標(biāo)本的OD直可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。4. 若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。不得用于商業(yè)用途僅供個(gè)人參考僅供個(gè)人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research;

9、not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwfeen verwendet werden.Pour l e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.to員bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ygoiccH6yHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 員 B30BaTbCEb KOMMepqeckux

10、qe 員 ex.For personal use only in study and research; not for commercial use以下無(wú)正文不得用于商業(yè)用途僅供個(gè)人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l e tude et la recherche uniquemen