天根DP117-無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書

1、天根DP1 1 7-無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書產(chǎn)品簡介本試劑盒采用獨特的硅膠模吸附技術(shù)，高效專一地結(jié)合質(zhì)粒DNA。同時采 用特殊的溶液P4和過濾器CS1,可有效的出去內(nèi)毒素、蛋口質(zhì)朵志；整個提取 過程僅需lh,方便快捷。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操 作，包括酶切、PCR、測序、連接、轉(zhuǎn)化和細胞轉(zhuǎn)染多種細胞等試驗。推薦每次菌液使用量：高拷貝質(zhì)粒推薦使用量為100ml,得率一般在500- 1500|ig左右；低拷貝質(zhì)粒推薦使用量為200ml,得率一般在200-600ng左右。 注意事項：請務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。1. 溶液P1在使用前先加入RNase A （將試劑

2、盒中提供的RNase A全部加入）， 混勻，置于2-8C保存。2. 第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標簽的說明先在漂洗液PW中加入無水乙醇。3. 使用前先檢查平衡液BL,溶液P2和P4是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶 或者沉淀現(xiàn)象，可在37C水浴中加熱兒分鐘，即可恢復(fù)澄清。4. 注意不要直接接觸溶液P2和P4,使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子。5. 使用過濾器時請將推柄小心緩慢地從過濾管中抽出，避免濾膜因壓力而松 動。6. 提取的質(zhì)粒量與細菌培養(yǎng)濃度，質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低 拷貝質(zhì)?；虼笥?0kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時按比例增加P1、 P2、P4的用量；洗脫緩沖液推薦在65-70C水浴中預(yù)

3、熱，可以適當(dāng)延長吸附 和洗脫時間，以提高提取效率。7. 實驗詢使用平衡液BL處理吸附柱，可以最大限度激活硅基質(zhì)膜，提高得 率。8. 用平衡液處理過的柱子最好立即使用，放置時間過長會影響使用效果。質(zhì)粒DNA濃度及純度檢測得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。 OD260值為1相當(dāng)于大約50ng/ml雙鏈DNA。純化的質(zhì)粒DNA OD260/OD280 通常在左右，可直接應(yīng)用于細胞轉(zhuǎn)染其至動物體內(nèi)實驗等對DNA純度要求很高 的實驗中。操作步驟：柱平衡步驟：向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集中）加入的平衡液5BL, 8000rpm （8228xg）離心2min,倒掉

4、收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。（用平衡液處理過的柱子最好立即使用）O2. 取100ml （根據(jù)培養(yǎng)菌體的濃度選擇合適的量，低拷貝推薦用200ml）過夜 培養(yǎng)的菌液加入離心管,室溫8000rpm （8228xg）離心3min收集菌液，盡 量吸除上清。注意：菌液較多時候可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中， 菌液量以能夠充分裂解為佳，菌液過多會導(dǎo)致裂解不充分從而降低質(zhì)粒的 提取效率。3. 盡量吸除上清，為確保上清液全部吸除，請用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水 滴。4向留有菌體沉淀的離心管中加入8ml溶液P1 （請檢査是否已加入 RNaseA）,使用移液器或渦旋振蕩器徹底裂解懸浮細菌

5、細胞沉淀。注意：請務(wù)必徹底懸浮細菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解 效果，導(dǎo)致提取量和純度偏低，對于低拷貝質(zhì)粒，加大菌體用量的同時按 比例增加Pl P2、P4的用量。5. 向離心管中加入8ml溶液P2,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)68次，室溫放置 5min。注意：溫和地混勻，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA。此時菌液應(yīng)變 得清亮粘稠，如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少 菌體量。6. 向離心管中加入8ml溶液P4,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)68次，充分混勻，至 溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置lOmin左右。SOOOrpm（8228xg）離心5-10min,使口色沉淀離至管底（可

6、適當(dāng)增加離心時，將全部溶液小心倒入過濾器CS1中（請避免倒入大量沉淀而阻塞過濾 器），慢慢推動推柄過濾，濾液收集在干凈的50ml的管中（自備）。注意：加入溶液P4后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果離心后倒入過 濾器CS1中的溶液有白色沉淀也不會影響過濾，如果菌體過多（100ml）,推 薦延長離心時間至20-30mino7. 向濾液中加入倍濾液體積的異丙醇（加入異丙醇過多容易導(dǎo)致RNA污 染），上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管 中）。注意：過濾后濾液會損失，根據(jù)損失的不同請加入不同體積的異丙醇，吸 附柱CP6的最大容積為15ml,所以需要分2次過柱。8. 室溫800

7、0rpm （8228xg）離心2min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP6 重新放回收集管中。注意：將第7步中所得溶液分2次過柱，每次均按以上條件操作。9. 向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW (請先檢査是否已加入無水乙醇), 8000rpm (8228xg)離心2min,棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回 收集會中。10. 重復(fù)操作步驟9。.向吸附柱CP6中加入3ml無水乙醇,8000rpm (8228xg)離心2min,倒掉 廢液。12. 將吸附柱CP6重新放回收集管中,8000rpm (8228xg)離心5min,目的是 將吸附柱中殘余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后

8、續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)實驗。 為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP6開蓋，置于室溫 放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附殘料中殘余的漂洗液。13. 將吸附柱CP6置于一個干凈的50ml收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴 加l2ml洗脫液TB,室溫放置5min,然后室溫8000rpm (8228xg)離心 2mino將50ml離心管中的洗脫液全部移入一個干凈的離心管，-20C保存。注意：為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中， 重復(fù)步驟13。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng) 保證其pH值在范圍內(nèi)，pH值低于會降低洗脫效率。洗脫緩沖液用量的多 少主要是根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及實驗所需要的濃度來確定。洗脫緩沖液體 積不少于lml,體積過小影響回收效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在20C,以防 DNA降解。可選步驟：(如果需要更好濃度的質(zhì)粒，可進行如下操作):14. 每lml洗脫液加入異丙醇以及5M NaCl (客戶自備)，混勻，室溫放置 5min